靶向线粒体的抗肿瘤五环三萜衍生物及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一类五环三萜衍生物，其结构式如式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)、式(Ⅳ)或式(Ⅴ)所示：其中，R1为氢、甲酰基、乙酰基或(n＝1?19)，R2为(n＝1?19)，R3为羟基，甲氧基或乙氧基，R4为(n＝1?19)。本发明的化合物具有较好的抗肿瘤活性，通过将天然化合物靶向至线粒体，能更好的应用于抗肿瘤药物的开发。且化合物为盐类，大大提高了药物的水溶性及改善其药代动力学参数。
【专利说明】
革田向线粒体的抗肿瘤五环H瞄衍生物及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明设及一类祀向线粒体的抗肿瘤五环=祗衍生物及其制备方法与应用，具体 设及白枠醇、白枠酸、齐墳果酸、熊果酸和乳香酸的TPP衍生物及其制备方法与应用，属于医 药技术领域。
【背景技术】
[0002] 线粒体作为细胞内十分重要的一类细胞器，不仅承担着为细胞供能的工作，还是 控制细胞程序性死亡(又称细胞调亡）的重要细胞器。研究表明，多数抗肿瘤药的作用机制 与引发肿瘤细胞调亡有关。而线粒体在肿瘤细胞和正常细胞相比，发生了一些形态和生理 功能的变化，比如糖酵解变为主要供能方式，mtDNA发生突变，ROS增多及线粒体膜电位增高 等巧uropean Journal of BiochemistiT, 1999,264,687-701.)。肿瘤细胞中线粒体的运一 系列变化使得我们将药物特异性地祀向至肿瘤细胞的线粒体中并进一步引发调亡成为可 能。目前为止常见的将抗肿瘤化合物运载至线粒体的方法主要有=类：纳米载体，多肤载 体，及电子移位亲脂性阳离子（Delocalized Lipophilic Cation ,DLC)等（Molecular nutrition&food research,2009,53,9-28；Environmental and molecular mutagenesis, 2010,51,462-75. )dDLC-般由一个亲水的带电中屯、和一个疏水的核屯、连接而成，利用肿瘤 细胞中线粒体远高于正常细胞的膜电位选择性积聚，从而达到特异性祀向至线粒体的目的 (Annual review of pharmacology and toxicology，2007,47,629-656.)。其中最常用的 DLC是S苯基麟(TPP)，目前已有多种抗肿瘤化合物与TPP连接后大幅提高其抗肿瘤活性或 改善肿瘤的抗药性。如白襲芦醇(化rrent陆armaceutical Desi即，2014,20,172-179)，没 食子酸(J.Med. Chem, 2014,57,2440-2454)等。
[0003] 很多五环=祗类化合物如乳香酸、齐墳果酸、白枠酸、白枠醇等本身具有广泛的生 理和药理活性，尤其在抗肿瘤方面有突出的表现(Molecule ,2015，20,1610-1625 ;Cancer Letters,2012,320,158-170)，W白枠酸、白枠醇为例（Journal of Applied Biomedicine， 2012,10,7-12)，白枠醇和白枠酸是大量存在于枠木科植物枠树里的一种五环=祗，其结构 式为：
[0004]
[0005] 已有研究表明，白枠酸、白枠醇的抗肿瘤机制与线粒体调亡途径有关，包括连续激 活caspases 9,3 ,和7，清除聚腺巧二憐酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase， PARP)，继而引发细胞色素 C和Smac蛋白由线粒体内膜上的释放，线粒体膜电位去极化，W及 调亡蛋白Bax和Bak的高表达等（Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology， 2009，105,425-432;Tumor,2012，32，2；M-238!Molecular Carcinogenesis，2010,49,630- 640;F*LoS0NE，2009,4，A;rticle ID e5361;0ncogene，2004,23,7611-7620;B;rit J 化ncer， 2010，103,43-51.)。
[0006] 但由于五环=祗类化合物普遍存在的生物利用度低，水溶性差等原因限制了它们 的临床应用。药学家们对它们结构进行了一系列改造 W期增强生物利用度及水溶性并增强 其抗肿瘤活性，（BioMed Research International ,2015,A;rticle ID 584189 !Medicinal Research Reviews，20 I 5，35，1 1 27 - 1 1 55;European Journal of Medicinal Chemis1:ry20l5,92,648-655.)。但目前将五环S祗类化合物直接祀向到线粒体从而引发肿 瘤细胞调亡的合成方法复杂，且未做深入的机制研究（Russian Chemical Bulletin, International Edition,2013,62,188-198.)〇
【发明内容】
[0007] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，通过两步合成反应将线粒体祀向载体 与五环S祗类化合物及其衍生物连接在一起，得到了系列五环S祗类化合物的TPP衍生物。 本发明的新化合物对肿瘤细胞的抑制活性强，还具有较好的水溶性，有利于药物的体内吸 收和发挥药效。本发明的化合物具有作为抗肿瘤药物的潜力。由此提供了下述发明：
[000引本发明的一个方面设及一类五环=祗衍生物，其结构式如式I、式n、式虹、式IV或 式V所示：
[00C
[0010] 其中，町为氨、甲酯基、乙酷基或.
