一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法

一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法。该线粒体靶向超氧阴离子探针的结构式可为式Ⅰ或式Ⅰ′所示化合物，也可以为式Ⅱ或式Ⅱ′所示化合物。本发明设计和合成了一系列线粒体靶向超氧阴离子探针，本发明探针能够定向靶向性的到达细胞的线粒体，对细胞线粒体具有高度的选择性；本发明探针能实时和高选择性地检测出线粒体内超氧阴离子的产生，对线粒体中其他活性氧则没有反应，对超氧阴离子的检测具有专一性。
【专利说明】
一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法，属于分子检测和分子 成像领域。
【背景技术】
[0002] 线粒体是一种广泛存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，直径在 0.5到10微米左右。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP)的主要场所，为 细胞的活动提供了能量，所以有"细胞动力工厂"之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与 诸如调节膜电位并控制细胞程序性死亡；细胞分化、细胞增殖与细胞代谢的调控；合成胆 固醇及某些血红素；负责细胞信息传递并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。
[0003] 自由基是一些能够独立存在的，具有一个或多个未成对电子的原子或分子。当两 个电子自旋方向相反，成对在同一个轨道上，那么它们就更加稳定。生物体内自由基是来自 机体正常生理代谢过程和生存环境诱导产生的不稳定中间产物，它是细胞信号转导的重要 信使分子，与生物体内各种生理作用及病理现象密切相关。大量研究表明，动物细胞内的自 由基有99%来自线粒体的电子传递链上。体内重要的一类自由基是活性氧自由基，也称为 活性氧，一般包括〇 2 ·、· 〇H、R00 ·、R0 ·等。
[0004] 活性氧，顾名思义，就是比起普通的氧分子，它们有着更高的氧化还原活性。活性 氧不仅包括一些自由基，如羟自由基（·〇Η)，超氧阴离子（0 2·)，过氧羟自由（·Η02)，过氧 自由基（R00 ·)和烷氧基自由基（R0 ·)，也包括了一些非自由基，即过氧化氢（Η202)，单线 态氧（1〇2)和次氯酸（H0C1)。活性氧是指在生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和易形成 自由基的过氧化物的总称，机体内氧化代谢可不断形成活性氧，在一定的空间、时间和一定 的限度内活性氧有积极的生理作用。
[0005] 自由基分为氧化性和还原性自由基，在体内处于平衡状态，调控体内的氧化-还 原平衡，一旦一方过量失去平衡就会对细胞造成损伤，带来一系列疾病。自由基可攻击生命 大分子物质及细胞壁，造成机体的多种损伤和病变，加速机体的衰老；自由基摧毁细胞膜， 导致细胞膜发生变性，使得细胞不能从外部吸收营养，也排泄不出细胞体内的代谢废物，并 丧失了对细菌和病毒的抵御能力。从而使人体免疫力低下、疲劳和器官病变。如果导致细 胞死亡或细胞内杂质无法代谢就会形成色素沉积，产生黄褐斑、蝴蝶斑、老年斑等；自由基 攻击正在复制中的基因，造成基因突变，诱发癌症发生；自由基氧化血液中的脂蛋白造成胆 固醇向血管壁的沉积，引起心脏病、中风、动脉硬化、脑血栓、脑溢血、偏瘫或高血压等心脑 血管病症。侵蚀脑细胞使人易患老年性痴呆；自由基作用于人体内分泌系统，导致胶原蛋 白酶和硬弹性蛋白酶的释放，这些酶作用于皮肤中的胶原蛋白酶和硬弹性蛋白并使这两种 蛋白产生过度交联并降解，结果使皮肤失去弹性，出现皱纹及囊泡，使体内毛细血管脆性增 加，使血管容易破裂，这可导致静脉曲张，水肿等与血管通透性升高有关的疾病的发生；自 由基引起关节膜及关节滑液的降解，从而导致关节炎；侵蚀胰脏细胞引起糖尿病；损伤肝 脏器官导致肝炎。
[0006] 人体内自发产生的适量的活性氧是相当重要的，它们涵盖了不同的生命活动，诸 如在信号转换，神经传递，肌肉舒展放松及蠕动，血小板凝集，血压调节，免疫系统控制，学 习和记忆，能量产生，细胞常规生长，重要的生命化合物的合成和机体的新陈代谢中，都发 挥了重要的作用。然而，当活性氧产生过量或机体自身的抗氧化剂的量大量减少时，活性氧 就变得相当有害了。它们通过氧化生物分子，使得细胞脂质膜、蛋白质组织、酶、碳水化合物 或DNA等氧化损伤，造成细胞损坏或死亡。总之，在一般细胞环境中，活性氧对于生命体是 必不可少的，但过量的活性氧就会造成危害。
[0007] 自由基的种类很多，用来说明衰老发生机制的自由基，主要是超氧自由基、羟自由 基和类脂质过氧化自由基。在线粒体内膜，分子氧（〇 2)首先接受一个电子被还原成超氧自 由基（〇2)，生成的超氧再进一步转变成H0 ·、0N00 -、R00 ·和R0 ·等活性更高的氧自由基 (R0S)。超氧自由基作用的产物，都是强氧化剂，可使类脂质中的不饱和脂肪酸氧化为类脂 过氧化物。它们都是引发脂质过氧化自由基反应的氧化剂，在正常情况下，由于生物体内存 在自由基清除剂，如性激素、S0D、过氧化氢酶等使生物体内自由基的产生与清除保持相对 平衡，并参与许多正常的生理生化反应。若自由基清除剂的合成恶性化或自由基反应发生 紊乱，则会导致机体一系列的病理改变。超氧自由基能引发体内脂质过氧化，加快肌体的衰 老过程，并可诱发癌症、心血管疾病等，严重危害人体健康，人体通过超氧化物歧化酶（S0D) 将其转化成过氧化氢和氧气除去。由此可见，超氧自由基是诱导自由基反应链启动的首要 自由基，它与众多疾病的发生发展密切相关。而线粒体是超氧阴离子产生的主要场所，能够 定向靶向性地在超氧阴离子产生地线粒体中实现对超氧的检测对研究自由基以及超氧引 起的相关疾病的预防、诊断和治疗具有重要意义。

【发明内容】

[0008] 本发明的目的是提供一种线粒体靶向超氧阴离子探针及其制备方法，本发明线粒 体靶向超氧阴离子探针能够实现定向靶向性检测线粒体内超氧阴离子检测。
[0009] 本发明提供的化合物，其结构式为式I或式P，
[0011] 式I和式I '中：X M+-L-D和X M+均为线粒体靶向分子基团；
[0012] M+为R 3P+、R3N+，R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基；
[0013] X 为 Cl、Br 或 I ;
[0014] L为碳原子数2~10的链状烷基、_(0CH2CH2)n-或2~10个氨基酸基团组成的直 链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合；
[0015] D为-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的 任意一中：_CONH_、_CH2_NH _ 和 _C0_0_〇
[0016] 本发明中氨基酸指的是广义上的氨基酸，即含有氨基和羧基的化合物。
[0017] 本发明上述式I所示化合物中，M+为R3P+，R为苯基；X为Br ;L为碳原子数为4 的链状烷基；D为-C0-0-;即式I所示化合物的结构式具体可如下：
[0018]
[0019] 本发明进一步提供了上述式I或式厂所示化合物的制备方法，该制备方法以荧 光素为原料，利用带正电基团可靶向跨过线粒体膜导入线粒体的特点，将带正电荷的官能 团结合到荧光素上，得到上述式I或式厂线粒体靶向超氧阴离子探针；
[0020] 式I的制备方法包括如下步骤：
[0021] (1)在有机溶剂I中，荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应I，得到中间产物I ;
[0024] 所述有机溶剂I为DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0025] (2)在有机溶剂II中，所述中间产物I与X-L-D-Y进行反应II，得到中间产物II ;
[0026]
[0027] X-L-D-Y和中间产物II中，X为-Cl、-Br、-I或-H;L为碳原子数2~10的链状烷 基、_(0CH2CH 2)n-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸 基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D为-CONH-、-CH2-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基 团共同形成下述基团中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0- ;Y为-OH、-Cl、-Br或-I ;
