从缺乏染色质的细胞培养收获物中色谱纯化抗体的制作方法
【专利说明】从缺乏染色质的细胞培养收获物中色谱纯化抗体
【背景技术】
[0001] 本文公开的实施方案设及纯化IgG单克隆抗体的方法。
[0002] 重组蛋白的纯化通常开始于所谓的初步俘获步骤，在该步骤中细胞和碎片被去除 使得剩余的上清液可W通过细胞和碎片的存在会使其受到妨碍或使其变得无效的方法进 行处理。它们的去除通常设及离屯、和过滤。其有时设及使用具有阴离子交换能力的深度过 滤器或膜，或将阴离子交换粒子直接添加至含有抗体的收获物（Gagnon,P.,化rificaiton ToolsforMonoclonalAntibody,ValidatedBiosystems,Tucson, 1996 ；Kuczewski,M,. 等人，BiopharmInt. 23 (3) (2010) 20-25 ;Kuczewski,M.,等人，Biotechnol. J. ,6(2011)56-65)，在所有运样的例子中均报道降低了宿主细胞蛋白（HCP)的水平。 Brodsky等人度iotechnol.Bioeng. 109(2012)2589-2598)记述了通过辛酸沉淀HCP作为前 体，或随后通过蛋白A亲和色谱纯化。Gan等人（J.C虹omatogr.A1291(2013)33-40)采用 了一种制备用于后续色谱纯化的收获物的不同方法，通过特异性地祀向来源于染色质的宿 主细胞污染物亚组，所述宿主细胞污染物亚组主要由组蛋白蛋白和DNA组成。运些方法中 的一种特别地采用了用于解离聚集体的可溶性多价有机阳离子和用于去除剩余的聚集体 和其他污染物的不溶性（表面固定化的）多价有机离子的组合。它们也记述了在活性成分 中包含尿囊素W实现它们的结果。
【发明内容】
[0003] 在一些方面，本文公开的实施方案提供了从不纯的制剂中纯化至少一种所需的单 克隆抗体的方法，所述不纯的制剂为细胞培养收获物的形式，所述方法包括W下步骤：（i) 通过使抗体制剂与可溶性和/或不溶性（表面固定化的）多价有机离子接触、然后去除固 体来调节所述抗体制剂W去除大部分染色质；（ii)将经调节的抗体制剂施加至吸附色谱 介质，所述吸附色谱介质将所需的抗体与不需要的污染物分级分离。
【具体实施方式】
[0004] 已经发现，在一些实施方案中，通过在抗体不结合的条件下暴露于可溶性多价有 机离子和/或固定化在固体表面上的多价有机离子来对含抗体的蛋白制剂的调节将随后 通过蛋白A分级分离的性能增强至出人意料的高程度。作为举例说明，在一些其中多价有 机粒子调节步骤将来自宿主蛋白的污染减少30-70 %的实施方案中，其可W令人惊奇地将 随后蛋白A色谱步骤减少宿主蛋白污染的能力增加高达几乎1000倍。在一些实施方案中， 所述方法提供的调节方法不只是通过减少总污染负荷来辅助随后纯化，而且还通过特别地 移除干扰随后纯化步骤诸如蛋白A纯化步骤的污染物来辅助随后纯化。在一些实施方案 中，所述方法令人惊奇地将蛋白A亲和柱的动态结合能力增加了 10-20%或更高。不采用 任何特殊的信仰或理论，由本文公开的实施方案所提供给亲和色谱介质的增加的能力可W 来自下面的事实：运些调节方法特别地去除与粒子的外表面结合的大的核小体-抗体聚集 体并且防止所需的抗体能够自由地进入大多数期望结合表面积所在的孔。在一些实施方案 中，运些调节方法还可W通过防止蛋白A柱暴露于潜在地通过与其非特异性结合而污染其 表面的化合物来增加蛋白A柱的使用寿命。另外地，运些调节方法可W不成比例地组合有 对病毒的去除。明显地，并且最令人惊奇地，公开的澄清方法将干扰物质去除到运样的程 度，即它们也使得具有较小纯化能力的吸收色谱法诸如阳离子交换、阴离子交换和多模式 法能够实现与蛋白A亲和色谱几乎相同的纯化性能。具体地，公开的澄清方法允许上面提 到的所有色谱法将宿主蛋白污染物减少至小于lOppm，如通过市售的宿主蛋白ELISA所测 量的。 阳〇化]已经发现化学上彼此括抗的物质的组合与依赖于所述物质中单独任一个的调节 方法相比具有实现更高的染色质去除水平的出人意料的效应。将预期括抗物质的组合会消 除对方的单个效应并且导致较少的染色质减少，较少的抗体回收，或导致两者。相反，本发 明的实施方案提供了限定窗，在所述限定窗内所述物质协同地作用W实现基本上超过任一 单一组分所提供的能力的染色质减少水平和抗体回收水平。另外，实验结果指示组合中每 一个组分的反应性曲线与当它们单独使用时的反应性曲线是截然不同的。运强调了本文公 开的实施方案的效用不可能通过单个组分的已知特性或应用来预测。在一些运样的实施方 案中，要组合用于调节细胞培养收获物的组分特别地包括含有7或8或9或10个碳原子的 脂肪酸W及带有正电荷的可溶性或固体物质。它们可W进一步包括一种或多种包含金属结 合官能团的固体或可溶性物质。它们可W进一步包括尿囊素。在本文公开的方法中，将所 述物质组合在含有一种抗体的液体制剂中，然后在合适的解育期后，去除固体W提供包含 所述抗体的溶液，所述溶液不存在多达99%或更高的宿主细胞污染物，平均IgG回收率为 约90-约95 %，且浊度小于约5NTU(比浊浊度单位）。