n=l-19)，
[00川防巧
：n=l-19)，R3为径基，甲氧基或乙氧基，R4夫 (n = l-19) O
[0012]上述化合物的实例如下：
[0013
[0014]本发明的另一方面设及上述五环=祗衍生物的制备方法，其反应路线如下所示： [001引式I制备路线：
[0016]
[001
[001
[001
[00方
[0021]
[0022]
[0024] 式虹、IV其他化合物制备方法同式n。 [00巧]式V制备路线：
[0023]
[0026]
[0027] 式V其他化合物通过酷氯试剂酷化法制备。
[0028] 所述方法包括：W五环=祗化合物为起始原料，使五环=祗化合物的至少一个径 基进行醋化反应，得中间体化合物，然后将中间体化合物与=苯基麟发生成盐反应，生成式 I、式n、式虹或式IV所示的五环=祗衍生物；
[0029] 或者，将S苯基麟与1,5-二漠戊烧在乙腊中发生成盐反应，然后将成盐反应的产 物与乙二胺在四氨巧喃中发生取代反应;将乳香酸与氯化亚讽发生醋化反应后，再与上述 取代反应的产物进行酷胺化反应，生成式（V)所示的五环=祗衍生物。
[0030] 上述方法，生成式（I)、式（n)、式（虹）或式(IV)所示的五环=祗衍生物的过程中， 所述醋化反应采用的是抓C/DMAP法，W二氯甲烧作为溶剂，室溫下反应，五环S祗化合物、 EDC(l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）、DMAP(4-二甲氨基化晚）与5-漠戊酸和 二氯甲烧加入量的比为：Imo 1: (2.5-2.6 )mo 1: (0.4-0.5 )mo 1: (4-4.1 )mo 1:2000mL。
[0031] 上述方法，生成式（I)、式（n)、式（虹）或式(IV)所示的五环=祗衍生物的过程中， 所述成盐反应是W乙腊作为溶剂，中间体化合物、S苯基麟和乙腊加入量的比为1111〇1:(3- 3.1 )mo 1:1 OOOmL，70-80 °C 加热回流。
[0032] 上述方法，生成式（V)所示的五环=祗衍生物的过程中，=苯基麟、1,5-二漠戊烧 和乙腊加入量的比为：1111〇1:(5-5.2)111〇1:2000111^70-80°(：加热回流1211，得成盐反应的产 物。
[0033] 上述方法，生成式（V)所示的五环=祗衍生物的过程中，成盐反应的产物、乙二胺 和四氨巧喃加入量的比为：Imol: (5-5.2)mol: ISOOmL，室溫反应化，得取代反应的产物。
[0034] 上述方法，生成式（V)所示的五环=祗衍生物的过程中，所述醋化反应的反应条 件为：11-幾基-e-乙酷乳香酸Imol在1000 mL氯化亚讽中80°C加热回流化，蒸除溶剂。
[0035] 上述方法，生成式（V)所示的五环=祗衍生物的过程中，所述酷胺化反应的反应 条件为:将醋化反应的产物用2000mL二氯甲烧溶解后，(TC冰浴下缓慢滴加取代反应的产物 和=乙胺各3mol，室溫揽拌2地。
[0036] 当式I的Ri为甲酯基或乙酷基时，所述方法还包括将五环=祗化合物的一个径基 进行醋化反应后，再通过酷氯试剂酷化法制备的步骤。