[0028] 所述有机溶剂II为DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0029] (3)在有机溶剂III中，所述中间产物II与Μ进行反应III，得到式I所示化合物；
[0030] 所述Μ中，Μ为R3P、R3N，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基；
[0031] 所述有机溶剂III为DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0032] 式I '的制备方法包括如下步骤：
[0033] (1)在有机溶剂I中，荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应I，得到中间产物I ;
[0034]
[0035] 所述有机溶剂I为DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0036] (2)在有机溶剂III中，所述中间产物I与MX进行反应ΙΙΓ，得到式I '所示化合 物；
[0037] 所述MX中，M为R3P、R3N，R为碳原子数2-6的链状烷基或苯基 ；X为-Cl、-Br或-I;
[0038] 所述有机溶剂III为DMS0、DMF、THF、甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0039] 上述的制备方法，式I的制备方法步骤（1)中，所述荧光素与所述二苯基次磷酰 氯的摩尔比可为5~1 :1，具体可为2 :1 ;所述反应I的温度为40~120°C，时间为8~ 40h ；
[0040] 步骤（2)中，所述中间产物I与所述X-L-D-Y的摩尔比可为1 :1~5,具体可为1 : 1 ;所述反应II的温度为〇~50°C，时间为8~20h ;
[0041] 步骤⑶中，所述中间产物II与所述Μ的摩尔比可为1 :1~5,具体可为1 :3 ;所 述反应III的温度均为30~120°C，时间均为10~40h ;
[0042] 式I '的制备方法步骤（1)中，所述荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比可为 5~1 :1 ;所述反应I的温度可为40~120。。，时间可为8~40h ;
[0043] 步骤⑵中，所述中间产物I与MX的摩尔比可为1 :1~5 ;所述反应ΙΙΓ的温度 可为30~120°C，时间均可为10~40h。
[0044] 上述的制备方法，所述反应I、所述反应II、所述反应III和所述反应ΙΙΓ结束后均 包括冷却至0~20°C的步骤。
[0045] 本发明提供的化合物，其结构式为式II或式II'，
[0046]
[0047] 式II和式II '中，XM+-L-D、XM+、XM' +_L' -D'和XM' +均为线粒体靶向分子 基团；
[0048] M+和，+均为R 3P+、R3N+，R为碳原子数2-6的链状烷基或苯基；
[0049] X 为 Cl、Br、I ;
[0050] L和L'均为碳原子数为2~10的链状烷基、-(0CH2CH2) n-或2~10个氨基酸基 团组成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合；
[0051] D和IV均为-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D与L中的端位基团共同形成下述 基团中的任意一中：-C0NH-、-CH 2-NH-和-C0-0-，或IV与中的端位基团共同形成下述 基团中的任意一中：-conh-、-ch2-nh-和-co-o- 〇
[0052] 本发明上述式II所示化合物，M+为R3P+，R为甲基；X为Br ;L为-CH2CH2C0NHCH2CH 2C0NHCH(CH(CH3)2)-;D 为-C〇-〇-;M，+为 R3P+，R 为苯基；X，为 Br ;L，为碳原子数 3 的 链状烷基；D'为-C0NH-;即式I所示化合物的结构式具体可如下：
[0053]
[0054] 本发明还提供了上述化合物式II或式II'的制备方法，式II的制备方法包括如下 步骤：
[0055] (1)在有机溶剂IV中，在缩合剂的作用下4-硝基荧光素与X-L-D-Y进行反应IV，得 到中间产物III，
[0056]
[0057] X-L-D-Y和中间产物III中，X为-Cl、-Br或-I ;L为碳原子数2~10的链状烷 基、_(0CH2CH2)n-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸 基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D为-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D与L中的端位基 团共同形成下述基团中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0- ;Y为-OH、-Cl、-Br或-I ;
[0058] 所述有机溶剂IV为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0059] 所述缩合剂为二环己基碳二亚胺（EDC)、可溶于水的碳二亚胺（DCC)、4_二甲氨基 吡啶（DMAP)或0-苯并三氮唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸（TBTU);
[0060] (2)在有机溶剂V中，所述中间产物III与二苯基次磷酰氯进行反应V，得到中间产 物IV，
[0061]
[0062] 中间产物IV中，X为-Cl、-Br或-I ;L为碳原子数为2~10的链状烷基、_(0CH2CH2) n-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10 个氨基酸脱水缩合；D为-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D与L中的端位基团共同形成下述 基团中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0-;
[0063] 所述有机溶剂V为DMS0、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0064] (3)在有机溶剂VI中，所述中间产物IV与R-X'进行反应VI，得到中间产物V，
[0065]
[0066] R-X'和中间产物V中，M+为R3P+、R3N +，R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基； X为Cl、Br或I ;X'为-Cl、-Br或-I ;L为碳原子数为2~10的链状烷基、_(0CH2CH2) n-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10 个氨基酸脱水缩合；D为-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D与L中的端位基团共同形成下述 基团中的任意一中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0-;
[0067] 所述有机溶剂VI为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0068] (4)在有机溶剂W中，所述中间产物V进行反应VL还原剂将硝基还原为氨基，得 到中间产物VI，
[0069]
[0070] 中间产物VI中，M+为R3P+、R 3N+，R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基；X为 Cl、Br或I ;L为碳原子数为2~10的链状烷基、_(0CH2CH2)n-或2~10个氨基酸基 团组成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合； D为-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一 中：-C0NH-、-CH 2-NH-和-C0-0-;
[0071] 所述有机溶剂W为DMS0、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0072] 所述还原剂为LiAlH4;
[0073] (5)在有机溶剂VID中，所述中间产物VI与M' -L' -D' -Y进行反应W，得到式II，