[0006] 实验数据记录了在运些组分之间的相互括抗的相互作用。例如，阳离子（正电 性）组分和阴离子（负电性）组分诸如脂肪酸应当彼此具有强吸引力，并且它们的相互作 用应当倾向于降低抗体制剂诸如细胞培养收获物的任一个组分与其他组分相互作用的能 力。运通过下列的数据指示，所述数据显示某些污染物诸如抗体轻链被处于一个比率的组 分组合去除，但如果阳离子组分的比例增加则会在含抗体的液体中重新出现。在一个具体 实例中，据信运由于结合于沉淀内的污染物的脂肪酸被更强烈地吸引至阳离子固体而不是 被吸引至污染物而发生，使得当阳离子固体的量增加时，脂肪酸转移至该固体，将污染物从 沉淀释放，导致其再污染可溶性抗体制剂。在相互括抗作用的另一个实例中，已经实验性地 显示结晶尿囊素结合细胞培养收获物中多于99%的脂肪酸，表明其W相似的方式作用于添 加的脂肪酸的高度可能性。运应当预期减少添加至含抗体细胞培养收获物用于沉淀非抗体 污染物的脂肪酸的效率。相反，所述方法的此方面有助于有效地利用处于低于在科学文献 中被报道为最佳的水平一半的浓度的脂肪酸。不归于任何特殊的理论，可能的是，通过氨键 键合被配位至未溶解的尿囊素的脂肪酸保留了它们天然的电荷、疏水性和结合污染物的能 力，同时未溶解的尿囊素的密度增强了通过沉降对它们的去除。在相互括抗作用的另一个 实例中，向脂肪酸和阳离子馨合固体的混合物添加阴离子馨合固体（其应当对脂肪酸是惰 性的）将通过阳离子固体和脂肪酸的已有括抗性组合成功去除的污染物释放回抗体溶液。 当正常括抗的组分W适宜平衡的比例混合时，它们形成窗，在该窗内其能够去除不能被任 一单个组分有效地去除的污染物，诸如某些抗体片段。在许多情况下，公开的方法的总纯化 性能超过蛋白A亲和色谱的能力，蛋白A亲和色谱通常被认为是可利用的进行抗体纯化的 最佳方法。
[0007]在另一个运样的实施方案中，收获物可W通过与一个或多个带正电荷的表面接触 而被调节。在另一个运样的实施方案中，澄清方法设及使所需的产物制剂与可溶性和/或 不溶性多价有机离子接触，由此提出了在调节性组分之间的固有括抗作用的其他实例，所 述可溶性和/或不溶性多价有机离子中的任一种可W是阴离子性的或阳离子性的。
[0008] 在一个或多个前述实施方案中，用多价有机离子调节蛋白制剂包括使样品与正 电性有机添加剂接触。在一些运样的实施方案中，正电性有机添加剂包括来自由下列各 项组成的组的至少一种物质：依沙叮晚、亚甲蓝、十六烷基=甲基漠化锭。在一些运样的 实施方案中，运样的物质的浓度、或物质组合的聚集体浓度在0. 001-1 %、或0. 01-0. 1%、 0.02-0. 05%的范围。在一些运样的实施方案中，制剂的抑可W被上调至不会导致所需蛋 白的回收率显著减小的碱性值。在一个运样的其中所需蛋白是IgG单克隆抗体的实施方案 中，抑可W被上调至所述抗体等电点的半个抑单位内的抑值，或如果实验结果表明抗体 回收率是可接受的，则抑可W被上调至更高抑单位内的抑值，但运样的调整通常不是必 不可少的。就做出任何抑调整而言，蛋白等电点的1个抑单位内或1. 5个抑单位内的值 将是足够的。
[0009] 在一个或多个前述实施方案中，用多价有机离子调节蛋白制剂包括使样品与负电 性有机添加剂接触。在一些运样的实施方案中，负电性有机添加剂包括来自由下列各项组 成的组的至少一种物质：庚酸、庚締酸、辛酸、辛締酸、壬酸、壬締酸、癸酸、甲基蓝。在一些运 样的实施方案中，运样的物质的浓度、或物质组合的总浓度在0. 001-10%、或0. 01-1 %、或 0. 1-0.5%的范围。在一些运样的实施方案中，制剂的抑可W被下调至不会导致所需蛋白 的回收率显著减小的酸性值。在一些运样的实施方案中，制剂的抑可W被调整至3. 5-6. 5、 4. 0-6. 0、4. 5-5. 5、5. 0-5. 3、5. 15-5. 25 的范围，或 5. 2,或另一中间值。
