一种靶向酵母线粒体的穿梭载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种靶向酵母线粒体的穿梭载体，其是一种用于酵母线粒体复制子、启动子、蛋白表达等功能研究的线粒体穿梭载体，本发明基于密码子优化，构建了一种线粒体穿梭载体，利用氯霉素筛选的方法，将线粒体复制子ori5构建到该载体上，验证了其用于线粒体复制子筛选的功能；结果表明其能够利用氯霉素筛选转化到酿酒酵母线粒体中，并检测到ori5的复制子功能，构建的载体能够用作靶向酵母线粒体的穿梭载体、线粒体复制子和启动子的诱捕载体、酵母线粒体复制子和启动子功能的研究工具。
【专利说明】
一种靶向酵母线粒体的穿梭载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子克隆【技术领域】，具体涉及一种靶向酵母线粒体的穿梭载体及其应用。
【背景技术】
[0002]线粒体是一种半自主细胞器，其中含有线粒体DNA (mtDNA)，能够进行自主复制。根据前人的研究，酿酒酵母线粒体DNA中有8个潜在的复制起始序列(Origin ofRecognit1n, ori)或复制子(replicon) (Tracy R L ei aL, Current genetics, 1995,28(3): 205-216)。1941年就有研究者使用氰化物处理酵母菌，第一次发现了酿酒酵母的呼吸突变现象，随后发现了酿酒酵母小菌落突变型(petite mutant)，该突变表现为酿酒酵母在酵母浸出粉腺葡萄糖培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium ,YPD 或 YPED)上生长产生的菌落较正常菌落小。而随后的研究发现，该小菌落突变型往往表现为线粒体功能的下降甚至完全缺失，其中有些突变类型涉及到线粒体基因组突变，一般是线粒体基因组编码基因的大量缺失突变，导致线粒体蛋白合成障碍，进而导致线粒体呼吸链破坏引起线粒体氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylat1n , 0XPH0S)水平下降。从而在平板上表现为菌落变小。
[0003]随后的研究者从酵母小菌落突变型中扩增获得含有自主复制序列样片段(autonomously replicating like sequence, ARS - like) (Delouya D et aL, Yeast,1991, 7(1): 51-60),研究者一般使用一种称为超抑制小菌落(supersuppressivepetites)的技术，通过自发突变获得的线粒体突变体，该突变体含有一种缺失突变线粒体，因为不能合成线粒体所需的蛋白质，但是可以正常完成突变的线粒体DNA的复制，因此含有复制起始序列。通过对该缺失突变DNA进行分析，获得预测的复制子序列，利用酵母菌杂交技术与含有正常线粒体的酵母株进行杂交，在杂交后代中出现小菌落的数目和抑制程度，称为抑制率。因此，如果缺失突变体中含有的复制子复制能力越强，那么我们可以推断其抑制率越高。对诱变获得的不同突变株进行的研究最终获得8种潜在复制子功能的序列。
[0004]该方法通过子代中缺失突变体和正常线粒体基因组复制竞争，推断突变体中共同含有的复制子序列，是一种有效研究复制子功能的方法。然而该方法属于非直接的方法，这样获得的复制子仅属于推断，虽然之后的获得复制子通过序列分析，发现有高度同源序列。然而并没有直接的对线粒体复制子进行功能研究。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了解决如何利用分子生物学手段对线粒体复制子进行功能研究，提供了一种经过密码子优化的靶向酵母线粒体的穿梭载体，该穿梭载体包括大肠杆菌的质粒复制子、大肠杆菌抗性筛选基因、酵母线粒体启动子、酵母线粒体复制子、酵母的抗性筛选基因。
[0006]所述大肠杆菌质粒复制子是？]\^1、？154、？3(:101、&)把1或？1￥01。
[0007]所述大肠杆菌抗性筛选基因是氨苄青霉素基因、四环素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或红霉素基因。
[0008]所述酵母线粒体启动子是p75或Prail。
[0009]所述酵母线粒体复制子是oril、ori2> ori3> ori4> ori5> ori6> ori7 或 ori8。
[0010]所述酵母抗性筛选基因是新霉素基因、Zeocin基因、氯霉素基因、Neocin基因或G418基因。
