一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法
【专利摘要】本发明涉及茶籽中茶皂甙纯化制备方法，属于中压制备色谱方法。其包括：（1）茶籽皂甙提取物制备；（2）中压制备柱填装与活化；（3）分离样品的制备；（4）分离溶剂系统；(5)监视及分馏收集。本发明突破了茶籽皂甙单体纯化制备难度大，实现了整个分离过程计算机自动控制及在线监测，具有快速分离、产物纯度高、效率高成本低等特点。在110分钟内分离得到了4种茶籽皂甙成分，能进行茶籽皂甙成分大规模制备，一次上样量可达3克，茶籽皂甙纯度达到95.7%以上，为茶籽资源的深度开发提供重要方法手段。
【专利说明】
一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法
技术领域
[0001] 本发明属于茶籽皂甙纯化制备方法技术领域，具体涉及一种中压制备色谱快速分 离纯化茶籽皂甙的方法。
【背景技术】
[0002] 茶籽皂甙是茶树的重要生物活性成分，是一类结构复杂的五环三萜类糖苷化合 物，其基本化学结构由皂甙元、有机酸和糖体三部分组成，广泛的存在茶树的叶、根、花及种 子中。1931年由日本学者青山新次郎首次从茶籽分离得到茶阜戒(Teasaponin)，经过多年 的研究已从茶树的不同部位分离鉴定出茶皂苷单体56种，在茶皂甙生物活性研究取得令人 鼓舞的成果。茶皂素是一种优良的非离子型天然表面活性剂，具有抗菌、溶血、生物激素样 作用、抑制酒精吸收和保护肠胃的作用等药理功能。茶皂素的表面活性已在日化、生物农 药、建材等领域广泛的应用，它的生物活性和药理方面显示了诱人应用前景。
[0003] 分离纯化高纯度的茶皂甙技术是深入研发其功能活性基础，高效纯化茶皂甙的制 备技术已成为茶皂素产业发展的技术瓶颈。目前，纯化茶皂甙主要方法有重结晶、沉淀法、 絮凝剂法、柱层析法和滤膜法、大孔树脂法等，这些方法起到富集纯化作用，由于茶皂甙分 子的极性大、化学结构相近，用常规的技术无法得到高纯度的茶皂甙单体成分，茶皂素纯化 技术面临产品纯度低、效率低、成本高，操作繁等缺点，难以满足茶皂素的高端领域如医药、 日用品上应用。开发茶籽皂甙高效制备技术是推动茶皂素行业向更高层次的发展重要支 撑。2011年，费学谦等公开公告号为CN102093461A发明专利"一种高速逆流色谱纯化油茶皂 素的方法"，该方法是利用HSCC单向流体动力学平衡而建立的液液分配技术分离油茶皂素， 得总皂苷纯度为97%油茶皂素，能较好地将茶皂苷与黄酮、色素等分开得到仍是茶皂素混和 物无法得到单体成分。
[0004] 中压制备液相色谱(Medium-pressure liquid chromatography, MPLC)为近年流 行起来的一项新型色谱技术，色谱柱的压力为70-300psi，介于低压层析色谱与高压制备色 谱之间，流量可达每分钟数百毫升，因此其色谱柱大都由耐压的强化玻璃制成，有较好的耐 压能力，分离度更高;MPLC有上样量大、分离更快、产物更纯、产率更高、成本低等优点，已 实现计算机在线控制和监测。本发明为利用中压制备色谱技术分离茶籽中的茶皂苷成分制 备方法，能得到高纯度的茶皂苷组分。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种中压制备色谱快速分 离纯化茶籽皂甙的方法的技术方案。
[0006] 所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于包括以下步 骤： 1)茶籽皂甙提取物制备:将采摘的茶果去皮去壳后进行烘干、粉碎和脱脂;脱脂茶籽粉 用极性溶剂回流提取，提取液抽滤后，真空浓缩回收溶剂，冷冻干燥得到茶籽皂甙粗提物； 2) 中压制备柱填装:将反相C18材料采用干法装柱，装于耐压玻璃柱，将填料放入自动 装柱器中，氮气加压15~30分钟直至柱子中的填料不再下降，柱两端用脱脂棉栓和筛板压 紧螺栓固定； 3) 中压色谱制备柱活化:流动相超声脱气20~30分钟后，以较高流速冲洗柱30分钟后， 以较低流速用不同极性流动相活化分离柱2小时以上； 4) 分离样品的制备:将茶籽皂甙粗提物用1~10倍体积流动相溶解，8000转/分钟离心 