一类检测甲醛的荧光探针及其制备和应用的制作方法

本发明属环境分析化学及生物检测领域，涉及一类检测甲醛的荧光探针、其制备方法及在检测环境中及生物样本中甲醛含量中的应用。

背景技术：

甲醛是一种无色气体，有特殊的刺激气味，对人眼、鼻等有刺激作用。环境中高浓度的甲醛对人体有致敏、致畸和致癌等毒性，甲醛因而在2006年被确定为1类致癌物。因此，检测环境中，尤其是家具、新装修空间、新衣物材料、甚至食品中的甲醛含量是一项重要且有实际意义的工作。

环境中高浓度甲醛的毒性作用在国内外已被深入研究。然而与之相反的是，近年来人们发现人体几乎所有细胞中均存在内源性甲醛！以大脑组织为例，研究发现，大脑组织中的生理内源性甲醛处于较高水平，其中皮层组织中甲醛浓度为0.2mmol/L左右，海马组织为0.4mmol/L左右，提示其可能参与到大脑正常的生理活动中；而大脑细胞中内源性甲醛的异常聚集可在醛酮应激、氧化应激等各种诱导因素的作用下，造成神经细胞功能障碍、变性死亡，导致学习、记忆功能障碍。目前，由于缺乏甲醛在生物原位环境中准确、简便定量分析的检测方法，甲醛的生理性和病理性作用研究受到极大限制。如何简便易行地检测和评估内源性甲醛的浓度水平和组织分布特征，对于预测和评估相关疾病的进展和程度，有着重要的临床意义。然而，常规的检测方法如分光光度法、色谱分析法等在医学和生命科学领域的应用存在诸多限制，如检测灵敏度较差，难以实现活细胞或活体组织中甲醛的实时在线检测等，这使得甲醛在活体生物样本中的生理及病理作用研究受到限制。因此，开发适用于复杂活体生物样本的灵敏度高、选择性好的甲醛快速分析检测方法对研究内源性甲醛的生理病理作用具有重要的意义。

小分子荧光探针是检测细胞内分子事件的高效工具之一。小分子荧光探针检测法具有灵敏度高，选择性好等优点，兼之小分子探针通常具有良好的生物膜通透性，且可通过调整结构优化其在生物体内的吸收代谢性质，因此更适用于活细胞/活组织中微量代谢分子的检测。目前仅有少量用于甲醛检测的荧光探针被报导，而多数存在着检测反应慢、灵敏性差的问题，且在检测甲醛的同时会消耗部分甲醛，从而扰动生物样本中内源性甲醛的浓度。因此，发展高灵敏性、且不会扰动内源性甲醛浓度的新型荧光探针，是目前探针研究领域的前沿和热点。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一类检测甲醛的荧光探针，是一类新型的特异性小分子荧光探针，具有式I、II、III或IV所示的结构：

其中：

R₁为氢，C₁-C₄烷基等；

R₂为氢，C₁-C₄烷基等；

n为自然数1或2。

本发明的又一个目的是提供式I、II、III及IV所示化合物的制备方法，通过以下制备方法实现：

以式I所示化合物为例，7位N-R₁，R₂取代的香豆素与劳森试剂在干燥的甲苯中回流反应6小时，冷却后过滤，滤液旋干后所得的产物溶于乙醇，加入80％水合肼回流反应3小时，反应完毕，经萃取、浓缩、及柱层析纯化得式I所示化合物。式II、III及IV所示化合物采用类似的合成方法，以苯环对应取代的香豆素为起始原料制得。

其中R₁、R₂和n的定义同上述。

本发明的再一个目的是提供式I、II、III及IV所示化合物在制备检测环境中甲醛含量的检测剂中的应用。可通过以下步骤实现：(1)首先制备式I、II、III或IV所示化合物的水溶液；(2)上述溶液分若干份，分别置于密闭环境中，并在环境中充入已知不同量的甲醛，10小时后测其荧光强度；(3)以荧光强度对甲醛浓度作图，得工作曲线；(4)将第一步中制备的化合物溶液置于待检测环境中过夜，测其荧光强度；(5)利用第三步得到的工作曲线及第四步所测得的荧光强度，计算环境中的甲醛含量。

本发明的又一个目的是提供式I、II、III及IV所示化合物在制备检测生物样本中甲醛含量的检测剂中的应用。本发明以活细胞中的应用为例，可通过以下步骤实现：细胞培养基中加入式I、II、III或IV所示化合物，使其终浓度为5μM，37℃下孵育30分钟，观察记录细胞荧光强度，本发明提供的荧光探针的特征在于它本身在生理环境中只有微弱的荧光，但可与甲醛特异性快速反应，生成具有强荧光的产物，且荧光强度与甲醛浓度间存在线性相关，从而实现对甲醛的特异性检测和定量分析。

本发明涉及的荧光探针具有以下有益效果：(1)稳定性好，能够长期保存使用；(2)由于探针本身无荧光，只有在与甲醛反应后才有荧光，因此，检测信噪比高，灵敏度好；(3)具有优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测甲醛；(4)具有良好的生物膜通透性，因而能用于活细胞中甲醛的检测；(5)检测反应快速，对水溶液中的甲醛，1分钟内可给出检测结果；(6)检测甲醛的同时不会影响环境中甲醛浓度。

附图说明

图1是荧光探针分子I-1与甲醛反应前后的荧光变化。

图2是荧光探针分子I-1对甲醛的选择性。

图3是荧光探针分子I-1对甲醛浓度依赖性荧光增强。

图4是荧光探针分子I-1检测新橱柜中甲醛含量。

图5是荧光探针分子I-1检测人大脑微血管内皮细胞中的内源性甲醛。

图6是荧光探针分子I-1检测老年痴呆模型APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛。

图7是荧光探针分子I-1检测老年痴呆模型APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例不限制本发明的范围。