[0011]所述靶向酵母线粒体的穿梭载体核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本发明另一目的是将靶向酵母线粒体的穿梭载体应用在酵母线粒体转化中。
[0013](I)本发明提供了一种利用密码子优化技术对氯霉素抗性基因(CAT)进行优化方法，使得外源基因能够在线粒体中特异性表达。
[0014](2)本发明通过上述方法进行优化后，提供了用于构建线粒体穿梭载体方法。
[0015](3)基于构建的线粒体穿梭载体,克隆线粒体复制子ori5并构建到上述载体,验证了其具有线粒体复制子功能。
[0016]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
1、本发明使用一种直接的方法验证了线粒体复制子功能；比超抑制小菌落技术，提供了更为直接的分子生物学手段验证线粒体复制子功能；
2、利用该载体可以根据本发明中提供的密码子优化方案对外源蛋白在线粒体中表达提供方法；
3、使用本发明提供的线粒体穿梭载体和方法，可用于线粒体复制子诱捕，发现新的线粒体复制子甚至增强子等基因元件。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明中P-CAT’-T-18T测序结果比对结果(上:预期序列；下:实际测得序列)；
图 2 为 PCR 扩增 pUC，图中:1: DNA Marker DL5000 ；2:pUC 扩增产物；
图3为酶切鉴定pMT-D的结果，其中1: pMT-D的酶切产物；2:DNA Marker DL5000 ；图4为pMT-D质粒图谱，Amp:氨苄青霉素抗性基因；MCS:多克隆位点；CoIE1:大肠杆菌复制子；P_CAT’ -T:线粒体筛选氯霉素抗性基因；
图 5 为 PCR 扩增 ori5，其中 1: DNA Marker DL2000 ；2: ori5 扩增产物；
图6为pMT I载体图谱，Amp:氨苄青霉素抗性基因；MCS:多克隆位点；CoIE1:大肠杆菌复制子；P_CAT’ -T:线粒体筛选氯霉素抗性基因；mt or1:线粒体复制子；
图7为PCR鉴定pMT I在线粒体中的复制，其中1: DNA Marker DL2000 ；2:阴性对照；3:阳性对照；4-10: pMT I的PCR产物;
图8为验证pMT I在线粒体中的复制，其中A为阳性对照，B为阴性对照，C-D为pMT1/INVSc I 的 mtDNA ；
图9为酶切验证来源于酵母线粒体中的pMT 1，其中Lane 1: DNA Marker DL5000 ；2:阳性对照；3-6: pMT I。
【具体实施方式】
[0018]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的分子生物学方法，特别是本发明提供的载体构建和密码子优化方面，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
[0019]实施例1:氯霉素抗性基因CAT的线粒体表达优化
为构建用于线粒体载体的穿梭载体，对抗性基因CAT进行了密码子优化；利用在线工具 Codon Usage Database (http://www.kazusa.0r.jp/codon/)获得酿酒酵母线粒体密码子使用频率，并据此优化CAT基因，获得线粒体密码偏好基因CAT’，其序列如序列表SEQID NO:1所示，由上海捷瑞生物工程有限公司进行全基因合成。同时添加细胞色素氧化酶C(cytochrome c oxidase, COX)亚基 II 启动子 75 bp 序列(p75)(序列见 GenBank,登录号:V00706.1)，通过延伸PCR的方法将其融合表达于CAT’上游，C0X2终止子120 bp序列，通过延伸PCR的方法将其融合表达于CAT’下游，合成引物为pCOXTl’:5’ -TTTTAATAATTAAAAATATTAATAATAAGTAAATATTAATTACGCTCCACCTTGTCATT-3 ^ ；pC0XTl:5’- ATTTAAGAATATTATTATAATTATTATTATTATT
ATTATTTTTAATAATTAAAAATA -3 ^ ；pC0XT2:5’-TATAAGGTGATTGAATAGAATATAAATCTATATCTTTATTATATTTAAGAATATTATTA-3 ^ ;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用PCR方法融合启动子、终止子及优化后基因。将扩增产物通过TA克隆到pMD18-T载体(购买于Takara公司，D101A)上，经过测序公司(委托上海生工)测序结果显示与预期序列一致(见图1)。
