一种利用rflp鉴定蛋白与dna结合互作的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种利用RFLP鉴定蛋白与DNA结合互作的方法。
【背景技术】
[0002]随着大量生物基因组测序工作的完成，研宄基因功能和调控机制成为后基因组时代的核心内容。蛋白反式作用因子(trans-acting factor)与核酸尤其是DNA序列上的顺式作用元件(cis-acting element)的相互作用关系是研宄基因表达转录调控机制的重要内容。
[0003]目前，利用酵母单杂交或染色质免疫共沉淀等技术筛选到的与特定DNA序列结合的候选蛋白通常是用足迹法(DNase footprinting assay)和凝胶电泳迀移法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)进行验证。足迹法主要是基于核酸酶DNAaseI能够随机切割DNA分子，但被蛋白结合的DNA特定区域则不能被DNAaseI切割，并在电泳胶上显示一个特定“足迹”带型的原理来确定DNA与某一蛋白的互作关系；凝胶电泳迀移法则是基于特定蛋白若能结合目的DNA形成复合体，在电泳时，该复合体迀移速度减慢而导致电泳条带滞后的现象而确定蛋白与DNA的结合作用。
[0004]现有技术中，为了展示目标DNA的位置和提高检测的灵敏度，这两种方法通常需要使用放射性同位素或荧光素生物素等标记目的DNA分子。由此，增加了实验成本，更严重的问题是放射性同位素还会对操作者及环境造成伤害，以及只有具备特别资质和许可的实验室才能开展相关实验。此外，凝胶电泳迀移法由于DNA和蛋白形成的复合体通常靠亲和力而非共价键形式，因此复合体容易在电泳过程发生解离，影响实验结果的灵敏度、质量和可靠性，对于较弱的相互作用难以获得清晰明了的结果。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有鉴定蛋白与DNA互作方法中所存在的上述缺陷，提供一种利用RFLP鉴定蛋白与DNA互作的方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的:
一种利用RFLP鉴定靶蛋白与DNA结合互作的方法，包括以下步骤:
51.分析待测DNA序列中所有的限制性内切酶位点；
52.选择限制性内切酶，使得该内切酶能切割N个被靶蛋白覆盖的DNA序列中自然存在的酶切位点或通过突变得到的酶切位点，和M个被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列中存在的酶切位点；其中，N为大于O的整数，M为大于等于O的整数；被靶蛋白覆盖的DNA序列包括核心序列和侧翼序列；
53.将待测DNA序列和靶蛋白混合反应后，加入S2选择的限制性内切酶进行酶切反应和结果判定，所述结果判定为:若出现M+1条条带，则表明靶蛋白与待测DNA结合；若出现N+M+1条条带，则表明靶蛋白与待测DNA不结合。
[0007]目的蛋白(这里定义为靶蛋白)与目标DNA的特异结合位点是一个很短的序列，这个序列被称为核心序列(core sequence)，一般为4?10 bp左右。该核心序列通常是保守的，一般上，靶蛋白在目标DNA分子结合所占据的位置比核心序列要长(即被靶蛋白覆盖的DNA序列要比与靶蛋白相结合的核心序列长)。与核心序列紧密相邻的受靶蛋白覆盖的两侧的序列称为侧翼序列(flanking sequence)，这部分序列碱基的任何改变都不影响该DNA与靶蛋白的结合(图1)，当某一目标DNA与靶蛋白X结合互作时，位于核心序列和靶蛋白占据的侧翼序列上的限制性内切酶位点(restrict1n endonuclase site，RES)由于革巴蛋白结合而受到保护，不被限制性内切酶识别和切割。
[0008]本发明所述方法是通过比较结合蛋白以及限制性内切酶存在与否的多个组合反应条件下的酶切图谱的多态性，来决定靶蛋白X是否与目标DNA结合。如果靶蛋白X会保护核心序列或侧翼序列上的限制性内切酶位点免受切割，则表明靶蛋白X与目标DNA结合互作，否则表示靶蛋白X不与目的DNA结合互作，原理如图1所示。
[0009]在实际操作过程中，首先选择一段长约100?500 bp包含结合核心元件的DNA序列，利用序列分析软件分析该序列中所含有的限制性内切酶位点分布。尽可能优先利用位于核心序列中固有的的限制性内切酶位点；如在核心序列里没有可利用的限制性内切酶位点，则可通过改变侧翼序列中的若干核苷酸人为新创造一个限制性内切酶位点，且该位点越靠近核心序列越理想。之后，通过普通的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较含有与不靶目的蛋白以及含有与不含有限制性内切酶的不同组合的多个酶切体系中，目标DNA被切割的带型，确定靶蛋白与DNA的结合互作关系。
[0010]本发明所述鉴定方法是基于上述原理实现的，在实际操作中，可以将待测DNA分为两段序列，第一为被靶蛋白覆盖的DNA序列，第二为被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列，只需要保证选择的限制性内切酶能切割位于核心序列和侧翼序列上的酶切位点即可，至于酶切位点的个数和位置不作具体限定，此时，可以分为多种情况(此处仅列举，不穷举):