[0037] 当式n、式虹或式IV的R3为甲氧基或乙氧基时，所述方法还包括将五环=祗化合 物的一个径基进行醋化反应后，再通过面代控与簇基的醋化反应制备的步骤。
[0038] 上述方法中，所述五环=祗化合物选自白枠醇、白枠酸、齐墳果酸、熊果酸和乳香 酸。
[0039] 本发明还提供上述五环=祗衍生物在制备抗肿瘤类药物中的用途。
[0040] 本发明的再一方面设及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的五环=祗 衍生物。
[0041 ]优选的，所述药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0042] 优选的，所述载体包括如生理盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或它们的组 合物;赋形剂可W选自憐酸巧，硬脂酸儀，滑石粉，糊精，淀粉，凝胶纤维素，甲基纤维素，簇 甲基纤维素钢盐或聚乙締化咯烧酬。
[0043] 优选的，所述药物组合物为固体口服制剂或肠胃外给药制剂。
[0044] 进一步优选的，所述药物组合物为片剂、分散片、肠溶片、巧嚼片、口崩片、胶囊、糖 衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。
[0045] 术语"组合物"意指包括包含指定量的各指定成分的产品，W及直接或间接从指定 量的各指定成分的组合产生的任何产品。
[0046] 通常本发明药物组合物含有0.1 -90重量％的本发明五环=祗衍生物。药物组合物 可根据本领域已知的方法制备。
[0047] 我们已经发现，根据本发明制备的五环=祗衍生物是可W用于制备预防和/或治 疗肿瘤的药剂。
[0048] 因此，本发明的另一个主题是，一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括施用治疗有效 量的如上所述的式（I)、式（n)、式（虹)或式(IV)的五环=祗衍生物。
[0049] 本文使用的术语"治疗有效量"表示，治疗、改善疾病或病症，或者表现出可检测的 治疗效果所需的治疗剂的量。
[0050] 本发明的化合物在相当宽的剂量范围内是有效的。实际服用本发明式（I)所示的 化合物的剂量可由医生根据有关的情况来决定。运些情况包括:被治疗者的身体状态、给药 途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。
[0051] 本发明的有益效果：
[0052] 本发明的五环S祗及其衍生物的TPP衍生物，其制备方法简单，工艺稳定，可操作 性强，原料可从植物中提取，亦可由成熟的化学合成工艺转化得到。
[0053] 药理活性实验证明该系列结构改造化合物具有较好的抗肿瘤活性，通过将天然化 合物祀向至线粒体，能更好的应用于抗肿瘤药物的开发。且化合物为盐类，大大提高了药物 的水溶性及改善其药代动力学参数。
【附图说明】：
[0054] 图1:化合物1-曰、化合物I-b与白枠醇的ICso(IiM)比较结果；
[0055] 图2:化合物Il-a与白枠酸的眼〇(山〇比较结果；
[0化6] 图3 :化合物I-a，I-b，Il-a，W及白枠醇、白枠酸对A549细胞在扣M浓度下的抑制 率.