[0020]实施例2:线粒体穿梭载体pMT-D的构建
设计引物 pUl:5’_ GGAATTCGCGGCCGCCATTAATGAATCGGCCAAC -3 ^ ;pU2:5’-CCCAAGCTTGGCACTGGCCGTC -3 '，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。使用PCR扩增的方法，以PUC18 (购买于Takara公司，3218)为模板，反应体系:上、下游引物各0.25pm/ μ L,0.4mmol/μ L 的 dNTP, 2 ng/μ L 的质粒模板，5 U/100 μ L pfu DNA 聚合酶，IXpfu buffer,总体积为25 μ L0按下面进行反应:93°C，3min预变性；93°C,30s ；59°C,40s ;72°C，lmin反应30个循环；最后72°C延伸10mi。反应结束后进行电泳，EB染色，结果与预期结果一致(见图2)。胶回收后，与实施例1中所得片段分别酶切，体系:片段400ng，I (购买于Takara 公司，1040A)、M/e I (购买于 Takara 公司，1161A)各 5 U/100 μ L，I XH buffer，总体积为200yL。于37°C酶切3h。回收后进行连接，体系片段各lOOng，T4 DNA Ligase (购买于 Takara 公司，2011A)25U/10 μ L, 1XT4 DNA Ligase buffer，总体积为 10 μ L，16°C连接过夜，使用常规热休克转化法进行转化。
[0021]转化后，对转化子增菌，抽提质粒，然后进行酶切鉴定，结果与预期一致(图3)。将构建好的载体命名为PMT-D (图4)，该载体序列如SEQ ID N0:2所示。
[0022]实施例3:线粒体DNA的提取
为扩增线粒体复制子ori5序列，本发明以酿酒酵母线粒体基因组DNA (mtDNA)为模板扩增ori5片段。
[0023]本发明以酿酒酵母INVSc I (购买于Invitrogen公司，K5050-01)为材料，28°C培养36h。取ImL菌液，9000g离心获得细胞，用无菌水洗涤菌体。用lmol/L的山梨醇(购买于上海生工，SB0491)溶液悬起细胞，按照30mg每g酵母湿重添加蜗牛酶(购买于上海生工，SB0870)到菌悬液，37°C消化2h。9000g离心收集细胞，用Tr1n裂解缓冲液(I %Tr1n-XlOO, pH:7.2) 0.5mL小心悬起，上下颠倒混匀。室温静置10分钟，5000g离心收集上清，加入等体积酹氯仿，震荡混勻，12000r/min离心I分钟，转移上清，乙醇沉淀DNA,用60 μ L无菌水悬起。
[0024]实施例4:线粒体复制子ori5的扩增及构建
为了验证实施例2中构建的线粒体穿梭载体能否用于线粒体复制子研究，本发明利用PCR扩增的方法克隆获得了线粒体复制子ori5序列，将其构建到pMT-D载体。用于进一步验证其功能。
[0025]设计引物p0RIl:5’- GCATGCAAATTCATATGATTATTAT -3 ^ ;p0RI2:5’-GTCGACTATAAATAAGTTAATATTTTAT _3入引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以实施例3中获得的mtDNA为模板扩增酿酒酵母线粒体复制子ori5。反应体系:上、下游引物各0.25pm/y L，0.4mmol/y L 的 dNTP，2 ng/μ L 的 mtDNA 模板，5 U/100 μ L taq DNA 聚合酶(购买于Takara公司，DR001A)，I X taq buffer,总体积为25 μ L。按下面进行反应:93°C，3min 预变性；93°C,30s ；43°C,40s ;72°C，Imin 反应 30 个循环，最后 72°C延伸 1min0 反应结束后进行电泳，EB染色。结果显示，能够扩增出预期大小条带，后续测序显示与预期序列一致(图5)。
[0026]随后将上述片段回收，利用限制性酶切对载体及片段进行酶切，体系:片段AQQng,Sal I (购买于 Takara 公司，1080A)、5M I (购买于 Takara 公司，1246A)各 5 U/100UL,IXH buffer，总体积为200 μ L。于37°C酶切3h。回收后进行连接，体系片段各lOOng，T4 DNA Ligase (购买于 Takara 公司，201 lA)25u/10 μ L, 1XT4 DNA Ligase buffer，总体积为10 μ L，16°C连接过夜。