[0074] M' -1/ -D' -Y中，M'为-PR3、-NR3, R为碳原子数为2~6的链状烷基或 苯基；为碳原子数为2~10的链状烷基、-(0CH2CH2) n-或2~10个氨基酸基团组 成的直链，其中η为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D' 为-C0NH-、-CH 2-NH-或-C0-0-;或D'与L'中的端位基团共同形成下述基团中的任意一 中：-C0NH-、-CH2-NH-和-C0-0- ;Y 为-OH、-Cl、-Br 或-I ;
[0075] 所述有机溶剂W为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
[0076] 式II'的制备方法包括如下步骤：
[0077] (1)在有机溶剂V中，所述4-硝基荧光素与二苯基次磷酰氯进行反应V'，得到 中间产物W，
[0078]
[0079] 所述有机溶剂V '为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0080] (2)在有机溶剂VI中，所述中间产物IV与M-X'进行反应VT，得到中间产物 V、
[0081]
[0082] 11'和中间产物\^中1为1?3?、1?3矿，1?为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3 ; M*R3P、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3;X为Cl、Br或I ;X'为-Cl、-Br 或-I ;
[0083] 所述有机溶剂VI为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0084] (3)在有机溶剂W中，所述中间产物V进行反应W，还原剂将硝基还原为氨基， 得到中间产物VT，
[0085]
[0086] 中间产物VT中，M+为R3P+、R 3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基；X为C1、 Br 或 I ;
[0087] 所述有机溶剂W为DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种；
[0088] 所述还原剂为LiAlH4;
[0089] (4)在有机溶剂VID中，所述中间产物VT与Μ' X'进行反应VDT，得到式II'，
[0090] Μ' X'中，M'为R3P、R3N，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基，X'为-Cl、-Br 或-I ;X 为 Cl、Br 或 I ;
[0091] 所述有机溶剂W为DMS0、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1种。
[0092] 上述的制备方法，式II的制备方法步骤（1)中，所述4-硝基荧光素、所述X-L-D-Y 与所述缩合剂的摩尔比为1~3 :1 :1~6,具体可为3 :1 :3. 6 ;所述反应IV的温度为0~ 40°C，时间为5~40h，具体可为10h ;
[0093] 步骤（2)中，所述中间产物III与所述二苯基次磷酰氯的摩尔比为1~3 :1，具体可 为1 :1. 5 ;所述反应V的温度为40~120°C，具体可40~100°C，时间为8~40h，具体可为 20h ；
[0094] 步骤⑶中，所述中间产物IV与所述R-X'的摩尔比为1 :3~10,具体可为1 :5 ; 所述反应VI的温度为40~120°C,时间为8~40h,具体可为15h ;
[0095] 步骤⑷中，所述中间产物V与所述还原剂的摩尔比为1 :1~3,具体可为1 :2 ; 所述反应W的温度为-40~0°C，具体可为-20°c，时间为8~40h，具体可为15h ;
[0096] 步骤（5)中，所述中间产物VI与所述，-17 -Y的摩尔比为1 :1~5,具体 可为1 :1. 5 ;所述反应VID的温度为10~50°C，时间为15~40h ;
[0097] 式II'的制备方法步骤（1)中，所述4-硝基荧光素与所述二苯基次磷酰氯的摩尔 比为1~3 :1 ;所述反应V的温度为40~120°C，时间为8~40h ;
[0098] 步骤⑵中，所述中间产物IV与所述M-X'的摩尔比为1 :3~10 ;所述反应VT 的温度为80~120°C，时间为20~40h ;
[0099] 步骤⑶中，所述中间产物V与所述还原剂的摩尔比为1 :1~3 ;所述反应VT 的温度为-40~0°C，时间为8~40h ;
[0100] 步骤⑷中，所述中间产物VT与所述Μ' X'的摩尔比为1:1~5;所述反应VT 的温度为10~40°C，时间为15~40h。
[0101] 上述的制备方法，所述反应IV结束后还包括冷却至0~10°C的步骤；
[0102] 所述反应VI、所述反应VT、所述反应νπ和所述反应w结束后均包括冷却至 0~20°C的步骤；
[0103] 所述反应V、所述反应V'、所述反应W和所述反应VT结束后均包括冷却至 0~30°C的步骤。
[0104] 本发明还提供了上述式I或式II所示化合物在制备线粒体靶向超氧自由基探针 中的应用。
[0105] 本发明还提供了上述式I或式II所示化合物在线粒体靶向超氧自由基检测和线 粒体靶向成像中的应用。
[0106] 本发明具有如下优点：
[0107] (1)本发明设计和合成了一系列线粒体靶向超氧阴离子探针。
[0108] (2)本发明探针能够定向靶向性的到达细胞的线粒体，对细胞线粒体具有高度的 选择性。
[0109] (3)本发明探针能实时和高选择性地检测出线粒体内超氧阴离子的产生，对线粒 体中其他活性氧则没有反应，对超氧阴离子的检测具有专一性。
[0110] (4)本发明制备方法简单可靠，能得到一系列线粒体靶向超氧阴离子探针的化合 物。
【附图说明】
[0111] 图1为本发明实施例1中制备线粒体靶向超氧自由基探针的合成路线图。
[0112] 图2为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的核磁氢谱图。
[0113] 图3为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的核磁碳谱图。
[0114] 图4为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的高分辨质谱图。
[0115] 图5为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验 中，荧光探针的荧光强度随超氧化钾浓度的变化图。
[0116] 图6为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针的活性氧选择性实验 中，探针与不同活性氧作用的柱状图。
[0117] 图7为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针对H9C2的细胞毒性中， 不同浓度探针对H9C2的细胞毒性的柱形图。
[0118] 图8为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内超氧检测和线 粒体靶向定位试验成像照片，其中图a为无刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图b为 无刺激的本发明线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，图c为无刺激的线 粒体探针MitoTracker-Red成像的照片，图d为无刺激的Mito-Superoxide-trackerl和没 有刺激的MitoTracker-Red叠加后的照片，图e为加百草枯刺激的线粒体探针Hochest成 像的照片，图f为加百草枯刺激的加百草枯刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，图g为加百草枯刺激的线粒体探针MitoTracker-Red成像的照片，图h为加 百草枯刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1和MitoTracker-Red叠加后的照 片。
[0119] 图9为本发明实施例1制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内多柔比星刺 激产生超氧检测试验，其中图a为无刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图b为无刺 激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，图c为无刺激的线粒体探针 Mit〇-S0X成像的照片，图d为无刺激的Mito-Superoxide-tracker 1和Mit〇-S0X叠加 成像的照片，图e为多柔比星刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图f为线粒体探针 Mito-Superoxide-tracker 1受多柔比星刺激成像的照片，图g为线粒体探针Mit〇-S0X 受多柔比星刺激成像的照片，图h为受多柔比星刺激的Mito-Superoxide-tracker 1和 Mito-SOX加后的照片。
