用于纯化多不饱和脂肪酸的模拟移动床色谱分离方法

用于纯化多不饱和脂肪酸的模拟移动床色谱分离方法
【专利说明】用于纯化多不饱和脂肪酸的模拟移动床色谱分离方法
[0001] 本申请是申请日为2010年12月24日，申请号为201080064359. 5,发明名称为"用 于纯化多不饱和脂肪酸的模拟移动床色谱分离方法"的申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及用于纯化多不饱和脂肪酸（PUFA)及其衍生物的改进的色谱分离方 法。具体地，本发明涉及用于纯化PUFA及其衍生物的改进的模拟的或实际的移动床色谱分 离方法。
[0003] 脂肪酸，特别是PUFA，及它们的衍生物是生物学上重要分子的前体，其在调节比如 血小板聚集、炎症及免疫响应的生物功能中发挥着重要的作用。因此，在大范围的病理学病 症（包括CNS病症）、神经病变（包括糖尿病神经病变）、心血管疾病、全身免疫系统和炎症 病症（包括炎症性皮肤病）的治疗中，PUFA及它们的衍生物可能是治疗上有用的。
[0004] 在天然原料比如植物油和深海鱼油（marineoil)中发现了PUFA。然而，存在于这 样的油中的此类PUFA经常掺合了饱和脂肪酸和许多其它杂质。因此，在营养或药物使用之 前，期望PUFA应该是纯化的。
[0005] 遗憾地是，PUFA极其脆弱。因此，当在氧气的存在下加热时，它们易于异构化、过 氧化和寡聚化。因此，分离和纯化PUFA产物以制备纯的脂肪酸是困难的。蒸馏，甚至在真 空下，也能够导致不可接受的产物降解。
[0006] 模拟的和实际的移动床色谱是为本领域的技术人员所熟知的已知技术。工作原理 涉及液体洗脱液相和固体吸附剂相的逆流移动。该操作允许最少的溶剂用量，使得方法在 经济上是可行的。这样的分离技术已经在不同领域中中获得了数种应用，包括烃、工业化学 制品、油、糖及API。这样的分离技术还被用来纯化PUFA及其衍生物。
[0007] 众所周知，在传统的固定床色谱系统中，使组分待分离的混合物渗透通过容器。容 器为大体圆柱形的，且被典型地称作柱。柱包含表现出高的流体渗透性的多孔材料（通常 称为固定相）的填充物。混合物的每一种组分的渗透速率取决于该组分的物理性能，使得 组分相继且选择性地从柱中离开。因此，一些组分趋向于牢固地固定到固定相上且因此将 缓慢地渗透，而其它组分趋向于弱固定且更快速地从柱中离开。已提出了许多不同的固定 床色谱系统且出于分析和工业生产两者的目的使用。
[0008] 相反，模拟移动床系统由包含吸附剂的许多单独的柱构成，所述柱被串联到一起。 洗脱液在第一方向穿过柱。通过一系列的阀，周期性地改变系统中的进料和洗脱液的注入 点及分离后的组分的收集点。整体效果是为了模拟包含固体吸附剂的移动床的单一柱子的 操作。因此，模拟移动床系统由柱组成，所述柱和在传统的固定床系统一样包含洗脱液从其 中穿过的固体吸附剂的固定床，但在模拟移动床系统中，这样的操作以模拟连续逆流的移 动床。
[0009] 用于模拟移动床色谱的方法和设备被描述在几个专利中，包括US2, 985, 589、US 3, 696, 107、US3, 706, 812、US3, 761，533、FR-A-2103302、FR-A-2651148 和FR-A-2651149， 本文通过引用并入这些专利的全部内容。主题还被详细描述在"Preparativeand ProductionScaleChromatography''，由Ganetsos和Barker编辑，MarcelDekkerInc,M 约，1993中，本文通过引用并入其全部内容。
[0010] 实际的移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。然而，不是通过阀的系统改 变进料混合物和洗脱液的注入点及分离后组分的收集点，而是使一系列的吸附装置（即， 柱）相对于进料点和取出点物理地移动。此外，这样的操作以模拟连续逆流移动床。
[0011] 用于实际的移动床色谱的方法和设备被描述在几个专利中，包括US6, 979, 402、 US5, 069, 883和US4, 764, 276,本文通过引用并入这些专利的全部内容。