[0057] 图4:不同浓度下化合物I -a对K562细胞形态的变化；
[0058] 图5:流式细胞术检测不同浓度化合物I-a诱发K562细胞调亡结果。
【具体实施方式】
[0059] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[0060] 实施例1:化合物I-a制备
[0061] 将白枠醇（1.0g，2.26mmol)与抓Ca.09g，9.04mmol)、DMAP(112mg，0.90mmol)、5- 漠戊酸（1.68g，9.04mmol)混合置于100ml圆底烧瓶中，加入40ml二氯甲烧，常溫反应约llh， TLC检测反应达平衡，加入S蒸水洗S次后有机相用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫酸钢， 减压浓缩，硅胶柱层析得化合物1的白色粉末250mg，将此白色粉末溶于IOml乙腊中，加入 325mg( 1.24mmol)TPP，油浴升溫至75-80°C，磁力揽拌2地后化C检测反应基本完全，减压蒸 干溶剂后，硅胶柱层析得产物白色晶体I-a 30mg Jata for I-a: Mp :87-99 °C [a ]d2d =巧.6。 (c0.1，Ol3〇H)，iHMffi(CDCl3,600MHz):7.89-7.85(m，6H)，7.79(ddd，J = 7.4，1.6,0.9Hz， 3H)，7.72-7.68(m，6H)，4.67(d，J=1.7Hz，lH)，4.58(s，lH)，4.20-4.15(m，lH)，4.00-3.92 (m，2H)，3.77(d，J=11.0Hz，lH)，3.18(dd，J=11.5,4.7Hz，lH)，2.42(t，J = 6.Wz，2H), 2.41-2.36(m,IH)，2.06-2.00(m，2H),1.66,1.00,0.97,0.95,0.82，0.76(s，3H)(6-CH3).Uc 匪R(CDCl3,150MHz)150.14,134.95,133.78,130.45,118.68,118.11,109.86,78.92, 77.25,77.04,76.83,62.55,55.26,53.45,50.33,48.73,47.69,46.35,42.67,40.85， 38.86,38.68,37.56,37.13,34.51,34.16,33.47,29.69,29.55,27.99,27.38,27.00, 25.48,25.15,22.78,22.45,22.04,20.76,19.09,18.27,16.06,15.38,14.74;皿-ESI-MS (m/z) :787.5231 [M-化]+。
[0062] 合成路线如下：
[0063
[0064] 实施例2:化合物I-b制备
[0065] 操作同化合物1-曰，得白色固体。Data forl-b :Mp : 145-154°C [a]D2〇 = +23.2° (C 0.1，C出OH)，Ih NMR(CD3OD 400MHz，）7.94-7.88(m，細）7.87-7.76(m，24H)4.73(S，IH)，4.61 (s，2H)，4.44(d，J = 5.1Hz，lH)，4.39(dJ=10.4Hz，lH)，3.83(dJ=11.0Hz，lH)，3.55- 3.44(m，5H)，2.49-2.38(m，5H)，1.97-1.84(m，5H).1.72 1.071.03 0.89 0.83 0.81(s，3H) (6-CH3).i3c 應R(CD30D，100MHz):173.59，173.10，149.98，134.95，133.45，130.20, I18.90,118.04,109.26,81.04,63.89,62.20,55.31,50.22,48.54,48.18,47.86,47.60， 47.22，47.20，47.10，47.00，46.36，42.45，41.85，40.71，38.09，37.54，36.84(S)，：M.18， 33.91,33.17,32.77,29.90,29.34,28.90,27.19,26.80,25.54,25.08,23.35,23.06, 22.78,21.71,21.39,20.87,20.54,17.94,15.71,15.28,13.87,13.10,10.08JR-ESI-MS (m/z):[(M-2Br)/2]+。
[0066] 合成路线如下：
[0067]
[006引实施例3:化合物I-C制备
[0069] 将白枠醇（5.0邑，11.3臟〇1)与抓(：（5.45邑，45.2臟〇1)、014口（560111邑，4.5臟〇1)、5-漠 戊酸（8.4g,45.2mmol)混合置于500ml圆底烧瓶中，加入200ml二氯甲烧，常溫反应约Uh， TLC检测反应达平衡，加入S蒸水洗S次后有机相用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫酸钢， 减压浓缩，硅胶柱层析得化合物1的白色粉末3g，取上述化合物1 1.19g溶于20mL甲酸中，油 浴升溫至85 °C回流揽拌化后化C检测反应基本完全，S蒸水洗掉溶剂，用二氯甲烧萃取S次 后机相用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫酸钢，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物3 700mg， 取上述化合物3 200111旨溶于101111乙腊中，加入325111旨（1.24111111〇1川?？，油浴升溫至75-80°(：，磁 力揽拌24h后化C检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，厚制备版制备得黄色化合物I- CIOOmgO