实施例1：荧光探针分子I-1的制备

7-二乙基氨基香豆素(500毫克)和劳森试剂(1.86克)在干燥的甲苯中回流反应6小时。反应后，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应3小时。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得I-1(产率65％)。LC-MS：m/z232.3010[M+H]⁺。

实施例2：荧光探针分子II-1的制备

7-甲氧基香豆素(500毫克)和劳森试剂(1.86克)在干燥的甲苯中回流反应6小时。反应后，冷却过滤，滤液旋干溶剂后溶于乙醇，加入80％水合肼，回流反应3小时。反应完毕，旋干溶剂，加入水，以二氯甲醛萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得II-1(产率70％)。LC-MS：m/z191.2066[M+H]⁺。

实施例3：荧光探针分子I-1与甲醛反应前后的荧光变化

将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或甲醛的PBS溶液，使探针分子的终浓度为10μM,甲醛终浓度为500μM。反应10min后使用荧光分光光计以450nm激发，记录溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度，进而确定探针分子与甲醛反应后荧光强度增强，如图1所示。

实施例4：荧光探针分子II-1与甲醛反应前后的荧光变化

将探针分子以少量DMSO溶解，分别加入PBS缓冲液或甲醛的PBS溶液，使探针分子的终浓度为10μM,甲醛终浓度为500μM。反应10min后使用荧光分光光计以450nm激发，记录溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度，进而确定探针分子与甲醛反应后荧光强度增强，如图2所示。

实施例5：荧光探针分子I-1对甲醛的选择性

将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入PBS缓冲液溶解的各类可能干扰甲醛分析的待测样品，使探针分子的终浓度为10μM，各待测样品终浓度为300μM。反应30min后使用荧光分光光计以450nm激发，记录溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度，进而确定探针分子对甲醛的选择性，如图3所示。

实施例6：荧光探针分子I-1对甲醛浓度依赖性荧光增强

将探针分子以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液配置成溶液，分别加入不同浓度的甲醛溶液，使探针分子的终浓度为10μM，反应10min后使用荧光分光光计以450nm激发，记录溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度，进而确定探针分子对甲醛浓度依赖性荧光增强，如图4所示。

实施例7：荧光探针分子I-1检测新橱柜中甲醛含量

96孔培养板中加入浓度为10μM的探针溶液，避光，开盖分别放置于通风环境和新橱柜中。使用多功能酶标仪以450nm激发，在5min，10min，15min，30min，60min，120min，180min和240min检测探针溶液在最大发射波长(约500nm)下的荧光强度。结果如图5所示，探针溶液放置于新橱柜中5min时，荧光强度显著上升，此后随时间延长不断上升。而放置于通风环境中的对照组在相同时间点的荧光强度均无明显提高。这提示，荧光探针分子I-1能快速灵敏地检测出空气环境中的甲醛。

实施例8：荧光探针分子I-1检测人大脑微血管内皮细胞中的内源性甲醛

大脑微血管内皮细胞接种于载玻片上，CO₂细胞培养箱中培养至80％左右融合率。实验分为三组，内源性甲醛清除对照组用200μM NaHSO₃预孵育30min；甲醛检测实验组单加10μM的小分子探针孵育15min；内源性甲醛清除后检测组先用200μM NaHSO₃预孵育30min，再加入10μM探针预孵育15min。进行上述处理后，激光共聚焦显微镜观察细胞荧光强度变化。结果如图6所示，NaHSO₃对照组无荧光，探针组显示出较强的荧光强度，而NaHSO₃预孵育清除内源性甲醛后，细胞内荧光强度显著降低，证明本探针能够识别活细胞中的内源性甲醛。

实施例9：荧光探针分子I-1检测老年痴呆模型APP小鼠脑片活组织海马区域的内源性甲醛

C57BL/6小鼠或老年痴呆模型APP转基因小鼠快速断头处死，取出大脑并放入4℃人工脑脊液1中。人工脑脊液1成分为(mM)：75蔗糖，87NaCl，2.5KCl，15NaH₂PO₄，7MgCl₂，0.5CaCl₂，25NaHCO₃和25葡萄糖。振动切片机平台中灌入合适4℃人工脑脊液1，将大脑放置于切片机平台，切取含有大脑海马区域的300μm厚度的冠状缝切面脑片，转移至通入95％O₂和5％CO₂的4℃人工脑脊液2中30min备用。人工脑脊液2成分为(mM)：124NaCl，3KCl，1.25NaH₂PO₄，1.0MgSO₄，2CaCl₂和26NaHCO₃。所得脑片分为三组，第一组为20μM探针中孵育30min的C57BL/6小鼠脑片，第二组为20μM探针中孵育30min的APP转基因小鼠脑片，第三组为APP转基因小鼠脑片先在200μM NaHSO₃孵育30min，PBS清洗脑片后，再加入20μM探针预孵育30min。进行上述处理后脑片用PBS清洗3次，激光共聚焦显微镜观察脑片荧光强度。结果显示，在大脑海马和皮层区域，C57BL/6小鼠脑片的荧光强度均处于较低水平，APP转基因小鼠脑片的荧光强度显著高于C57BL/6小鼠脑片，加入200μM NaHSO₃可使APP转基因小鼠脑片荧光强度显著降低。这提示本小分子荧光探针能够可视化检测出老年痴呆病理模型的活组织脑片中内源性甲醛的水平显著高于正常小鼠，且通过甲醛清除剂的干预可降低内源性甲醛水平。本结果为探针的进一步用于病理模型中内源性甲醛的可视化检测奠定了实验基础(图7)。