[0120] 图10为本发明实施例2中制备线粒体靶向超氧自由基探针的合成路线图。
[0121] 图11为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试 验中，荧光探针的荧光强度随超氧化钾浓度的变化图。
[0122] 图12为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针对H9C2的细胞毒性 中，不同浓度探针对H9C2的细胞毒性的柱形图。
[0123] 图13为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内超氧检测和 线粒体靶向定位试验成像照片，其中图a为没有刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图 b为没有刺激的本发明线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图c为没有 刺激的线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图d为没有刺激的Mit〇-Superoxide-tracker2 和Mito-SOX叠加后的照片，图e为加 D0X刺激的线粒体探针Hochest成像的照片，图f为 加 D0X刺激的线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图g为加 D0X刺激的 线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图h为加 D0X刺激后的Mito-Superoxide-tracker 2和 Mito-SOX叠加后的照片。
[0124] 图14为本发明实施例2制备的线粒体靶向超氧自由基探针在细胞内多柔比星 刺激产生超氧检测试验，其中图a为线粒体探针Hochest成像的照片，图b为线粒体探针 Mito-Superoxide-tracker 2成像的照片，图c为线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图d 为线粒体探针没有刺激的Mito-Superoxide-tracker 2和Mito-SOX叠加后成像的照片，图 e为线粒体探针Hochest成像的照片，图f为线粒体探针Mito-Superoxide-tracker 2成 像的照片，图g为线粒体探针Mito-SOX成像的照片，图h为线粒体探针在多柔比星刺激后 Mito-Superoxide-tracker 2 和 Mito-SOX 叠加后的照片。
【具体实施方式】
[0125] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0126] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0127] 实施例1、线粒体革巴向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 1的制备和应 用
[0128] ( 一）、线粒体革巴向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 1的制备
[0129] 按照如图1所示的合成路线制备线粒体靶向超氧自由基探针 Mito-Superoxide-tracker 1〇
[0130] (1)将荧光素溶解在THF中，在20~80°C下慢慢滴加二苯磷酰氯到反应液中，荧 光素与二苯磷酰氯的摩尔比为2 :1，在30~80°C搅拌反应8h，反应结束冷却到20°C，蒸干 有机溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物I。
[0131] 结构确证结果如下"H-NMRGOOMHz, DMS0, TMS) : δ 8. 00-7. 98 (d, J = 7. 2Hz ,1H), 7. 95-7. 90 (m, 4H), 7. 78-7. 75 (t, J = 7. 2Hz, 1H), 7. 73-7. 69 (t, J = 7. 2Hz, 1H) ,7. 65-7. 62 (t, J = 7. 2Hz,2H), 7. 60-7. 55(m, J = 7. 2Hz, 4H), 7. 33-7. 31 (m, 1H), 7. 27-7. 25(d, J = 7. 6Hz, 1H) ,7. 06-7. 04(d, J = 7. 2Hz, 1H), 6. 77-6. 75 (d, J = 8. 8Hz ，lH)，6.69-6.67(m，lH)，6.56-6.54(t，J = 7.6Hz，2H) ;13C 匪R(400MHz，DMS0，TMS) :δ 169. 0, 160. 1, 152. 7, 151. 9, 151. 6, 136. 2, 133. 5, 132. 0, 131. 9, 131. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 6, 129. 5, 126. 3, 125. 3, 124. 5, 116. 0, 113. 6, 109. 6, 102. 7, 82. 4 ；m/z (HRMS) :Calcd. M-lfor C32H2006P 531. 10030, found 531. 09995〇
[0132] 经结构鉴定所合成的化合物确为中间产物I。
[0133] (2)将中间产物I溶解在THF中，在-10~10°C下慢慢滴加5-溴戊酰氯到反应液 中，中间产物I与5-溴戊酰氯的投料摩尔比为1 :1，在-10~10°C搅拌反应15h，反应结束 冷却到20°C，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物II。
[0134] 结构确证结果如下：1!1匪1?(4001!^，]^0!1，了]\^):3 8.02-8.01((1 ,J = 7. 2Hz, 1H) , 7. 94-7. 89 (m, J = 8. 4Hz, 4H) , 7. 77-7. 69 (m, 2H) , 7. 65-7. 62 (m, 2H) , 7. 58-7. 53 (m, 4H) , 7. 26-7. 25 (m, 1H) , 7. 19-7. 17 (d, J = 7.6Hz, 1H) , 7. 15-7. 14 (m, 1H) , 7. 01-6. 99 (dt, J = 8. 8Hz, 1H) , 6. 88-6. 86 (dd, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 82-6. 76 (dd, J = 8. 8Hz, 2H), 3. 51-3. 48 (t, J = 6. 4Hz, 2H), 2. 66-2. 62 (t, J =7. 61Hz, 2H), 2. 00-1. 93 (m, 2H), 1. 90-1. 82 (m, 2H) ；13C NMR (400MHz, DMSO, TMS) :δ 171. 4, 169. 4, 152. 7, 152. 4, 152. 2, 151. 6, 151. 3, 135. 4, 133. 0, 131. 4, 130. 1, 129. 2, 12 8. 6, 125. 9, 124. 6, 123. 7, 117. 9, 116. 9, 116. 2, 115. 7, 110. 1, 108. 9, 81. 6, 32. 5, 32. 3, 31. 6 ，22. 9 ;m/z (HRMS) :Calcd. M+Na, for C37H2SBrNa07P 717. 06482, found717. 06484。
[0135] (3)将中间产物II溶解在CH3CN中，在80°C下慢慢加三苯基磷到反应液中，中间产 物II与三苯基磷的投料摩尔比为1 :3,在80°C搅拌反应20h，反应结束冷却到20°C，蒸干反 应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得产物Mito-Superoxide-tracker 1。