[0070] 合成路线如下：
[007
[007^」 头她例4:化甘物ii-a制街
[0073]将白枠酸（0.5g，1.09mmol)与抓 C(0.527g，2.73mmol)、DMAP(54mg，0.44mmol)、5- 漠戊酸（0.817g,4.36mmol)混合置于100ml圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烧，常溫反应约 1化，TLC检测反应达平衡，加入S蒸水洗S次后有机相用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫 酸钢，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物4的白色粉末250mg，将此白色粉末溶于IOml乙腊中， 加入292mg( 1.1 Immol)TPP，油浴升溫至75-80°C，磁力揽拌2地后化C检测反应基本完全，减 压蒸干溶剂后，硅胶柱层析，得白色固体II-aeData for II-a:Mp: 135-143°C[a]D2D = + 15.2°(c0.1，Ol3〇H)，iHNMR(CDCl3,400MHz)7.85(dd，J=12.6,7.5Hz，6H)，7.79(dd，J = 8.0,6.1Hz，3H)，7.69(td，J = 7.6,3.4Hz，6H)，4.73(s，lH)，4.61(s，lH)，4.37(dd，J=10.6， 5.8Hz，lH)，3.91(t J = 14.1Hz，2H)，3.01(td J=10.5,4.5Hz，lH)，2.38(t，J = 6.細z，2H)， 2.28(d，J=12.8Hz，lH)，2.18(td，J=12.6,3.4Hz，lH)，2.04(dd，J = 14.6,7.1Hz，2H)，1.96 (dd，J=16.4,7.1Hz，2H)，1.69,0.96,0.81 0.75,0.72(s，3H)(6-CH3).i3c 醒R(CDCl3, lOOMHz)，172.94，150.47，1：M.98，133.75，130.48，118.77，117.92，109.68，80.86，77.36， 77.05,76.73,65.31,56.33,55.38,50.37,49.29,46.94,42.41,41.96,40.67,38.36， 37.78,37.10,34.20,33.89,32.17,30.58,30.13,29.70,29.12,28.02,25.44,23.71, 23.35,23.10,22.85,21.98,20.87,19.37,18.13,16.56,16.13,14.65,14.10,11.1I;皿- ESI-MS(m/z):801.5020[M-化r。
[0074]合成路线如下：
[007
[0076] 实施例5:化合物n-b制备
[0077] 将白枠酸（1.0 g，2.19mmol)与抓C( I. 〇5g，5.47mmol)、DMAP( 108mg，0.88mmol)、5- 漠戊酸（1.63g, 8.76mmo I)混合置于200ml圆底烧瓶中，加入40ml二氯甲烧，常溫反应约I Ih， TLC检测反应达平衡，加入S蒸水洗S次后有机相用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫酸钢， 减压浓缩，硅胶柱层析得化合物4的白色粉末600mg，将此白色粉末300mg (0.48mmo 1)与CHsI (127.5化，L2.04mmol)、K2C03(284.5mg，2.04mmo 1)溶于20mL DMF中常溫反应2地后lie检测 反应结束，加入=蒸水洗掉DMF和K2CO3，有机相用二氯甲烧萃取，萃取=次后弃掉水层，有机 层用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫酸钢，减压浓缩，硅胶柱层析得化合物5的白色固体 20〇111邑，将此白色固体溶于1〇1111乙腊中，加入376111邑（1.2431111]1〇1川口口，油浴升溫至75-80°[，磁 力揽拌2地后化C检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，硅胶柱层析得产物乳黄色固体n-b。 Data forn-b:iH 醒R(MeOD 600MHz)S7.91-7.88(m，3H)，7.83-7.79(m，6H)，7.76(ddd，J = 8.2,5.5,2.8Hz，6H)，4.72(dJ=l.Wz，lH)，4.60(dJ=1.4Hz，lH)，4.40(ddJ=11.6, 4.9Hz，lH)，3.66(s，3H),3.51-3.44(m，2H),3.00(td,J=10.9,5.1Hz，1H),2.40(t,J= 7.1Hz，2H)，1.69(d，J = 7.Wz，3H)，1.01(s，3H)，0.94(s，3H)，0.86(s，3H)，0.80(s，3H)， 0.77( S，3H).UC 匪 R(MeOD 150MHz )5176.23,173.06,150.44,1:34.95,134.93,133.46， 133.39,130.23,130.14,118.74,118.16,108.91,81.06,59.64,56.34,55.38,50.43， 49.16,42.17,40.57,38.24,38.11,37.46,36.88,36.55,34.02,33.11,31.73,30.26， 29.36,27.16,25.64,25.52,25.42,23.34,21.68,21.66,21.27,20.92,20.71,18.16, 17.85，15.66，15.37，15.21，13.76，13.30;HR-ESI-MS(m/z):815.5176[M-^]+.