[0010] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白制剂包括使样品与未溶 解的尿囊素接触。在一些运样的实施方案中，所添加的驻留在蛋白制剂中的尿囊素的量可 W达到约 0.6%-50%,或 0.7-20%,或 0.8-10%,或 0.9-5%,或 1-2%,或中间值。显 然粒度越小，每单位质量的表面积越大，并且由于在粒子表面处介导该过程，因此平均粒度 越小，每单位质量的效率越大。
[0011] 在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节蛋白制剂包括使样品与处于 低于其临界胶团浓度的非离子或两性离子表面活性剂接触。
[0012] 在一个或多个前述实施方案中，用多价有机离子调节蛋白制剂包括：（i)提供第 一组分，所述第一组分是具有负电性表面的第一固体基底；（ii)使蛋白制剂与第一组分接 触，其中操作条件基本上防止所需蛋白与第一组分结合；和（iii)使具有减少的染色质含 量的所需蛋白与第一组分分离。在一些运样的实施方案中，第一负电性表面可W伴随有第 二负电性表面。
[0013] 在一个或多个前述实施方案中，用多价有机离子调节蛋白制剂包括：（i)提供第 一组分，所述第一组分是具有正电性表面的第一固体基底；（ii)使蛋白制剂与第一组分接 触，其中操作条件基本上防止所需蛋白与第一组分结合；和（iii)使具有减少的染色质含 量的所需蛋白与第一组分分离。在一些运样的实施方案中，第一正电性表面带有=(2-氨 基乙基）胺的残基。在一些运样的实施方案中，第一正电性表面可W伴随有第二正电性表 面。
[0014] 在一个或多个前述实施方案中，用多价有机离子调节蛋白制剂包括：（i)提供第 一组分，所述第一组分是具有正电性表面的第一固体基底；（ii)提供第二组分，所述第二 组分是具有负电性表面的第二固体基底；（iii)使蛋白制剂与第一和第二组分接触，其中 第一和第二组分被配置成使得蛋白制剂可W同时接触两种组分，其中操作条件基本上防止 所需蛋白与第一或第二组分结合；和（iv)使具有减少的染色质含量的所需蛋白与第一和 第二组分分离。在一些运样的实施方案中，第一正电性表面携带=(2-氨基乙基）胺的残 基。
[0015] 在一个或多个前述实施方案中，用多价有机离子调节蛋白制剂包括：（i)使蛋白 制剂与至少一个固体表面接触，所述固体表面包含至少一种能够结合金属的结合于表面的 配体，其中所述能够结合金属的结合于表面的配体初始地基本上不含有金属，其中选择操 作条件W基本上防止所需蛋白与所述至少一个固体表面的结合，W及（ii)将蛋白制剂与 至少一种结合于表面的配体分离。
[0016] 在一个或多个前述实施方案中，已经用可溶性正电性或负电性有机添加剂和/或 携带负电性、正电性或金属亲和配体的固体表面处理的蛋白制剂可W随后流动通过其流体 接触表面包含正电荷的装置。
[0017] 在一个说明应用针对染色质的澄清方法的实施方案中，将尿囊素W1% (v/v)的 量加入至细胞培养收获物。细胞培养物可W含有细胞，或所述细胞可W提前被去除。加入 亚甲蓝至0.025% (w/v)的浓度。可选地，可W加入依沙日丫晚至0.025%的浓度。可选地， 可W加入0. 025%十六烷基=甲基漠化锭至0. 025%的浓度。可选地，加入0. 01 %氯己定。 可选地，可W使用其他正电性有机添加剂或其组合。然后将混合物揽拌解育2小时。携带 正电性金属亲和配体=(2-氨基乙基）胺灯REN)的粒子W2-5%v:v的量加入。将混合物 解育揽拌4小时，然后通过任意方便的手段去除固体。剩余的含有所需蛋白的溶液可W任 选地流动通过在其流体接触表面上携带正电荷的深度过滤器。
[0018] 在另一个说明应用针对染色质的调节方法的实施方案中，将尿囊素W1% (v/v) 的量加入至细胞培养收获物。细胞培养物可W含有细胞，或所述细胞可W提前被去除。加 入0.6 %庚酸。可选地加入0.5 %庚締酸。可选地加入0.4%辛酸。可选地加入0.4%辛締 酸。可选地加入0.3%壬酸。可选地加入0.4%壬締酸。可选地加入0.2%癸酸。可选地， 加入0.5%甲基蓝。可选地，可W使用运些或其他负电性有机添加剂的组合。然后将混合物 解育揽拌2小时。携带正电性金属亲和配体=(2-氨基乙基）胺灯REN)的粒子W2-5% v:v的量加入。将混合物解育混合4小时，然后通过任