一种线粒体靶向型pH荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于荧光素的线粒体靶向型pH荧光探针。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着生物成像技术的不断发展，荧光探针越来越多地应用于细胞标记及 成像、蛋白质分析、医学诊断、生物传感等研究领域。荧光探针具有荧光量子产率高，光稳定 性好，生物兼容性好等优点，成为显微成像的理想工具。
[0003] pH值是人体内一个重要的生理参数，参与了许多生理过程，比如接受调控信号转 换、酶活性、细胞生长、离子运输、离子调控、细胞粘附等。它的变化会影响机体的健康，例 如酸性pH与炎症和肿瘤疾病相关。
[0004] 线粒体控制着细胞凋亡的激活系统，是细胞呼吸的主要场所，在细胞的生命周期 中扮演重要角色，三羧酸循环和氧化磷酸化都是在线粒体中进行的。线粒体不仅是细胞内 能量产生的主要场所，还是氧自由基产生的重要部位。线粒体的数量与形状不但与细胞的 种类有关，也与代谢活动和相关疾病密切相关。因此，实现线粒体的可视化观测对于了解 细胞生命活动及疾病的预防和治疗具有重要意义。线粒体存在于大多数的真核细胞中，一 般呈短棒状或圆球状，也有环状、线状、哑铃状、分杈状、扁盘状等，大小不一，在光学显微镜 下需要经过特殊染色才能看见。一般来说，用于生命科学研究的理想染料需要符合以下要 求：较高的焚光量子产率，有良好的生物相容性，稳定性和低毒性。目前，用于活细胞内 线粒体靶向成像的荧光探针种类还不是很多。因此开发线粒体靶向型荧光探针具有广阔的 前景。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种线粒体靶向型pH荧光探针，该荧光探针分子能够快速的 定位于线粒体中用于活细胞的荧光显微成像。
[0006] 本发明采用的技术方案为：
[0007] -种线粒体靶向型pH荧光探针，所述荧光探针为FDI荧光探针，FDI荧光探针的 结构通式如（I)所示：
[0008]
[0009] 所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，所述FDI荧光探针的合成方法包括如下步 骤：
[0010] 将荧光素烯醛与2, 3, 3-三甲基-吲哚，分别加入到无水乙醇中，在氮气保护下加 热回流反应7-10小时，反应液冷却后旋干，经硅胶柱层析提纯得到目标产物FDI。其中荧光 素烯醛与2, 3, 3-三甲基-吲哚的比为1:1，硅胶柱层析提纯中的洗脱剂为甲醇：二氯甲烷 =1:10,硅胶柱为300-400目。
[0011] 所述荧光素烯醛的制备方法为：
[0012] (1)将荧光素溶于甲醇中，再加入15-冠醚-5和三氯甲烧，恒压滴加质量分数为 33% NaOH溶液，再升温至55°C回流反应10h。在(TC将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2， 出现絮状沉淀，过滤得黄色固体，经硅胶柱层析干法上样提纯得到荧光素单醛，洗脱剂为乙 酸乙酯：二氯甲烷=1 :1〇,硅胶柱为300-400目；
[0013] (2)将荧光素单醛，甲酰基亚甲基三苯基磷烷，溶于氯仿，氮气保护，加热50°C，冷 凝回流24h，反应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素烯醛，洗脱剂为甲 醇：二氯甲烷=1:9,硅胶柱为300-400目。
[0014] 上述这种荧光探针的制备反应式如下：
[0015]
[0016] 本发明另一目的是一种线粒体靶向型pH荧光探针在细胞内线粒体的荧光显微成 像中的应用。所述细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264. 7细胞株。
[0017] 本发明具有以下有益效果：
[0018] 本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中，具有较好的化学稳定性，较 好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对 细胞和生物体无毒副作用。
【附图说明】
[0019] 图1是实施例1制备的FDI荧光探针对不同pH值的吸收光谱响应。
[0020] 图2是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为1. 99-10. 36范围的吸收光谱变化。
[0021] 图3是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为10. 36-13. 69范围的吸收光谱变 化。
[0022] 图4是实施例1制备的FDI荧光探针对不同pH值的荧光光谱响应。
[0023] 图5是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为1. 99-5. 34范围的荧光光谱变化。
[0024] 图6是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为5. 77-13. 17范围的荧光光谱变化。
[0025] 图7是实施例1制备的FDI荧光探针在线粒体中的荧光共聚焦显微成像。
【具体实施方式】
[0026] 实施例--种线粒体靶向型pH荧光探针
[0027] 制备方法如：
[0028] (1)荧光素单醛的制备：焚光素 （lg 3. 16mmol)溶于7ml甲醇，再加入0. 2ml的 15-冠-5和4ml的三氯甲烷，恒压滴加质量分数为33%的NaOH溶液，再升温至55°C回流反 应10h，在(TC将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2,出现絮状沉淀，过滤得黄色固体，经硅胶 柱层析干法上样提纯（洗脱剂乙酸乙酯：二氯甲烷=I :l〇Rf = 0. 33 ;Si02300-400目），得 到0· 2183g的目标产品，产率19%。MS :360. 0634。
[0029] (2)荧光素烯醛的制备：荧光素单醛（0· 1059g，0· 2941mmol)，甲酰基亚甲基三苯 基磷烷（0. 1105g，0. 3634mmol)，溶于氯仿（25ml)，氮气保护，加热50°C，冷凝回流24h，反 应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯（洗脱剂甲醇：二氯甲烷=l:9Rf = 0.42; Si02300-400 目），得到 0· 0721g 的目标产品，产率 63%。MS :386. 0790。
