应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫检测技术领域，尤其是涉及一种应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法。
【背景技术】
[0002]组蛋白修饰是调控基因表达的重要表观遗传学机制，在保持细胞的全能性以及癌症的病理过程中起到了重要的作用。组蛋白修饰染色体免疫共沉淀(Ch1matinImmunoprecipitat1n, ChIP)方法是研宄体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研宄。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。目前该方法普遍适用细胞样本，而在临床组织样本应用中尚未稳定，且没有达到广泛应用的目的，导致无法针对国内重要疾病(肺癌、胃癌、肝癌等)进行研宄。
[0003]目前ChIP-Seq技术中对染色体预处理方法均采用交联方法ChIP (Cross-1 inkedChIP,以下简称XChIP)，即用甲醛对DNA-蛋白质进行可逆的交联反应，用超声波处理(sonicat1n)将染色体片段化。但是，XChIP的效果受到交联时间、甲醛浓度、超声波处理时间和强度等诸多因素影响，交联一超声波一解交联三个步骤的实验条件需要协同探讨。由于组织样本与细胞样本存在着很大的区别，在前期处理组织样本上，需要进行条件优化，分离出细胞个体，达到抗体结合的最佳效率。另外由于组织的特异性，交联效率和过程可能造成一些抗原决定簇被封闭掉，使得原本特异性很好的抗体在交联处理后特异性降低，假阳性升高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法。
[0005]本发明的方法是采取用组织样本个体细胞的分离、微球菌核酸酶(MicrococcalNuclease,以下简称MNase)与超声等各环节优化技术相结合，来切割自然状态下的染色体ChIP (简称NXChIP)。ChIP前期时，优化对组织样本的无损伤式细胞个体分离，NXChIP采取酶切技术处理，从而减少ChIP的损失率；同时鉴于组蛋白H3和H4跟DNA结合非常紧密，因此在本方法中不进行甲醛的前期固定。另外，用Mnase酶切割核小体之间的Iingker区，即可获得单个的核小体。因此，该技术也很适合适合单个核小体(即核小体分辨率，Nucleosoome resolut1n)的研宄。同时也因为Mnase的这一特性使NChIP不适合用于非组蛋白的研宄，这时就需要用NXChIP来解决。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0007]一种应用于组织样本中组蛋白修饰染色体免疫共沉淀方法，包括以下步骤:
[0008](I)组织样本前处理:
[0009]取组织样本切割成l-3mm3块状，加预冷的含有蛋白抑制剂的PBS洗涤剂(含I X蛋白抑制剂protein inhibitor，即稀释至一倍)洗涤3次；所述的蛋白抑制剂具体由AEBSF> EDTA、Leupeptin 及 Pepstatin A 组成。
[0010](2)组织单细胞分离:
[0011]用组织研磨器，在冰浴中研磨后，用无菌纱布过滤，收集滤液，在显微镜下观察，对活细胞进行计数，收集活细胞(lOOOrpm, 1min)；
[0012](3)细胞裂解与酶消化:
[0013]收集步骤⑵滤液中的细胞，悬浮在酶切消化缓冲液(含有50mM Tris-HClUmMCaCl2、0.2v/v% Triton X-100 或 NP-40，pH 为 7.6)中，37°C水浴 2 分钟；
[0014](4)微球菌核酸酶酶切反应:
[0015]将加入酶切消化缓冲液的细胞，加入酶活力为0.1-0.8U的微球菌核酸酶，37°C酶切5分钟后，加入与微球菌核酸酶等量的酶切终止液(含有1mM Tris与5mM EDTA, pH为7.6)；
[0016](5)超声破碎:
[0017]在冰浴下，使用B1ruptor超声仪，对步骤(4)所得液进行9000g高频超声5分钟，然后4°C离心5分钟，得到破碎的染色质溶液；
[0018](6)抗体结合:
[0019]取Protein A/G，用500ml含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS缓冲液洗涤三次后，加入250ul含5mg/ml牛血清白蛋白的PBS缓冲液，再加2_5ug抗体，4°C孵育2_4小时后，加入破碎的染色质溶液，4°C过夜孵育；
[0020](7) ChIP 后的 DNA 提取:
[0021]孵育过后的溶液，在磁力架上用高盐溶液多次洗涤，洗涤后用TE溶液(含有1mMTris与5mM EDTA, pH为7.6)洗脱磁力珠上的DNA，用纯化液(体积比25:24:1的酚、氯仿与异戊醇的混合液)纯化提取DNA，用超纯水溶解DNA。
[0022](8)方法有效性评估:
[0023]用实时定量PCR方法检验ChIP的富集程度。
[0024]与现有技术相比，本发明采用组织样本前期处理与细胞分离，能够有效的提高抗体的沉淀效率；其次，采用酶切和超声相结合的方法，不仅能够有效的获取染色质片段，而且能够得到染色质上核小体，能够在高通量水平上精准定位组蛋白或转录因子的结合位点，提尚了临床样本的检测效果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026]实施例1
[0027]采取临床肺腺癌组织样本。具体方法如下:
[0028]在无菌条件下，采集约30-50mg肺腺癌组织，将组织切割成l_3mm3块状。加预冷的Iml PBS(含IX蛋白抑制剂protein inhibitor)洗涤3次；用组织研磨器，在冰浴中研磨后，用无菌纱布过滤，收集滤液，在显微镜下观察，对活细胞进行计数，收集1M(百万)的活细胞(lOOOrpm, 1min)。收集细胞，悬浮在300ul酶切消化缓冲液(50mM Tris-HCl, pH7.6 ；ImM CaCl2；0.2% Triton X-100 (or NP-40))中，37 度水浴 2 分钟。加入 0.4U 的 MNase 酶，37 度酶切 5 分钟后，加入 300ul 酶切终止液(1mM Tris, pH7.6，5mM EDTA)。用 B1ruptor超声仪高频、冰浴超声5分钟，9000g，4度离心5分钟，取出10ul溶液作为input。取1ulProtein A/G，加 500ml PBS (5mg/ml BSA)洗涤三次，加 250ul PBS (含有 5mg/ml BSA)，再加2-5ug抗体，4度孵育2-4小时后，加入破碎的染色质溶液，4度过夜孵育。孵育过