[0012] 模拟和实际的移动床技术通常仅适用于分离二元混合物。因此，较强极性的组分 将与洗脱液一起移动，并作为提余液流（raffinatestream)收集，且较弱极性的组分将与 吸附剂一起移动，并作为抽取液流（extractstream)收集。因此，难于用模拟的或实际的 移动床技术来使期望的产物与包含极性杂质和非极性杂质两者的粗混合物分离。这限制了 此类技术在从例如鱼油中纯化PUFA产物的适用性。
[0013]因此，在以往中，当用模拟的或实际的移动床技术来使PUFA与天然油分离时，在 用模拟的或实际的移动床技术纯化所得到的中间产物之前，通常需要首先使天然油经过初 步分离步骤（例如，固定柱色谱）（参见，例如EP-A-0697034)。通常，初始纯化步骤除去了 极性或非极性组分，从而产生基本上二元混合物，然后使所述二元混合物经过移动床色谱。
[0014] 参考图1阐述这种分离二元混合物的方法。通过考虑包含固定相S的垂直色谱柱 来解释模拟的或实际的连续逆流色谱分离方法的概念，所述固定相S划分成多个部分，更 精确地说，从柱的底部到顶部划分成4个叠加的亚区I、II、III和IV。通过泵P在IE处从 底部引入洗脱液。在亚区II和亚区III之间的1A+B处引入待分离的组分A和组分B的混 合物。在亚区I和亚区II之间的SB处收集主要包含B的抽取液，且在亚区III和亚区IV 之间的SA处收集主要包含A的提余液。
[0015] 在模拟移动床系统的情况下，通过引入点和收集点相对于固定相的移动，引起固 定相S的模拟向下移动。在实际的移动床系统的情况下，由多个色谱柱相对于引入点和收 集点的移动引起固定相S向下移动。在图1中，洗脱液向上流动且在亚区II和亚区III之 间注入混合物A+B。根据各组分与固定相的色谱相互作用例如在多孔介质上的吸附，各组分 将移动。对固定相表现出较强亲和力的组分B(较慢的流动组分）将更为缓慢地由洗脱液 带出且将延迟地跟随洗脱液。对固定相表现出较弱亲和力的组分A(较快的流动组分）将 容易地由洗脱液带出。如果准确地估计并控制参数的正确组合，尤其是每个区中的流速，将 在亚区III和亚区IV之间收集对固定相表现出较弱亲和力的组分A作为提余液，且将在亚 区I和亚区II之间收集对固定相表现出较强亲和力的组分B作为抽取液。
[0016] 因此，将理解，图解地阐述在图1中的传统的移动床系统限于二元分离。
[0017] 因此，存在对可使PUFA或其衍生物与较快的流动组分和较慢的流动组分（即较强 极性的杂质和较弱极性的杂质）分离的单一模拟的或实际的移动床色谱分离方法的需要， 以生产基本上纯的PUFA或其衍生物。还期望的是，方法应涉及在标准温度和压力条件下操 作的便宜的洗脱液。
[0018] 现在，意外地发现用使用含水醇洗脱液的单一模拟的或实际的移动床设备可有效 地纯化PUFA产物。因此，本发明提供用于从进料混合物中回收多不饱和脂肪酸（PUFA)产 物的色谱分离方法，方法包括将进料混合物引入到模拟的或实际的移动床色谱设备中，色 谱设备具有多个相连的色谱柱，所述色谱柱包含作为洗脱液的含水醇，其中设备具有包括 至少第一区和第二区的多个区，每一个区具有抽取液流和提余液流，从抽取液流和提余液 流可收集来自多个相连的色谱柱的液体，且其中（a)从第一区中的柱中收集包含PUFA产物 连同较强极性的组分的提余液流并将其引入到第二区中的不相邻的柱中，和/或（b)从第 二区中的柱中收集包含PUFA产物连同较弱极性的组分的抽取液流并将其引入到第一区中 的不相邻的柱中，在每一个区中使所述PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
[0019] 还提供通过本发明的方法可得到的TOFA产物。
[0020] 以高收率生产通过本发明的方法所生产的PUFA产物，且PUFA产物具有高纯度。 而且，通常由PUFA的蒸馏所产生的特殊杂质的含量是非常低的。如本文所使用的，用术语 "同分异构杂质"来表示通常在含PUFA的天然油的蒸馏过程中所产生的那些杂质。这些杂 质包括PUFA同分异构体、过氧化产物和寡聚化产物。
[0021] 图1阐述了用于分离二元混合物的模拟的或实际的移动床方法的基本原理。
[0022] 图2阐述了本发明的第一个优选实施方式，该实施方式适用于使EPA与较快流动 的组分和较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）分离。
[0023] 图3阐述了本发明的第二个优选实施方式，该实施方式适用于使DHA与较快流动 的组分和较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）分离。