[0136] 如图2(核磁氢谱）、图3(核磁碳谱）中和图4(高分辨质谱）所示，结构确证结果 如下： 1!1匪1?(4001抱，]^0!1，丁]^):3 8.03-8.01((1，了 = 7.6抱，1!1)，7.94-7.92(111，1!1)，7.92-7. 91 (d, J = 4. 8Hz, 2H), 7. 89-7. 87 (d, J = 9. 2Hz, 2H), 7. 86-7. 85 (d, J = 6. 0Hz, 2H), 7. 85-7. 84 (m, 1H), 7. 83-7. 81 (m, 3H), 7. 79-7. 78 (m, 2H), 7. 76-7. 74 (m, 7H), 7. 72-7. 70 (m, 2H), 7. 66-7. 62 (m, 2H), 7. 57-7. 53 (m, 4H), 7. 28-7. 27 (m, 1H), 7. 19-7. 17 (d, J = 7. 6Hz, 1H), 7. 04-7. 03 (m, 1H), 7. 01-6. 99 (dd, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 79-6. 78 (m, 2H), 3. 51-3. 44 (m, 2H), 2. 69-2. 66(t, J = 7. 2Hz,2H), 1.97-1. 92 (t,J = 7. 2Hz,2H), 1.85-1. 75 (m,2H) ;13C NMR (400MHz, DMS 0, TMS) : 171. 5, 171. 1, 169. 3, 152. 6, 152. 2, 151. 5, 151. 2, 135. 6, 134. 9, 133. 4, 133. 3, 133. 1, 131. 4, 130. 2, 129. 2, 128. 8, 128. 7, 128. 6, 125. 8, 124. 7, 123. 7, 118. 8, 117. 9, 117. 0, 116. 6, 116. 3, 110. 0, 108. 8, 81. 6, 32. 4, 25. 2, 21. 4, 19. 4 ；m/z (HRMS) :Calcd. M-Br, for C55H4307P28 7 7 . 24 7 8 5, found 877. 24737。
[0137] 由图2 (核磁氢谱）、图3 (核磁碳谱）中和图4 (高分辨质谱），可确认本实施例制 备得到的化合物的结构如下：
[0138]
[0139] (二）应用
[0140] (1)线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验
[0141] 将（一）中制备的探针 Mito-Superoxide-Tracker 1 溶解在 DMS0 中，配成 ImM 溶液待用；超氧化钾溶解在DMS0中，配成ImM溶液待用，再用DMS0稀释成ΙμΜ溶液； 取 8 份 10 μ L 的 ImM 的 Mito-Superoxide-Tracker 1 的 DMS0 溶液，各溶解在 500 μ L 憐 酸盐缓冲溶液（PBS，磷酸根离子的浓度0. 1Μ，pH = 7.4)中，然后分别加入0、10、20、 40、80、200、400和800111^体积1111超氧化钾溶液，最后均用？85(磷酸根离子的浓度 0. 1M，pH = 7. 4)定容至lml溶液，分别得到浓度为0、10、20、40、80、200、400和800nM的 超氧化钾溶液，反应5min，检测。检测结果如图5所示，由图5可知，线粒体靶向超氧自 由基探针Mito-Superoxide-Tracker 1的突光强度随超氧化钾浓度的增加而增强，突 光强度增强，说明Mito-Superoxide-Tracker 1的量减少与超氧的加入量成正比，证明 Mito-Superoxide-Tracker 1能与超氧化钾反应，与超氧化钾的量减少成正比。
[0142] (2)线粒体靶向超氧自由基探针的活性氧选择性实验
[0143] 将（一）中制备的探针 Mito-Superoxide-Tracker 1 溶解在 DMS0 中，配成 ImM 溶液待用；将活性氧〇2 ?、甘肽谷胱（GSH)、次氯酸钠（NaCIO)、过氧化氢（H202)、羟自由基 (·0Η)和叔丁基过氧化氢（t-Bu00H)配成ImM PBS，用ImM PBS溶液作为对照组（control); 取 7 份 10 μ L 的 ImM 的 Mito-Superoxide-Tracker 1 的 DMS0 溶液溶解在 500 μ L PBS (浓 度0. 1M，pH= 7.4)中，分别加入5yL上述不同活性氧溶液，用PBS定容至lOOOyL，避光 孵育5min ;然后将孵育好的上述反应液在荧光检测器下，用490nm的光激发，收集530nm处 突光强度。检测结果如图6所示，由图6可知，Mito-Superoxide-Tracker 1能选择性地与 超氧阴离子反应，而与其他活性氧则不反应。
[0144] (3)细胞毒性测试
[0145] 1)接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μ L。
[0146] 2)培养细胞：同一般培养条件，培养24h。
[0147] 3)加药：将本实施例制备的探针溶解在培养基中，加入96孔板，每孔体积200 μ L， 探针的浓度分别为 12. 511]?、2511]\1、5011]\1、10011]\1、30011]\1、50011]\1、100011]\1和 500011]\1，不加探针的 为对照组（con)，培养24h。
[0148] 4)呈色：培养24天后，每孔加 MTT溶液（5mg/mL用pH为7. 4的PBS配制）20 μ L， 继续孵育4小时，终止培养；小心吸取孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔 内培养上清液。每孔加150 μ L DMS0,振荡10分钟，使结晶物充分融解。
[0149] 5)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，如 图7所示，以探针的浓度为横坐标，490nm处荧光吸收值为纵坐标绘制曲线，由图7可知，证 明本发明探针在10 μ Μ时几乎没有显示出细胞毒性。
[0150] (4)细胞超氧检测共聚焦成像
[0151] 1)按标准操作法培养好H9C2小鼠心肌细胞待用。
[0152] 2)分别按每孔1万个的密度将细胞种在confocal皿内，加2ml 1640培养基贴壁 培养24h，取三份放置于三个培养皿中，分别按照3)-5)进行三种培养。
[0153] 3)取细胞核靶向探针Hochest溶解在PBS中，稀释成2ug/ml于培养基中，加入到 细胞中培养30min，移走药液，用PBS洗涤一遍。
[0154] 4)取制备的探针Mito-Superoxide-Tracker 1溶解在PBS中，配置成10 μ Μ溶液， 稀释成800ηΜ的培养基中，加入到细胞中培养30min，移走药液，用PBS洗涤一遍。
[0155] 5)线粒体超氧探针MitoTracker-Red配成10nM培养液，加入到细胞中培养 30min。移走药液，用PBS洗涤一遍。
[0156] 6)在上述三个皿中分别加培养基稀释好的10 μ Μ的百草枯、10 μ Μ的D0X、30mM的 高浓度葡萄糖，孵育30min，移走药液，PBS洗涤一遍。
[0157] 7)加药的细胞在激光共聚焦下用405nm、488nm和559nm同时激发，结果如图8所 示，由图8可知，本发明制备的探针的绿色突光与线粒体成像探针MitoTracker-Red的红色 荧光能够很好的重合叠加，证明本发明的探针能选择性地在线粒体成像。
[0158] (5)线虫成像测试
[0159] 1)按标准条件培养好线虫待用，待线虫长到成年且生长状态良好，用M9溶液洗出 部分线虫待用。
[0160] 2)取本实施例制备得到的探针溶解在M9溶液中，配置成800nM溶液，加入到线虫 中培养30min。
[0161] 3)线粒体成像探针Mito - SOX配成1 μ Μ培养液，加入到线虫中培养30min。
[0162] 4)在加有线虫的同时进行步骤2)和3)培养皿各个3个中分别加药，即加入培养 基稀释好的50 μ Μ的百草枯，孵育30min，移走药液，PBS洗涤一遍。
[0163] 5)将加药的线虫在激光共聚焦下用488nm和559nm同时激发，结果如图9所示，由 图9可知，本发明的探针的绿色荧光与线粒体成像探针Mito - S0X的红色荧光能够很好的 重合叠加，证明我们发明的探针能选择性地在线粒体成像。
[0164] 实施例2、线粒体革巴向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 2的制备和应 用
[0165] 按照如图10所示的合成路线制备线粒体靶向超氧自由基探针 Mit〇-Superoxide-tracker 2〇
[0166] ( 一）线粒体革巴向超氧自由基探针Mito-Superoxide-tracker 2的制备