[0078]合成路线如下：
[0079
[0080] 实施例6:化合物V制备：
[0081 ]将TPP(2g，6.84mmo 1)与 1，5-二漠戊烧(4.7mL，34.2mmo 1)溶于20mL乙腊中，油浴升 溫至75-80°C，磁力揽拌1化后化C检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，硅胶柱层析得化合 物6的黄色油状液体2.8g。将该油状液体(2.8旨，5.69111111〇1)与乙二胺（1.91111，28.44111111〇1)溶 于30mL四氨巧喃中室溫揽拌化后化C检测反应基本完全，减压蒸干溶剂后，使用Sphadex LH-20凝胶柱分离得化合物7的黄色油状液体2g。取11-幾基-0-乙酷乳香酸(AKBA，80mg, 0.156111111〇1)溶于21]11^氯化亚讽中，油浴升溫至75-80°日，磁力揽拌化后化〔检测反应完全，将 氯化亚讽减压蒸干后，将产物溶于10血二氯甲烧中，加入S乙胺(64.祉L，0.468mmol)，冰浴 下缓慢滴加上述化合物7 221.2mg，30min后升至室溫揽拌12h后化C检测反应基本完全，减 压抽滤后，用2M HCl萃取S次，有机相用无水硫酸钢干燥化后抽滤除去硫酸钢，厚制备版制 备得黄色化合物VSOmgeData forV:Mp:148-157°C[a]D2〇 = +37.8° (C 0.1，C出0H)，1H NMR (CDCI3 600MHz)S7.80(dt J = 6.9,3.4Hz，3H)，7.77-7.73(m，細），7.70(tdJ = 7.8,3.細z， 6H)，7.44(d，J = 4.7Hz，lH)，5.50(s，lH)，4.10(q，J = 7.2Hz，lH)，3.81-3.75(m，lH)，3.61- 3.54(m，3H)，3.53-3.46(m，2H)，3.21-3.16(m，lH)，3.01(dd，J=10.8,7.0Hz，lH)，2.96- 2.86(m,3H),2.04(s,3H),1.31(s,3H),1.23(s,3H),1.14(s,3H),1.02(s,3H),0.92(s,3H), 0.79(s，3H) ,0.77 (d，J = 6.4Hz，3H).UC 醒 R(CDCl3 150MHz )5199.46,176.50,170.30， 164.90,135.20,135.18,133.57,133.51,130.62,130.53,130.45,118.27,117.70,73.96， 60.51,60.38,59.Ol,50.41,48.45,47.94,46.65,45.03,43.75,40.89,39.26,37.31， 36.57,34.86,33.96,32.93,30.88,29.66,28.87,27.48,27.11,26.68,26.57,24.56， 24.04,23.95,22.05,21.71,21.55,21.52,21.43,21.11,21.04,20.45,19.35,18.32, 17.40，14.17，13.09.HR-ESI-MS(m/z):885.5721[M-^] -。
[0082]合成路线如下：
[0083]
[0084] 实施例7 :白枠醇，白枠酸结构改造化合物与白枠醇，白枠酸抗肿瘤活性对照研究
[0085] 1.实验材料
[0086] 对照药物：白枠醇，白枠酸；
[0087] 实验药物:本发明实施例制备的化合物I-a，化合物I-b，化合物Il-a。
[0088] 细胞培养:K562细胞株：中科院上海细胞库，A549细胞株：山东大学药学院;RPMI- 1640培养液，胎牛血清：W色列Bioind;膜蛋白酶:美国Amresco公司;MTT(四甲基偶氮挫）， DMSO(二甲基亚讽）：美国Sigma公司;青霉素-链霉素溶液(100X，过滤除菌）：中国赛尔斯公 司;PBS(憐酸盐缓冲液）：索莱宝生物有限公司。
[0089] 仪器：酶联免疫检测仪：美国Bio-Rad ;移液器：法国Gi 1 son ;生物安全柜 ISOOseries A2,二氧化碳培养箱:美国化ermo公司；灭菌锅：日本松下。
[0090] 2.实验方法
[0091] 将人慢性髓原白血病细胞K562和人肺腺癌细胞A549在含10%胎牛血清，10011/1111 青霉素和lOOmg/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，培养在5%C02,饱和湿度的37°C培养箱 中。