[0024] 图4更为详细地阐述了本发明的第一个优选实施方式，该实施方式适用于使EPA 与较快流动的组分和较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）分离。
[0025] 图5更为详细地阐述了本发明的第二个优选实施方式，该实施方式适用于使DHA 与较快流动的组分和较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）分离。
[0026] 图6更为详细地阐述了用于本发明的第一个优选实施方式的可选择的方法，该方 法适用于使EPA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的 杂质）分离。
[0027] 图7更为详细地阐述了用于本发明的第二个优选实施方式的可选择的方法，该方 法适用于使DHA与较快的流动组分和较慢的流动组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的 杂质）分离。
[0028] 图8阐述了本发明的特别优选的实施方式，该实施方式用于从较快流动的组分和 较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）中纯化EPA。
[0029] 图9阐述了本发明的特别优选的实施方式的可选择的方法，该方法用于从较快流 动的组分和较慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）中纯化EPA。
[0030] 图10阐述了本发明的特别优选的实施方式，该方法用于从较快流动的组分和较 慢流动的组分（即，较强极性的杂质和较弱极性的杂质）中纯化EPA。
[0031] 图11显示了根据本发明生产的EPA产物的GC分析。
[0032] 图12显示了根据本发明得到的第一抽取液流和提余液流的GCFAMES图。
[0033] 图13显示了根据本发明得到的第二抽取液流和提余液流的GCFAMES图。
[0034] 图14显示了根据本发明生产的DHA产物的GCFAMES图。
[0035] 图15显示了通过蒸馏所生产的DHA产物的GCFAMES图。
[0036] 术语"多不饱和脂肪酸"(PUFA)是指包含多于一个双键的脂肪酸。这样的PUFA是 本领域的技术人员所熟知的。如本文所使用的，PUFA衍生物是呈甘油一酯、甘油二酯或甘 油三酯，酯，磷脂，酰胺，内酯或盐的形式的PUFA。优选甘油三酯和酯。更优选酯。酯通常为 烷基酯，优选地(^-(：6烷基酯，更优选地Ci-C；烷基酯。酯的实例包括甲酯和乙酯。乙酯是最 优选的。
[0037] 如本文所使用的，术语"PUFA产物"是指包含一种或多种多不饱和脂肪酸（PUFA) 和/或其衍生物的产物，其通常具有营养或药物的重要性。通常，PUFA产物为单一的PUFA 或其衍生物。可选择地，PUFA产物为两种或更多种PUFA或其衍生物的混合物，例如两种。
[0038] 如本文所使用的，术语"区"是指多个相连的色谱柱，该色谱柱包含作为洗脱液的 含水醇，且具有用于进料混合物流的一个或多个注入点、用于水和/或醇的一个或多个注 入点、提余液离开流（通过其可从所述多个相连的色谱柱中收集液体）及抽取液离开流 (通过其可从所述多个相连的色谱柱中收集液体）。通常，每一个区仅具有一个用于进料混 合物的注入点。在一个实施方式中，每一个区仅具有一个用于含水醇洗脱液的注入点。在 另一个实施方式中，每一个区具有用于水和/或醇的两个或更多个注入点。
[0039] 术语"提余液"是本领域的技术人员所熟知的。在实际的和模拟的移动床色谱的 背景中，它是指比固体吸附剂相更快地与液体洗脱液相一起移动的组分的流。因此，与进料 流相比，提余液流通常富含较强极性的组分且不含较弱极性的组分。
[0040] 术语"抽取液"是本领域的技术人员所熟知的。在实际的和模拟的移动床色谱的 背景中，它是指比液体洗脱液相更快地与固体吸附剂相一起移动的组分的流。因此，与进料 流相比，抽取液流通常富含较弱极性的组分且不含较强极性的组分。
[0041] 如本文所使用的，在应用于相同设备中的柱时，术语"不相邻"是指由一个或多个 柱，优选地3个或更多个柱，更优选地5个或更多个，最优选地约5个柱隔开的柱。