[0167] (1)将4-硝基荧光素溶解在THF中，在20°C下慢慢滴加三肽到反应液中，按4-硝 基荧光素与三肽的摩尔比为3 :1投料，加入EDC缩合剂，4-硝基荧光素与缩合剂按1 :1. 2 投料，在0~40°C搅拌反应10h，反应结束冷却到0~10°C，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结 晶分离纯化得中间产物III。
[0168] 结构确证结果如下：? NMR(300MHz，DMS0, TMS) : δ 8. 65(s, 2H), 8. 5 1 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H) , 8. 32 (s, 1H) , 8. 18 (s, 1H) , 7. 6 5-7.60(d,J = 7. 5Hz, 1H) , 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H) , 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 2. 62-2. 51 (t, J =7. 0Hz, 1H) , 0. 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ；13C NMR (300MHz, DMS0, TMS) :δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 133. 5, 130. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1，18. 9 ;m/z (HRMS) :Calcd. M，For C31H30N4010618. 24, found 618. 6478。
[0169] (2)将中间产物III溶解在THF中，在40~60°C下慢慢滴加二苯磷酰氯到反应液 中，中间产物III与二苯磷酰氯的投料摩尔比为1 :1. 5,在40~100°C搅拌反应20h，反应结 束搅拌冷却到25°C，蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物IV。
[0170] 结构确证结果如下"H NMR (300MHz, DMS0, TMS): δ 8.65 (s，2H), 8.51 (m，J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 2. 62-2. 51 (t, J = 7. OHz, 1H), 0. 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ；13C NMR (300MHz, DMSO, TMS) : δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125 .8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/ z (HRMS) :Calcd. M, for C43H39N40nP 818. 20, found 818. 7653〇
[0171 ] (3)将中间产物IV溶解在THF中，在60°C下慢慢滴加溴甲烷到反应液中，中间产物 IV与溴甲烷的投料摩尔比为1 :5,在40~80°C搅拌反应15h，反应结束冷却到10~20°C， 蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物V。
[0172] 结构确证结果如下"H NMR (300MHz, DMSO, TMS): δ 8.65 (s，2H), 8.51 (m，J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 9 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H), 3. 68-3. 58(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35 (t, J =7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 30-3. 28 (s, 9H), 2. 62-2. 51 (t, J = 7. 0Hz, 1H), 0· 98-0. 82(d, J = 7. 5Hz, 6H) ;13C 匪R(300MHz, DMS0, TMS) : δ 173. 3, 169. 8， 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 8, 129. 5, 129. 2 ,128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 54. 1, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/z (HRMS) :Calcd. M, for C46H46BrN40nP 940. 21, found 941.7756。
[0173] (4)将中间产物V溶解在THF，在-40~0°C下将LiAlH^g慢加入到反应液中，中间 产物V与LiAlH 4&投料摩尔比为1 :2,在-20°C搅拌反应15h，反应结束冷却到10~20°C， 蒸干反应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得中间产物VI。
[0174] 结构确证结果如下：? NMR(300MHz, DMS0, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 51 (m, J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98(d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J =7. 5Hz, 1H), 5. 28 (s, 2H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H) , 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 30-3. 28 (s, 9H)，2. 62-2. 51 (t, J = 7. 0Hz, 1H)，0· 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ;13C NMR(300MHz, DMS0, TMS ):δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 1 29. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107. 7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 54. 1, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/z (HRMS) :Calcd. M, for C46H48BrN409P 910. 23, found 911. 7936。
[0175] (5)将中间产物VI溶解在THF中，在10~40°C下将三苯基磷丁羧酸慢慢加入到反 应液中，中间产物VI与三苯基磷丁羧酸的投料摩尔比为1 :1. 5,加入DCC缩合剂，中间产物 VI与缩合剂投料摩尔比为1 :1. 5,在10~50°C搅拌反应15h，反应结束冷却到25°C，蒸干反 应溶剂，经柱层析和重结晶分离纯化得目标探针Mito-Superoxide-tracker 2。
