人羧酸酯酶1的生物发光探针底物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属医药生物技术领域，具体涉及一类一类人羧酸酯酶l(hCEl)的生物发光 探针底物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 作为脏器和组织的特征标志物，hCEl在人群的肝脏中含量很高，其蛋白表达量在 肝脏分布蛋白中排前十位。hCEl是一种膜结合蛋白，定位于细胞内质网中【CANCER RESEARCH 1998; 58:3627-32&Drug Metab ? Pharmacokinet ? 2006; 21:173-85】，同时也会分 泌到细胞外进入血液循环系统【Proteomics 2009;9:3989-99】ACE1的基本代谢反应是催 化含较小醇基和较大酰胺基底物的水解。虽然，在多种组织的中都检测到hCEl的蛋白表达， 但其在人肝脏组织含量远高于其它组织。hCEl参与多种外源性物质的代谢清除，例如药物 奥司他韦、哌醋甲酯等。同时，hCEl在维持人体正常生理功能功能发挥不可忽视的作用，参 与人体内胆固醇酯和游离脂肪酸的运输和代谢过程，维持脂质代谢平衡【Chemi Stry& Biology，Vol. 10，341-349，April ,2003】。在正常健康人体中，hCEl除了以较高的含量分布 在肝组织的细胞中，也有少量hCEl在血浆中被检测到，更重要的是，肝细胞肝癌患者血浆中 的hCEl是健康人群的2-5倍，因此hCEl被认为是肝细胞肝癌早期诊断的一种良好的潜在血 清学标志物【Proteomics 2009，9,3989-3999】。此外，肝细胞破损相关的肝脏疾病患者也会 有hCE 1释放入血，引起血浆中hCE 1浓度发生变化，因此，血浆中hCE 1可作为肝脏急性损伤的 标志物。hCEl的分布存在很大的个体差异，hCEl酶的表达和功能本身会受到人体遗传、年 龄、疾病、性别、环境和共服药物等多种因素的影响。因此，hCEl酶的活性检测方法具有广阔 的临床应用前景，可用于评价人体肝脏功能异常、药物及毒物导致的肝毒性、肝细胞癌早 期诊断、肝功能个体化评估、以及部分前体药物的个性化使用等。此外，hCEl作为维持人体 脂质代谢平衡的重要蛋白，其抑制剂可作为降血脂药物使用，hCEl也被FDA批准为重要的药 物作用靶点。hCEl活性的快速表征方法也可用于新药研发早期发现及评估hCEl新型高效抑 制剂。因此，开发尚效、超灵敏、尚特异性的hCEl活性检测方法对于临床样本中hCEl活性的 检测，以及新药高内涵高通量筛选至关重要。
[0003] 本发明提供了（S)-4,5_二氢_2_(苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸酯衍生物（简称 DBT-R)及其作为hCEl探针底物的应用，其经hCEl水解后可生成荧光素酶的底物(S)-4,5-二 氢-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸化合物(简称DBTC)，利用DBTC与荧光素酶反应产生生 物发光进行检测。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制剂活性评价快 速省时的特点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供人羧酸酯酶l(hCEl)的特异性生物发光探针反应及其定量 检测方法和应用，该类特异性探针的水解产物是荧光素酶的底物，易于检测。利用该探针反 应可对多种生物体系中的hCEl的分布和功能进行定量评价。
[0005] -类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物，该探针底物DBT-R可被hCEl特异性催化发 生酯键水解反应并生成相应的羧酸产物DBTC，该探针底物如图1，水解产物的结构如下：
[0007] 其中，R1 选自-NH2、-N(CH3) 2、-N(CH2CH3) 2、_N( CH2CH2CH3) 2、-NHCH3、-NHCH2CH3、-NHCH2CH2CH3、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH2CH2CH3; R2选自 H、C1-C3烷基、C1-C3 亚烷基氨基；R3选 自Cl-ClQ烷基、-(Cl_C8亚烷基）-氛基、-(Cl_C8亚烷基）-氛基、-(Cl_C8亚烷基）-硝基、-(Cl_C3 亚烷基)-0-(Ci-Cs烷基）、环烷基、-(&-C3亚烷基)-环烷基、芳基、-(&-C3亚烷基)-芳基、杂 芳基、-(&-C3亚烷基)-杂芳基、杂环基或-(&-C3亚烷基)-杂环基。
[0008] 所述DBTC是荧光素酶的底物，可采用生物发光检测器实现产物的快速灵敏检测， 所述生物发光检测器为发光分析仪、酶标仪、显微镜或小动物成像仪。
[0009] 本发明还提供了一类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的制备方法，其特征在于：
[0010] 将2-氰基苯并噻唑（1 .Oeq)和D-半胱氨酸（1 ? H .5eq)加入到甲醇/水的混合溶液 中，加入碳酸钾（1.1-1.5eq)，20-30°C搅拌反应1-3小时，生成(S)_4，5-二氢_2_(苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸化合物（简称DBTC)。所得产物DBCT(1. Oeq)在4-N，N-二甲基吡啶(0.1 -0.5eq)和1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺（1.1_1.5叫）的存在下与醇(1101?3)缩合反应， 20-30°C搅拌反应6-24小时生成（S)-4,5-二氢_2_(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物 (简称DBT-R)。
[0011]合成路线如下：
[0013]本发明还提供人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，该类底物可被hCEl特异 性识别并催化发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量即可测定不同生 物来源(组织、细胞、血浆)中的hCEl活性;具体测定方法为：