[0027]转化后，对转化子增菌，抽提质粒，然后进行酶切鉴定，结果与预期一致。将构建好的载体命名为PMT I (图6)。
[0028]实施例5:pMT I转化酿酒酵母线粒体并PCR鉴定
为验证pMT-D用于线粒体复制子研究的功能，以实施例4中构建的含有ori5的线粒体穿梭载体PMT 1，转化酿酒酵母INVSc I，筛选获得转化子并初步对转化子进行PCR鉴定。
[0029]将40yg质粒pMT 1，与新制备的感受态细胞混合，通过电转化(电击参数:1500V，200V，25 μ F)的方法转化到酿酒酵母中，在氯霉素浓度为0.lmg/mL的YPG培养基(Peptone2%, Yeast Extract I %、甘油3 %、Agar 2 %)上进行筛选，获得转化子。PCR扩增CAT’基因检验pMT I是否转化到线粒体中。反应体系:上、下游引物0.25pm/yL，0.4mmol/yL的dNTP, 2 ng/μ L的线粒体总DNA模板，5 U/100 μ L taq DNA聚合酶，I X buffer，总体积为25 μ Lo 按下面进行反应:93°C，3min 预变性；93°C，30s ；50°C, 40s ；60°C，2min 反应 30 个循环，最后60°C延伸20min。反应结束后进行电泳，EB染色。
[0030]结果显示，pMT I成功转化入线粒体中(图7)，能够在酵母线粒体中自主复制，ori5具有复制子功能。
[0031]实施例6:进一步验证pMT I在线粒体中的复制
以实施例5中获得的线粒体总DNA，取10 μ L转化大肠杆菌感受态细胞混合，冰浴20min，42°C热激2min，冰上处理2min，涂布平板。能够获得转化子(图8)，将上述获得的转化子提取质粒，进行酶切鉴定，体系:质粒200ng，I ,Sph I各5 U/100 μ L, I XHbuffer,总体积为 100 μ L。
[0032]结果显示，酶切获得片段与pMT I酶切片段大小一致(图9)，表明该载体在线粒体中获得复制，而且氯霉素抗性基因也在酵母线粒体中获得了表达。因此，PMT-D载体可进一步用作靶向酵母线粒体的穿梭载体、线粒体复制子和启动子的诱捕载体、酵母线粒体复制子和启动子功能的研究工具。
【权利要求】
1.一种靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征在于:包括大肠杆菌的质粒复制子、大肠杆菌抗性筛选基因、酵母线粒体启动子、酵母线粒体复制子、酵母线粒体抗性筛选基因。
2.根据权利要求1所述的靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征在于:大肠杆菌质粒复制子是 pMBl、pl5A、pSC101、ColEl 或 pWVOl。
3.根据权利要求1或2所述的靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征在于:大肠杆菌抗性筛选基因是氨苄青霉素基因、四环素基因、氯霉素基因、卡那霉素基因、新霉素基因或红霉素基因。
4.根据权利要求3所述的靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征在于:酵母线粒体启动子是p75或Poxil。
5.根据权利要求4所述的靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征在于:酵母线粒体复制子是 oril、ori2、ori3、ori4、ori5、ori6、ori7 或 ori8。
6.根据权利要求5所述的靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征在于:酵母抗性筛选基因是新霉素基因、Zeocin基因、氣霉素基因、Neocin基因或G418基因。
7.根据权利要求1所述的靶向酵母线粒体的穿梭载体，其特征是:靶向酵母线粒体的穿梭载体核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
8.权利要求1所述靶向酵母线粒体的穿梭载体在酵母线粒体转化中的应用。
【文档编号】C12N15/81GK104450768SQ201410653603
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】井申荣, 马贵兴, 黄芬, 曾韦锟 申请人:昆明理工大学