[0176] 结构确证结果如下：? NMR(300MHz, DMSO, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 51 (m, J =7. 5Hz, 1H), 8. 41 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 8. 32 (s, 1H), 8. 18 (s, 1H), 7. 86-7. 79 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 65-7. 60 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 56-7. 48 (d, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 45-7. 37 (d, J = 7. 5Hz, 2H), 7. 36-7. 29 (d, J = 7. 5Hz, 3H), 7. 30-7. 24 (d, J = 7. 5Hz, 6H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 12-7. 03 (d, J = 7. 5Hz, 6H), 7. 03-6. 98(d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J =7. 5Hz, 1H), 5. 28 (s, 2H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H) , 3. 52-3. 42 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 45-3. 35(t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 33-3. 23 (t, J = 7. 5Hz, 2H), 3. 30-3. 28 (s ,9H), 2. 62-2. 51 (t, J = 7. 0Hz, 1H), 2. 46-2. 38 (t, J = 7. 0Hz, 2H), 2. 39-2. 30 (t, J = 7. 0Hz, 2H), 1. 70-1. 59 (m, J = 7. 0Hz, 2H), 0. 98-0. 82 (d, J = 7. 5Hz, 6H) ；13C NMR(300MHz,D MS0, TMS) : δ 173. 3, 169. 8, 152. 4, 151. 7, 151. 4, 150. 3, 147. 4, 134. 5, 134. 2, 133. 5, 130. 8, 130. 2, 129. 8, 129. 5, 129. 2, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 126. 1, 125. 8, 124. 1, 113. 9, 111. 9, 107 .7, 105. 7, 84. 8, 64. 9, 59. 2, 54. 1, 39. 2, 37. 9, 30. 5, 27. 1, 18. 9 ；m/z (HRMS) :Calcd. M, for C68H68Br2N40 10P21320. 36, found 1321. 6839〇
[0177] 由上述谱图数据，可确认本实施例制备得到的化合物的结构如下：
[0178]
[0179] (二）应用
[0180] (1)线粒体靶向超氧自由基探针与超氧化钾的检测试验
[0181] 与实施例1中测定方法相同，实验结果如图11所示，由图11可知，线粒体靶向超 氧自由基探针Mito-Superoxide-Tracker 2的突光强度随超氧化钾浓度的增加而增强， 突光强度增强说明Mito-Superoxide-Tracker 2的量减少与超氧的加入量成正比，证明 Mito-Superoxide-Tracker 2能与超氧化钾反应，与超氧化钾的量减少成正比。
[0182] (2)细胞毒性测试
[0183] 与实施例1中测定方法相同，实验结果如图12所示，5000nM时 Mito-Superoxide-Tracker 2的细胞毒性很小，适合生物学应用。
[0184] (3)细胞超氧检测共聚焦成像
[0185] 与实施例1中测定方法相同，实验结果如图13所示，Mito-Superoxide-Tracker 2 能高度选择性地聚集在细胞线粒体中，并对不同刺激条件下产生的超氧具有灵敏地响应。
[0186] (4)线虫成像测试
[0187] 与实施例1中测定方法相同，实验结果如图14所示，Mito-Superoxide-Tracker 2 也能监测到线虫细胞受刺激产生的超氧阴离子。
【主权项】
1. 一种化合物，其结构式为式I或式I'，式I和式I '中；X M+-L-D和X M+均为线粒体祀向分子基团； M+为R RsN+，R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基； X为Cl、化或I ; L为碳原子数为2~10的链状烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10个氨基酸基团组成的直链， 其中n为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合； D为-CONH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意 一种；-CONH-、-邸2-畑-和-CO-O-。2. 权利要求1所述化合物式I或式I '的制备方法，式I的制备方法包括如下步骤： (1)在有机溶剂I中，英光素与二苯基次磯醜氯进行反应I，得到中间产物I ;所述有机溶剂I为DMS0、DMF、THF、甲醇、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； 似在有机溶剂II中，所述中间产物I与XA-D-Y进行反应II，得到中间产物II ;XA-D-Y和中间产物II中，X为-C1、-Br或-I ;L为碳原子数为2~10的链状焼 基、-(OCH2CH2)。-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2~5的整数，所述氨基酸 基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D为-C0NH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基 团共同形成下述基团中的任意一种；-C0NH-、-CH2-NH-和-CO-O- ;Y为-〇H、-Cl、-Br或-I ; 所述有机溶剂II为DMS0、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； (3)在有机溶剂III中，所述中间产物II与M进行反应III，得到式I所示化合物； 所述M中，M为RsP、RsN, R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基； 所述有机溶剂111为0150、01尸、1'邸、甲醇、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； 式I '的制备方法包括如下步骤： (1) 在有机溶剂I中，英光素与二苯基次磯醜氯进行反应I，得到中间产物I ;所述有机溶剂I为DMSO、DMF、THF、甲醇、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； (2) 在有机溶剂III中，所述中间产物I与MX进行反应Iir，得到式I '所示化合物； 所述MX中，M为RsP、RsN, R为碳原子数2~6的链状烷基或苯基；X为-Cl、-Br或-I ; 所述有机溶剂111为0150、01尸、1'邸、甲醇、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：式I的制备方法步骤（1)中，所述英 光素与所述二苯基次磯醜氯的摩尔比为5~1 ;1 ;所述反应I的温度为40~12(TC，时间为 8 ~40h ; 步骤似中，所述中间产物I与所述XA-D-Y的摩尔比为1 ; 1~5 ;所述反应II的温度 为0~50°C，时间为8~20h ; 步骤（3)中，所述中间产物II与所述M的摩尔比为1 ;1~5 ;所述反应III的温度均为 30~120°C，时间均为10~40h ; 式I '的制备方法步骤（1)中，所述英光素与所述二苯基次磯醜氯的摩尔比为5~1 ; 1 ;所述反应I的温度为40~120。时间为8~40h ; 步骤似中，所述中间产物I与MX的摩尔比为1 ; 1~5 ;所述反应Iir的温度为30~ 120°C，时间均为10~40h。4. 根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述反应I、所述反应II、所述 反应m和所述反应Iir结束后均包括冷却至0~2(TC的步骤。5. -种化合物，其结构式为式II或式11'，式II和式11'中，XM+-L-D、XM\XM' +-L' -D'和XM' +均为线粒体祀向分子基团； M+和M' +均为R 3P+、R3N+，R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基； X为Cl、化或I ; L和L'均为碳原子数为2~10的链状烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10个氨基酸基团组 成的直链，其中n为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合； D和D'均为-CONH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团 中的任意一种；-C0NH-、-CHz-NH-和-C0-0-，或D'与L'中的端位基团共同形成下述基团 中的任意一种；-C0NH-、-邸2-畑-和-C0-0-。