[0014] (1)预孵育:将待测样品在缓冲体系中，20~60度下孵育3~5分钟；
[0015] (2)起始反应:加入式（1)化合物混匀，20~60度下孵育2~120分钟；
[0016] (3)检测：加入荧光素酶检测试剂，混匀，37°C孵育20-30min;用酶标仪或化学发光 分析仪测定样品，检测波长620nm〇
[0017] ⑷测定单位时间内水解产物生成量作为hCEl活性的评价标准。
[0018] 本发明提供的一类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的的应用，所述水解反应体 系为PBS缓冲液，探针底物的浓度介于1/10~10K m之间，孵育体系pH介于5.5-10.5之间，反 应温度介于20_60°C之间，底物消除率或水解产物的生成率介于0.1 %~20%之间。
[0019] 所述不同生物来源为重组表达的hCEl、人或动物的细胞制备物、组织制备液、血浆 等常见生物样本。
[0020] -种人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，该探针用于人羧酸酯酶1抑制剂的 快速筛选与评估，方法为:按照探针的使用方法，通过定量比较抑制剂存在与缺失状态下单 位时间内水解产物的生成量评估该生物体系中hCEl的残余活性，进而实现hCEl抑制剂的快 速筛选及抑制能力的定量评价。
[0021] 本发明提供的一类人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，探针水解产物均为 荧光素酶的底物，可采用生物发光检测器实现底物的快速灵敏检测。
[0022] 本发明提供的人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的应用，该特异性探针底物及相 应hCEl活性检测过程不会受到生物体系基质及杂质的干扰，可用于重组表达的hCEl、人或 动物的细胞制备物、组织制备液、血浆等各种生物体系中hCEl酶活性的定量检测。
[0023] 本发明提供了人羧酸酯酶1的生物发光探针底物的的应用，该特异性探针底物用 于重组表达的hCEl、人或动物的细胞制备物、组织制备液、血浆等常见生物样本中酶活性 的定量测定，以及利用该探针反应快速筛选hCEl酶的抑制剂。
[0024] 本发明涉及的hCEl特异性探针反应具有如下优点：
[0025] 1.廉价易得：（S)-4,5_二氢_2_(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(简称DBT-R)可经化学合成获得，合成工艺简单易行。
[0026] 2 ?高特异性：（S)-4，5-二氢_2_(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(简称DBT- R)可被hCEl特异性代谢成一个代谢产物，即酯键断裂的水解产物，人体其余水解酶均不参 与该反应。
[0027] 3.高灵敏度:DBT-R可被hCEl快速水解释放出（S)-4,5-二氢_2_(苯并噻唑-2-基） 噻唑-4-甲酸衍生物(简称DBTC)，且产物为荧光素酶的底物，可利用生物发光检测器实现超 灵敏检测，其对目标物的检测下限可达纳摩尔级。
[0028] 4.易高通量检测：可在实验室常见各类荧光酶标仪及临床大生化仪上测定，可利 用96或386微孔板进行批量检测。
【附图说明】
[0029] 图l.(S)-4,5-二氢_2_(苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸酯衍生物(简称DBT-R)结构 通式；
[0030] 图2.(S)-4,5-二氢-2-(6-二甲氨基苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸甲酯合成路线；
[0031] 图3. (S)-4,5-二氢-2-(6-二甲氨基苯并噻唑-2-基）噻唑-4-甲酸甲酯1H-匪R谱 图；
[0032] 图4.(S)-4,5-二氢-2-(6-二甲氨基苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸甲酯的选择性；
[0033] 图5.hCEl的定量标准曲线；
[0034] 图6.hCEl的活性化学抑制实验
[0035] 图7.不同组织微粒体中hCEl的活性定量评估
【具体实施方式】
[0036] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。（S)_4， 5-二氢-2-(苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸酯衍生物(简称DBT-R)结构通式如图1所示。
[0037] 实施例l.(S)-4,5_二氢-2-(6_二甲氨基苯并噻唑-2-基)噻唑-4-甲酸甲酯的合成
[0038]合成路线如图2所示。
[0039] (1)化合物2的合成
[0040] 室温，将化合物1 (18.2g，107.3mmol，1. Oeq)加入浓硫酸溶液中（90mL)，搅拌溶解。 将反应体系冷却到〇_5°C，将硝酸钾（11.9g，118.0mmol，1. leq)分批10次加入到上述反应体 系中。加完室温反应，薄板层析(TLC)监测反应进程。反应完毕后将反应体系倾入冰水中 (250mL)，抽滤得粗产物经乙酸乙酯重结晶得黄色固体，产率80-90%，ESI-MS m/z 215.0[M +H] +
[00411 (2)化合物3的合成
[0042] 室温，将化合物2(6.0g，27.95mmol，1 .Oeq)和二氯化锡一水合物（18.9g， 83.85臟〇1，3.0叫)加入乙醇溶液中（80111〇，将体系升温回流反应，薄板层析(11〇监测反应 进程。反应完毕后，蒸除溶剂，加水（20mL)，1N NaOH调pH = 7-8，过滤，滤液乙酸乙酯萃取 (50mLX3)，合并有机相饱和氯化钠溶液洗(20mLXl)、无水硫酸钠干燥。蒸除溶剂，粗产物 柱层析(石油醚/乙酸乙酯=3/1)得化合物3，黄色固体，产率40-50%351-1^111/2 185.0[1 +H].。
[0043] (3)化合物4的合成
[0044]室温，将化合物3(92 ? 3mg，0 ? 5mmol，1 .Oeq)和氰化钠（49. Omg, lmmol，2eq)加入二 甲基亚砜(5mL)中，加热130°C反应，薄板层析(TLC)监测反应进程。反应完毕后，冷却到室 温，加