[0030] (3)FDI 的制备：荧光素烯醛（0.0721g，0. 18mmol)，N-R-2,3,3-三甲基-3H-吲 哚（0. 0566g，0. 18mmol)，加入到无水乙醇中，氮气保护下加热回流反应7-10小时，反应 液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯（洗脱剂二氯甲烷：甲醇=10: IRf = 0.28 ; Si02300-400 目），得到 40. 97mg 的目标产品，产率 42%。MS :669. 1012。
[0031] 实施例二一种线粒体靶向型pH荧光探针对pH响应检测
[0032] 将实施例1中制备的FDI荧光探针溶于乙醇水溶液中，配制浓度为2X 10-5M的 FDI乙醇溶液，其中乙醇与水的体积比5:5。逐次调节FDI乙醇溶液pH，可见溶液的颜色随 着PH值增加由黄色变为墨绿色最后变为红色。
[0033] 各次溶液进行紫外分光光度法测试，将所得数据汇总绘制出FDI荧光探针对不 同pH值响应的吸收光谱，如图1所示。调节FDI乙醇溶液pH由1. 99, 2. 66…逐渐升高至 10. 36,可见溶液吸收光谱454nm处的波峰由454nm红移至489nm，且峰值随pH值的增加由 0. 46升高至0. 97,624nm处随pH值的增加由无波峰至逐渐出现波峰，峰值升高至0. 38,如 图2所示。调节FDI乙醇溶液pH由10. 36逐渐升高至13. 69,可见溶液吸收光谱在489nm 处的波峰继续红移，且峰值随pH值的增加而降低至0. 75,624nm处的波峰峰值随pH值的增 加而降低至0. 08,如图3所示。由图2、图3可知FDI荧光探针对于pH在吸收上有响应，pH 值的改变可使FDI颜色发生改变。
[0034] 各次溶液进行荧光分光光度法测试，将所有数据汇总绘制出FDI荧光探针对不同 pH响应的荧光光谱，如图4所示。调节FDI乙醇溶液pH由1. 99逐渐升高至5. 34,可见溶 液荧光光谱在672nm处的波峰的荧光强度随pH值的增加由158升高至686,如图5所示。 调节FDI乙醇溶液pH由5. 34…逐渐升高至13. 17,可见溶液荧光光谱在672nm处的波峰荧 光强度随pH值的增加降低至35,如图5所示。由图4、图5可知FDI荧光探针对于pH在荧 光上有响应，pH值的改变可使FDI荧光强度发生改变。
[0035] 实施例三一种线粒体靶向型pH荧光探针用于活细胞的荧光显微成像
[0036] 向含有MCF-7或RAW264. 7(Hela)细胞株的培养皿中，加入浓度为加入实施例2中 浓度为2 X 10 5M的FDI乙醇溶液，与细胞培养液混合均匀后，使FDI在培养液中的终浓度达 到10uM。染色5min后，用pH = 7. 2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，然后将该培养皿置 于37°C恒温培养箱中进行孵育24小时，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。实 验结果发现，染有FDI的Hela细胞线粒体中呈现出明显的荧光，如图7所示。实验结果表 明，FDI能进入细胞，具有较好的细胞膜透过性，且FDI可以定位于线粒体，能够检测细胞线 粒体中的pH。
【主权项】
1. 一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为FDI荧光探针，FDI荧 光探针的结构通式如（I)所示： 其中，R= -CH3, -CH2CH3。2. 如权利要求1所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述FDI荧光探针 的合成方法包括如下步骤： 将荧光素烯醛与2, 3, 3-三甲基-吲哚，分别加入到无水乙醇中，在氮气保护下加热回 流反应7-10小时，反应液冷却后旋干，经硅胶柱层析提纯得到目标产物FDI。3. 如权利要求2所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，硅胶柱层析提纯中 的洗脱剂为甲醇：二氯甲烷=1:10,硅胶柱为300-400目。4. 如权利要求2所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述荧光素烯醛与 2, 3, 3-三甲基-吲哚的比为1:1。5. 如权利要求2所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述荧光素烯醛的 制备方法为： ⑴将荧光素溶于甲醇中，再加入15-冠醚-5和三氯甲烧，恒压滴加质量分数为33%NaOH溶液，再升温至55°C回流反应10h，在0°C将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2,出现絮 状沉淀，过滤得黄色固体，经硅胶柱层析干法上样提纯得到荧光素单醛； (2)将荧光素单醛、甲酰基亚甲基三苯基磷烷，溶于氯仿，氮气保护，加热50°C，冷凝回 流24h得反应液，反应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素烯醛。6. 如权利要求5所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述步骤（1)中硅 胶柱层析干法上样提纯中的洗脱剂为乙酸乙酯：二氯甲烷=1 :1〇,硅胶柱为300-400目。7. 如权利要求5所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述步骤（2)中硅 胶柱层析提纯中的洗脱剂为甲醇：二氯甲烷=1:9,硅胶柱为300-400目。8. 如权利要求1所述一种线粒体靶向型pH荧光探针在细胞内线粒体的荧光显微成像 中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264. 7细胞株。
【专利摘要】本发明公开一种线粒体靶向型pH荧光探针，所述荧光探针为FDI荧光探针，FDI荧光探针的结构通式如(I)所示。本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中，有较好的化学稳定性，较好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
【IPC分类】A61K49/00, G01N21/64, C09K11/06, C07D405/06
【公开号】CN105018074
【申请号】CN201510424889
【发明人】于海波, 李红玲, 宋有涛, 吕春娇, 方沛菊, 赵梓旭, 李谷丽, 范建情
【申请人】辽宁大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月20日