[0092] 对于K562细胞:收集对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成 浓度为2 X 104/mL细胞悬液，接种在96孔培养板，每孔50化L，随后每孔加入用含10 %胎牛血 清的RPMI-1640培养液稀释的50化L不同浓度的化合物，每个浓度设3个对照。培养4她后，每 孔加入10化MTT溶液(0.5mg/ml，1 %MTT)。地后终止培养，使用平板离屯、机将96孔板2500巧m 离屯、IOmin后小屯、洗掉上清液。每孔加入10化1二甲基亚讽，置摇床上低速振荡lOmin，使结 晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪〇D570nm处测量各孔的吸光值(630nm校准）。
[0093] 对于A549细胞:收集对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成 浓度为2 X 104/mL细胞悬液，接种在96孔培养板，每孔0.1 mL，生长16-24h待细胞完全贴壁后 每孔加入0.1 ml不同浓度的化合物，每个浓度设3个对照。培养4她后，每孔加入IOiiLMlT溶液 (0.5mg/ml，1 %MTT)，继续培养地。终止培养，轻轻吸掉孔内上清液。每孔加入10化1二甲基 亚讽，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪0D570nm处测量各孔 的吸光值(630nm校准）。
[0094] 所有结果按公式：lgIC50 = Xm-I*(sigP-(3-Pm-h)/4)，计算出 IC50,其中 Xm:药物 最高浓度的对数值;SigP:所有抑制率的总和；I :lg(药物最高浓度/与最高浓度相邻的药物 浓度）；化:最大杀伤率;Pn:最小杀伤率。
[0095] 3.实验结果
[0096] 活性对照实验结果见表1-表2,图1-图2。
[0097] 表1，化合物I-a、化合物I-b与白枠醇的眼〇(山〇比较
[009引
[0099]
[0100]
[0101] 由表1、表2,图1，图2可W看出：本发明制备的白枠醇，白枠酸的TPP衍生物与母药 相比对K562细胞株和A549细胞株表现出了明显的增值抑制作用的提高，最低提高了 12.4 倍，最高提高了 31.3倍。为开发应用新一代抗肿瘤药物开拓了新途径。
[0102] 同样药物浓度(5咖)下，本发明制备的化合物I -a，I -b，II -a，W及白枠醇、白枠酸 对A549细胞的抑制率结果见图3。
[0103] 由图3可W看出，同等药物浓度下，本发明制备的化合物I-a，I-b，II-a的药理活性 与白枠醇，白枠酸相比，对A549细胞的增殖抑制作用有了明显提高。
[0104] 实施例8:化合物I-a在不同浓度下对K562细胞作用的形态变化 [01化]1.实验材料
[0106] 实验药物:本发明实施例制备的化合物I-a。
[0107] 细胞培养:K562细胞株：中科院上海细胞库;RPMI-1640培养液，胎牛血清：W色列 Bioind;膜蛋白酶:美国Amresco公司；青霉素-链霉素溶液（100 X，过滤除菌）：中国赛尔斯 公司
[0108] 仪器：移液器：法国Gilson;生物安全柜1300series A2,二氧化碳培养箱：美国 Thermo公司；灭菌锅：日本松下。
[0109] 2.实验方法
[0110] 将人慢性髓原白血病细胞K562在含10%胎牛血清，10011/1111青霉素和100111肖/1111链 霉素的RPMI-1640培养液中，培养在5 % C〇2，饱和湿度的37 °C培养箱中。
[0111] 收集对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成浓度为lOVmL 细胞悬液，接种在6孔培养板，每孔2mL，分别设置OiiM，0.5iiM，1，5iiM，5iiM，IOiiM五个浓度梯度 加入化合物I-a，在培养箱中培养24h后，于倒置巧光显微镜下拍摄细胞形态。实验结果见图 4。
[0112] 由图4可W看出，低浓度下作用24h后细胞形态尚可维持，随浓度的增大，破裂的细 胞逐渐增多，IOyM浓度作用2地后细胞已全部死亡。由此得出结论，化合物I-a对K562的增值 抑制作用具有浓度依赖性。
[0113] 实施例9:流式细胞术检测化合物I-a诱发K562细胞调亡
[0114] 1.实验材料
[0115] 实验药物:本发明实施例制备的化合物I-a。