后上清液作分离样品； 5) 分离溶剂系统:分别以水：甲醇为溶剂系统，梯度洗脱110分钟，即以流速为10_50ml/ min, A相为纯水、B相为甲醇，洗脱梯度为线性梯度:0~20minB% 15-30%，20~50minB% 30-45%，50~65minB% 45-78%，65~95minB% 78-85%，95~lOOminB% 85-100%，100-110minB% 100%； 6) 监视及分馏收集:在220nm波长下监视，自动分馏收集器按出峰时间收集相应吸收峰 的洗脱液； 7) 纯化洗脱液的浓缩干燥:将每个组分液脱液在真空度90-150mbar，温度为50°C下减 压浓缩，除去甲醇，待浓缩样冷却至室温，上冷冻干燥机将浓缩组分冻干。
[0007] 所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于所述的步骤 1) 中采摘的茶果去皮去壳后在60°C恒温干燥箱内烘干，茶籽粉碎至40目，用石油醚或正已 烷脱脂;脱脂茶籽粉用极性溶剂以料液比1:10比例70°C恒温水浴回流提取3次每次提取3小 时，所述的极性溶剂为85%乙醇。
[0008] 所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于所述的步骤 2) 中C18填料为：（silicycle prac-Technologiue BLCD公司，Canada):50ym。
[0009] 所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于所述的步骤 3) 中较高流速为80~150ml/min，所述的较低流速为3~5 ml/min。
[0010] 本发明突破了茶籽皂甙单体纯化制备难度大，实现了整个分离过程计算机自动控 制及在线监测，具有快速分离、产物纯度高、效率高成本低等特点。在110分钟内分离得到了 4种茶籽皂甙成分，能进行茶籽皂甙成分大规模制备，一次上样量可达3克，茶籽皂甙纯度达 到95.7%以上，为茶籽资源的深度开发提供重要方法手段。
【附图说明】
[0011]图1为茶籽皂甙中压制备分离谱图； 图2为中压放大制备色谱图。
【具体实施方式】
[0012]以下结合实施例来进一步说明本发明。 实施例
[0013] -、材料、仪器和试剂 1.实验材料:茶籽皂甙提取物:皂甙总量为45%; C18填料（silicycle prac-Technologiue BLCD公司，Canada) :50μηι Biichi中压制备玻璃柱：〇15mmX230mm (Ν0:28139)，Φ49Χ460 mm 装柱器Biichi NO:22745 2.主要仪器设备： BiiCHI MPLC中压制备系统 pump C-615 and UV photometerC-635and control unit C-620 and fraction collector C-660 紫外分光光度计Shimadzu UV-2550 液质联用仪Agilent LC/MSD Trap SL 旋转蒸发仪(瑞士 BUchi) 冷冻干燥机LGJ-50C(北京四环科学仪器厂有限公司） 3 .药品及试剂：甲醇、无水乙醇、95%乙醇均为国产分析纯；色谱级甲醇、乙腈（德国 Merk)及三氟乙酸（美国Tedia公司）。
[0014]二、茶籽皂甙分离制备 对茶籽皂甙反相-中压色谱分离制备参数:分离填料、溶剂系统、上样量、流速及监视波 长等条件进行优化，在110钟从茶皂甙提取物中离得到茶籽皂素组分，在监视波长220nm实 现茶籽皂甙快速分离。
[0015] 1.中压柱的填装 干法装柱，将一定量的填料放入自动装柱器中，5-8kg压力的氮气加压15-30min直至填 料不再下降，柱两端用脱脂棉栓和筛板压紧螺栓固定。装入填料净重22.62g。
[0016] 2.中压柱冲洗活化 C18分离柱，用10%甲醇超声脱气30分钟后，分别以80-150ml/min的流速冲洗30分钟后， 以3_5ml/min不同极性甲醇冲2小时以上。