6.权利要求5所述化合物式II或式II '的制备方法，式II的制备方法包括如下步骤： (1) 在有机溶剂IV中，在缩合剂的作用下4-硝基英光素与XA-D-Y进行反应IV，得到中 间产物III，XA-D-Y和中间产物III中，X为-C1、-Br或-I ;L为碳原子数为2~10的链状焼 基、-(OCH2CH2)。-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2~5的整数，所述氨基酸 基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D为-C0NH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基 团共同形成下述基团中的任意一种；-C0NH-、-CH2-NH-和-CO-O- ;Y为-〇H、-Cl、-Br或-I ; 所述有机溶剂IV为DMS0、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； 所述缩合剂为二环己基碳二亚胺、可溶于水的碳二亚胺、4-二甲氨基化巧或0-苯并H 氮哇-N，N，N'，N' -四甲基脈四氣测酸； (2) 在有机溶剂V中，所述中间产物III与二苯基次磯醜氯进行反应V，得到中间产物 IV，中间产物IV中，X为-CL-Br或-I ;L为碳原子数2~10的链状烷基、-(OCH2CH2)。-或 2~10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨 基酸脱水缩合；D为-C0NH-、-CH2-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团 中的任意一种；-C0NH-、-邸2-畑-和-CO-O-; 所述有机溶剂V为DMS0、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； (3) 在有机溶剂VI中，所述中间产物IV与R-X'进行反应VI，得到中间产物V，R-X'和中间产物V中，M+为R 3P\ RsN+, R为碳原子数2~6的链状烷基或苯基；X为 CK化或I ;X'为-CL-Br或-I ;L为碳原子数2~10的链状烷基、-(OCH 2邸2)。-或2~ 10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸 脱水缩合；D为-C0NH-、-CH2-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的 任意一种；-C0NH-、-邸2-畑-和-CO-O-; 所述有机溶剂VI为DMS0、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； (4) 在有机溶剂W中，所述中间产物V进行反应VL还原剂将硝基还原为氨基，得到中 间产物VI，中间产物VI中，M+为RsP^RsN+, R为碳原子数2~6的链状烷基或苯基；X为Cl、 化或I ;L为碳原子数2~10的链状烷基、-(OCH 2邸2)。-或2~10个氨基酸基团组 成的直链，其中n为2~5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D 为-C0NH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D与L中的端位基团共同形成下述基团中的任意一 种；-CONH-、-邸2-畑-和-CO-O-; 所述有机溶剂W为DMS0、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； 所述还原剂为LiAlH4; (5) 在有机溶剂W中，所述中间产物VI与M' -L' -D' -Y进行反应WL得到式II， M' -L' -D' -Y中，M'为-PR3、-NR3，R为碳原子数2~6的链状烷基或苯基；L'为碳 原子数2~10的链状烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10个氨基酸基团组成的直链，其中n为2~ 5的整数，所述氨基酸基团为2~10个氨基酸脱水缩合；D'为-C0NH-、-CH2-NH-或-CO-O-; 或D'与L'中的端位基团共同形成下述基团中的任意一种；-C0NH-、-CHz-NH-和-CO-O-; Y 为-〇H、-Cl、-Br 或-I ; 所述有机溶剂W为DMS0、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种。 式11'的制备方法包括如下步骤： (1)在有机溶剂V中，所述4-硝基英光素与二苯基次磯醜氯进行反应V'，得到中间 产物IV'，所述有机溶剂V '为DMSO、DMF、THF、乙腊、内咖、二氯申婉和氯仿中至少I种； (2) 在有机溶剂VI中，所述中间产物IV与M-X'进行反应VT，得到中间产物V'，M-X'和中间产物V '中，M+为R3P、RsN+, R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3 ;M 为R3P、R3N+，R为碳原子数为2-6的链状烷基或苯基3 ;X为Cl、化或I ;X'为-Cl、-Br 或-I ; 所述有机溶剂VI为DMSO、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； (3) 在有机溶剂W中，所述中间产物V进行反应VT，还原剂将硝基还原为氨基，得到 中间产物VT，中间产物VT中，M为RsP、RsN, R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基；X为Cl、 化或I ; 所述有机溶剂W为DMSO、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种； 所述还原剂为LiAlH4; (4) 在有机溶剂W中，所述中间产物VT与M' X'进行反应WT，得到式Ir， M' X'中，M'为R3P、R3N，R为碳原子数为2~6的链状烷基或苯基，X'为-C1、-Br 或-I ;X为Cl、化或I ; 所述有机溶剂W为DMSO、DMF、THF、己腊、丙丽、二氯甲焼和氯仿中至少1种。7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：式II的制备方法步骤（1)中，所述 4-硝基英光素、所述XA-D-Y与所述缩合剂的摩尔比为1~3 ;1 ;1~6 ;所述反应IV的温 度为O~40°C，时间为5~40h ; 步骤（2)中，所述中间产物III与所述二苯基次磯醜氯的摩尔比为1~3 ;1 ;所述反应V 的温度为40~120。时间为8~40h ; 步骤（3)中，所述中间产物IV与所述R-X'的摩尔比为1 ;3~10 ;所述反应VI的温度为 80~120°C，时间为20~40h ; 步骤（4)中，所述中间产物V与所述还原剂的摩尔比为1 ;1~3 ;所述反应W的温度 为-40~(TC，时间为8~40h ; 步骤（5)中，所述中间产物VI与所述M' -L' -D' -Y的摩尔比为1 ;1~5 ;所述反应 W的温度为10~50°C，时间为15~40h ; 式Ir的制备方法步骤（1)中，所述4-硝基英光素与所述二苯基次磯醜氯的摩尔比为 1~3 ;1 ;所述反应V '的温度为40~120。时间为8~40h ; 步骤（2)中，所述中间产物IV'与所述M-X'的摩尔比为1:3~10;所述反应VT的温 度为80~120°C，时间为20~40h ; 步骤（3)中，所述中间产物V'与所述还原剂的摩尔比为1:1~3;所述反应VT的温 度为-40~(TC，时间为8~40h ; 步骤（4)中，所述中间产物VT与所述M' X'的摩尔比为1:1~5;所述反应VT的 温度为10~40°C，时间为15~40h。8. 根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述反应IV结束后还包括冷却 至0~1(TC的步骤； 所述反应VI、所述反应VT、所述反应W和所述反应VT结束后均包括冷却至0~ 20°C的步骤； 所述反应V、所述反应V'、所述反应W和所述反应VT结束后均包括冷却至0~ 30°C的步骤。9. 权利要求1所述化合物或权利要求5所述化合物在制备线粒体祀向超氧自由基探针 中的应用。10. 权利要求1所述化合物或权利要求5所述化合物在线粒体祀向超氧自由基检测和 线粒体祀向成像中的应用。
【文档编号】C07F9/6561GK105985379SQ201510071288
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月11日
【发明人】黄赛朋, 杜立波, 刘扬
【申请人】中国科学院化学研究所