1、核心序列上自然存在一个或2个相同酶切位点，侧翼序列和被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列都不存在酶切位点，选择的限制性内切酶与该位点相对应，利用本发明上述方法，若仅仅出现一条条带，且与待测DNA序列大小一致，则表明靶蛋白待测DNA序列结合；若出现2条(或3条)条带，则代表靶蛋白与待测DNA不结合。
[0011 ] 2、核心序列上自然存在一个酶切位点，侧翼序列不存在酶切位点，被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列存在一个相同酶切位点，利用本发明所述方法，若出现2条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列结合，若出现3条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列不结合。
[0012]3、核心序列上自然存在一个酶切位点，侧翼序列和被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列各存在一个相同酶切位点，利用本发明所述方法，若出现2条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列结合，若出现4条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列不结合。
[0013]4、核心序列本身不存在酶切位点，那么可以在侧翼序列寻找酶切位点，若有I个酶切位点，且被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列不存在相同酶切位点，利用本发明所述方法，若仅仅出现一条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列结合，若出现2条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列不结合；若被靶蛋白覆盖的DNA序列以外的序列也存在I个酶切位点，则判定结果为:若出现2条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列结合，若出现3条条带，则表明靶蛋白与待测DNA序列不结合。
[0014]5、侧翼序列上若也没有酶切位点，则可以通过突变侧翼序列创造酶切位点，最后在选择与突变后的酶切位点相对应的酶进行鉴定，其判定规则与4类似。
[0015]因此，优选地，本发明所述方法中，选择的限制性内切酶切割
(1)核心序列中存在的内切酶位点和/或侧翼序列中存在的内切酶位点；
或
(2)通过突变侧翼序列产生的内切酶位点。
[0016]另外，发明人还发现，在核心序列或/和侧翼序列中，选择的限制性内切酶切点数越少越容易辨别切割带型，唯一酶切位点最理想；因此，优选地，S2选择的限制性内切酶唯一切割
(1)核心序列中存在的内切酶位点，或
(2)侧翼序列中存在的内切酶位点，或
(3)通过突变侧翼序列产生的内切酶位点。
[0017]发明人通过实验研宄发现，在侧翼序列上选择限制性内切酶位点时，S2选择的限制性内切酶切割靠近核心序列10 bp以内的侧翼序列中的酶切位点，其鉴定结果更有效。
[0018]作为一种优选的实施方案，本发明所述靶蛋白为水稻B3蛋白，所述待测DNA序列为含有顺式元件RY的RY-DNA ;具体地，包括以下步骤:
51.分析RY-DNA中所有的限制性内切酶位点；
52.选择限制性内切酶，使得该内切酶切割和B3蛋白相结合的RY-DNA核心序列和侧翼序列组成的内切酶位点；所述内切酶位点为ATGCAT ；
53.将RY-DNA和B3蛋白混合反应后，加入NsiI酶进行酶切反应和结果判定，所述结果判定为:若出现与RY-DNA大小一致的条带，则表明B3蛋白与RY-DNA核心序列结合；若出现RY-DNA大小的2条条带，则表明B3蛋白与RY-DNA核心序列不结合。
[0019]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种利用RFLP鉴定蛋白与DNA结合互作的方法；即利用天然存在或人工设计位于目标DNA蛋白结合覆盖区域的限制性内切酶位点，在有结合蛋白的情况下，因被结合蛋白占据保护而不被相应的限制性内切酶识别和切割，与对照反应形成不同的凝胶电泳多态带型的原理来确定目的蛋白是否与目标DNA结合互作的新技术。由于本发明检测的不是DNA/蛋白复合物，而是酶切反应后的目标DNA片段，可以在常规的凝胶中通过DNA染色就能检测到清晰的DNA带型，且无需放射性同位素或荧光生物素等标记；本发明的技术原理简单、操作方便，可高效清晰鉴定蛋白与DNA的结合互作关系。
【附图说明】
[0020]图1为本发明所述方法的原理示意图。
[0021]图2为实施例1所述野生型RY-DNA (W)序列和酶切位点