[0017] 3.纯化过程 称取样品200mg，用2mL水充分溶解，注射器进样，流动相A为水，流动相B甲醇;流速： 20mL /min;波长：220nm。洗脱梯度为线性梯度：0 ~20min，B% 15%~30%; 20~50min，B% 30% ~45%; 50~65min，B%45%~78%; 65~95min，B%78%~85%;95~100minB%85_100%， 100-110minB%100%。荼籽皂甙的中压制备分离谱图（图1)。
[0018] 4. C18柱在不同进样量茶皂甙的分离效率 茶阜戒提取物的进样量分别为200 11^、40〇11^、60〇11^、90〇11^测定各分离峰的总阜戒及 得率，比较分离效率。由此可见，随着进样量增加，8种组分仍能实现较高的分离度，重复性 好。
[0019](上表:不同的进样量分离各峰在220nm下的吸光度值） 5.中压制备放大实验： 中压柱子尺寸：Φ27mmX460mm，填料净重134.7g，3g的茶阜戒提取物上样，经过中压制 备分离，仪器系统的监测、自动收集在220 nm下有吸收的物质，每管收集体积为50ml，根据 色谱峰出峰时间合并洗脱液，减压浓缩回收提取试剂后，冷冻干燥得到四种主要的茶籽皂 甙组分，放大制备中压色谱图如下（图2)。分别为组分P4: 320 mg，P5: 20 mg，P6: 240mg， ?7:14 1^，四种主要高纯度茶籽皂甙品总量为59411^，得率达19.8%。
【主权项】
1. 一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 茶籽皂甙提取物制备:将采摘的茶果去皮去壳后进行烘干、粉碎和脱脂;脱脂茶籽粉 用极性溶剂回流提取，提取液抽滤后，真空浓缩回收溶剂，冷冻干燥得到茶籽皂甙粗提物； 2) 中压制备柱填装:将反相C18材料采用干法装柱，装于耐压玻璃柱，将填料放入自动 装柱器中，氮气加压15~30分钟直至柱子中的填料不再下降，柱两端用脱脂棉栓和筛板压 紧螺栓固定； 3) 中压色谱制备柱活化:流动相超声脱气20~30分钟后，以较高流速冲洗柱30分钟后， 以较低流速用不同极性流动相活化分离柱2小时以上； 4) 分离样品的制备:将茶籽皂甙粗提物用1~10倍体积流动相溶解，8000转/分钟离心 后上清液作分离样品； 5) 分离溶剂系统:分别以水：甲醇为溶剂系统，梯度洗脱110分钟，即以流速为10_50ml/ min, A相为纯水、B相为甲醇，洗脱梯度为线性梯度:0~20minB% 15-30%，20~50minB% 30-45%，50~65minB% 45-78%，60~95minB% 78-85%，95~lOOminB% 85-100%，100-110minB% 100%； 6) 监视及分馏收集:在220nm波长下监视，自动分馏收集器按出峰时间收集相应吸收峰 的洗脱液； 7) 纯化洗脱液的浓缩干燥:将每个组分液脱液在真空度90-150mbar，温度为50°C下减 压浓缩，除去甲醇，待浓缩样冷却至室温，上冷冻干燥机将浓缩组分冻干。2. 如权利要求1所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于 所述的步骤1)中采摘的茶果去皮去壳后在60°C恒温干燥箱内烘干，茶籽粉碎至40目，用石 油醚或正已烷脱脂;脱脂茶籽粉用极性溶剂以料液比1:10比例70°C恒温水浴回流提取3次 每次提取3小时，所述的极性溶剂为85%乙醇。3. 如权利要求1所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于 所述的步骤2)中C18填料为：（silicycle prac-Technologiue BLCD公司，Canada): 50μηι〇4. 如权利要求1所述的一种中压制备色谱快速分离纯化茶籽皂甙的方法，其特征在于 所述的步骤3)中较高流速为80~150ml/min，所述的较低流速为3~5 ml/min。
【文档编号】C07H15/256GK106008649SQ201610305434
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】俸春红, 夏晓萍, 金寿珍, 王国庆, 陈妮妮, 袁海波, 张建勇, 董春旺, 李佳, 邓余良, 滑金杰
【申请人】中国农业科学院茶叶研究所