[0116] 细胞培养:同实施例8
[0117] 仪器：移液器：法国Gilson;生物安全柜1300series A2,二氧化碳培养箱：美国 Thermo公司；灭菌锅：日本松下。流式细胞仪:美国抓。
[011引2.实验方法
[0119] 将人慢性髓原白血病细胞K562在含10%胎牛血清，10011/1111青霉素和100111肖/1111链 霉素的RPMI-1640培养液中，培养在5 % C〇2，饱和湿度的37 °C培养箱中。
[0120] 收集对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液配成浓度为lOVmL 细胞悬液，接种在6孔培养板，每孔2mL，分别设置OiiM，0.4iiM，0.6iiM，0.祉M，1. OiiM，1.六 个浓度梯度加入化合物I-a，在培养箱中培养4她后，将细胞收集至15mL离屯、管中，170化pm 离屯、7min，弃掉上清液，用冰PBS洗一遍，弃上清。用碧云天Annexin V-FITC/PI细胞调亡试 剂盒对细胞染色:每管中加入50化L buffer重悬细胞，分别加入AnnexinV扣L，PI扣L，避 光放置染色15min。化之内上机检测。实验结果见图5。
[0121] 由图5可W看出，化合物I-a在0.4測浓度下对K562细胞有了明显的调亡作用。随着 浓度的升高，发生调亡的细胞比例逐渐增多，浓度下，有约51.8%的细胞发生了调亡。
[0122] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围W内。
【主权项】
1. 一类五环三萜衍生物，其结构式如式i、式π、式m、式ιν或式v所示：其中，Ri为氢、甲酰基、乙酰基或乂11=1-19)，R3为羟基，甲氧基或乙氧基：（n = H9)〇2. 如权利要求1所述的五环三萜衍生物，其特征在于，其是选自下列结构的化合物：3. 权利要求1或2所述的五环三萜衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。4. 一种权利要求1或2所述的五环三萜衍生物的制备方法，所述方法包括：以五环三萜 化合物为起始原料，使五环三砲化合物的至少一个羟基进行酯化反应，得中间体化合物，然 后将中间体化合物与三苯基膦发生成盐反应，生成式I、式Π 、式m或式IV所示的五环三萜 衍生物； 或者，将三苯基膦与1，5_二溴戊烷在乙腈中发生成盐反应，然后将成盐反应的产物与 乙二胺在四氢呋喃中发生取代反应;将乳香酸与氯化亚砜发生酯化反应后，再与上述取代 反应的产物进行酰胺化反应，生成式v所示的五环三萜衍生物。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，生成式I、式π、式m或式IV所示的五环 三萜衍生物的过程中，所述酯化反应采用的是EDC/DMAP法，以二氯甲烷作为溶剂，室温下反 应，五环三萜化合物、EDC、DMAP与5-溴戊酸和二氯甲烷加入量的比为：lmol: (2 · 5-2 · 6)mol: (0.4-0.5)mol:(4-4.1)mol:2000mL〇6. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，生成式I、式Π 、式m或式IV所示的五环 三萜衍生物的过程中，所述成盐反应是以乙腈作为溶剂，中间体化合物、三苯基膦和乙腈加 入量的比为lmo 1: (3-3 · 1 )mo 1:1 OOOmL，70-80 °C 加热回流。7. -种药物组合物，其包含权利要求1或2所述的五环三萜衍生物。8. 如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含一种或多种药 学上可接受的载体和/或赋形剂。9. 如权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为固体口服制剂 或肠胃外给药制剂。10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、分散片、 肠溶片、咀嚼片、口崩片、胶囊、糖衣剂、颗粒剂、干粉剂、口服溶液剂、注射用小水针、注射用 冻干粉针、大输液或小输液。
【文档编号】A61P35/00GK105924492SQ201610280277
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月28日
【发明人】范培红, 叶雅晴, 娄红祥
【申请人】山东大学