[0042] 因此，当（a)从第一区中的柱收集包含PUFA产物连同较强极性的组分的提余液流 并将其引入到第二区中的不相邻的柱时，从第一区收集的提余液流为用于第二区的进料混 合物。当（b)从第二区的柱收集包含PUFA产物连同较弱极性的组分的抽取液流并将其引 入到第一区中的不相邻的柱时，从第二区收集的抽取液流为用于第一区的进料混合物。
[0043] 通常，PUFA产物包含至少一种《_3或《-6PUFA，优选地至少一种《-3PUFA。 ?-3PUFA的实例包括a-亚麻酸（ALA)、十八碳四烯酸（SDA)、二十碳三烯酸（ETE)、二十碳 四烯酸（ETA)、二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。优 选SDA、EPA、DPA和DHA。更优选EPA和DHA。《 -6PUFA的实例包括亚油酸（LA)、y-亚麻 酸（GLA)、二十碳二烯酸、双高-y-亚麻酸（DGLA)、花生四烯酸（ARA)、二十二碳二烯酸、肾 上腺酸和二十二碳五烯（《 -6)酸。优选LA、ARA、GLA和DGLA。
[0044] 在一个实施方式中，PUFA产物为EPA和/或EPA乙酯（EE)。
[0045] 在另一个实施方式中，PUFA产物为DHA和/或EPA乙酯（EE)。
[0046] 在又一个实施方式中，PUFA产物为EPA和DHA和/或EPAEE和DHAEE的混合物。
[0047] 用于通过本发明的方法分离的合适的进料混合物可从以下得到：天然来源，包括 植物油和动物油以及植物脂肪和动物脂肪；及合成来源，包括从转基因植物、动物及微生 物（包括酵母）得到的油。实例包括鱼油、海藻和微藻油及植物油，例如玻璃苣油、蓝蓟属 (Echium)油及月见草油。在一个实施方式中，进料混合物为鱼油。在另一个实施方式中，进 料混合物为海藻油。当期望的PUFA产物为EPA和/或DHA时，海藻油是特别合适的。当期 望的PUFA产物为GLA时，转基因红花油是特别合适的。当期望的PUFA产物为EPA时，转基 因酵母是特别合适的。
[0048] 在通过本发明的方法分镏之前，进料混合物可经历化学处理。例如，其可经历甘油 酯酯交换或甘油酯水解，在某些情况下跟随着选择性的过程比如结晶、分子蒸馏、尿素分镏(ureafractionation)、用硝酸银或其它金属盐溶液提取、碘内醋化或超临界流体分离。
[0049] 进料混合物通常包含PUFA产物和至少一种较强极性的组分及至少一种较弱极性 的组分。与PUFA产物相比，较弱极性的组分对于用于本发明的方法的吸附剂具有更强的吸 附。在操作的过程中，这样的较弱极性的组分通常优先于液体洗脱液相与固体吸附剂相一 起移动。与PUFA产物相比，较强极性的组分对于用于本发明的方法的吸附剂具有较弱的吸 附。在操作的过程中，这样的较强极性的组分通常优先于固体吸附剂相与液体洗脱液相一 起移动。通常，较强极性的组分将被分成提余液流，且较弱极性的组分将被分成抽取液流。
[0050] 较强极性的组分和较弱极性的组分的实例包括：（1)存在于天然油中的其它化合 物（例如，深海鱼油或植物油）；(2)在存储、精制和在先的浓缩步骤的过程中形成的副产 物；及（3)来自于之前的浓缩或纯化步骤过程中所使用的溶剂或试剂的污染物。
[0051] (1)的实例包括其它不想要的PUFA;饱和脂肪酸；留醇类，例如胆留醇；维生素； 及环境污染物，比如多氯联苯（PCB)、多芳香烃（PAH)杀虫剂、氯化杀虫剂、二噁英及重金 属。PCB、PAH、二噁英及氯化杀虫剂都是高度非极性组分。
[0052] (2)的实例包括来自PUFA产物的同分异构体及氧化产物或分解产物，例如脂肪酸 或其衍生物的自行氧化的聚合产物。
[0053] (3)的实例包括为从进料混合物中除去饱和或单饱和的脂肪酸而可能添加的尿 素。
[0054] 优选地，进料混合物为含PUFA的深海鱼油，更优选地为包含EPA和/或DHA的深 海鱼油。
[0055] 用于通过本发明的方法制备浓缩的EPA的典型的进料混合物包含50-75%的EPA、 0-10 %的DHA及含其它必需《-3和《-6脂肪酸的其它组分。
[0056] 用于通过本发明的方法制备浓缩的EPA的优选的进料混合物包括55%的EPA、5% 的DHA及含其它必需《-3和《-6脂肪酸的其它组分。DHA的极性要小于EPA。
[0057] 用于通过本发明的方法制备浓缩的DHA的典型的进料混合物包括50-75%的DHA、 0-10 %的EPA及含其它必需《-3和《-6脂肪酸的其它组分。
[0058] 用于通过本发明的方法制备浓缩的DHA的优选的进料混合物包括75