专利名称：一种用于检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体为检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡。
背景技术：
视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein, RBP)是ー类在人体内负责从肝脏转运视黄醇至各组织细胞的运载蛋白，对视黄醇生理功能的发挥起着重要作用。RBP主要在肝脏中合成。肝脏中分泌的RBP-视黄醇聚合物与转铁蛋白(Transthyretin, TTR)形成稳定的蛋白复合物在血液系统中循环。RBP-视黄醇-TTR复合体在视黄醇释放后解体，RBP以游离形式存在于血液系统中，由肾小球滤过，再由近端小管上皮细胞重吸收、降解。因此正常人尿液中几乎不含有RBP (含量低于300ng/ml)。若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。因此，在肾小管损伤病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可达到正常人的5倍以上，严重者其尿液中的RBP含量甚至可以达到10000ng/ml以上。故尿液中RBP增高具有早期诊断意义，被认为是肾小管损伤的ー个良好的早期标志物，对RBP的检测已经被广泛应用于临床上对肾脏损伤的诊断中。目前，医院常用的检测RBP的方法是基于免疫比浊法或酶联免疫吸附法(ELISA)。但上述方法步骤比较繁琐，測量时间较长，结果易受操作者技术水平等的影响，不确定性因素较多。而且要求操作者具有一定的操作技能，同时配备酶标仪，因此检测成本相对较高。为了达到简便、快速、高效和经济的检测尿RBP的要求，我们提出开发视黄醇结合蛋白4检测试剂盒(胶体金免疫层析法)，意在建立一种肾小管损伤诊断的新技木。另外，通过专利检索，发现目前没有通过使用胶体金免疫层析法检测RBP4来诊断肾小管损伤的相关试剂盒专利。
发明内容
本发明g在提供一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物。本发明还提供了人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡及试剂盒。一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其制备方法包括以下步骤将人视黄醇蛋白4 (RBP4)单克隆抗体I标记于胶体金颗粒表面将含有胶体金颗粒的溶液PH调节至8. 2 8. 7，加入人视黄醇蛋白4单克隆抗体I，震荡反应5 15分钟，用BSA封闭后离心，沉淀用硼酸缓冲液重悬后再次离心纯化；弃去上清取下层液体，即得到人视黄醇蛋白4的抗体复合物。胶体金颗粒的粒径为10 30nm,优选20nm。人视黄醇蛋白4 (RBP4)单克隆抗体I与胶体金颗粒用量比为I 8μ g :lmg,优选为5 μ g :lmg ;胶体金颗粒溶液浓度为0. 5 2mg/mL,优选为lmg/mL。所得到的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物可用于制备检测视黄醇结合蛋白4的试剂及试剂盒。所得到的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物进ー步用来制备视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡其结构包括结合垫、样品垫、分析膜和吸水纸，分析膜上包括检测线(T线)和质控线(C线)。结合垫的制备方法为用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液混合(用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液的混合体积比为1:15 30，优选为1:20)后喷在结合垫材料上，结合垫的材料选自玻璃纤维素膜；胶体金稀释液为O. 03 O. 08mol/L、pH=7. 8 8. 2 的 Tris-HCl 缓冲液，含 O. 5% I. 0%BSA, O. 3% O. 8% 聚こ烯基吡咯烷酮PVP，O. 2% O. 5%聚こ烯醇PEG，I. 0% 3. 0%蔗糖，O. 1% O. 3%吐温-20 ；聚こ烯醇的分子量为10000 25000。样品垫的制备方法为样品垫材料用处理液浸泡并干燥，样品垫材料选自玻璃纤维素膜；处理液为pH=7. 2 7. 4,0. 01 O. 02mol/L的磷酸缓冲液，含O. 5% I. 0%BSA,O. 3% O. 8%こ烯基吡咯烷酮，O. 1% O. 3%吐温-20。分析膜的制备方法为在分析膜上喷点RBP4单克隆抗体2和羊抗鼠IgG抗体，羊抗鼠IgG抗体在上形成质控线(C线)，RBP4单克隆抗体2在下形成检测线(T线)，烘干；分析膜的材料为硝酸纤维素膜(NC膜)。将上述样品垫、结合垫、分析膜和吸水纸依次粘贴在底板上，切成4mm宽的检测试纸条并装在塑料外壳中，得到人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡。一种视黄醇结合蛋白4检测试剂盒，包括上述视人黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡、一次性塑料滴管和样品稀释液，样品稀释液为PH7. 2 7. 4,0. 005 O. 02mol/L的磷酸缓冲液，含有3% 6%BSA和O. 3% O. 5%防腐剤。本发明的视黄醇结合蛋白4检测试剂盒，利用胶体金免疫层析法，是ー种快速、简便、无创的检测试剂通过将抗原-抗体免疫学反应与层析技术相结合，并以干片法试纸的形式，达到对尿液中RBP4含量的定性及定量检测，是ー种用于临床辅助诊断和体检筛查的检测方法。该免疫层析检测试剂盒灵敏度好，特异性強。
图I为人黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡的结构示意图其中I一样品塾，2—结合塾，3—分析膜，31—检测线(T线),32—质控线(C线)，4一吸水纸,5—底板。
具体实施例方式试剂RBP4单克隆抗体I和RBP4单克隆抗体2 (上海柏纳生物技术有限公司);胶体金，颗粒粒径20nm。实施例I :胶体金-RBP抗体复合物的制备
用O. ImoVLK2CO3将Iml浓度为lmg/mL的胶体金(颗粒粒径20nm)溶液pH调至8. 5，然后将5μ g RBP4单克隆抗体I加入到胶体金溶液中，室温震荡反应10分钟，然后用10%BSA溶液封闭，低温离心，用浓度O. 002mol/L、pH=9. O硼酸缓冲液重悬至原体积，再次离心纯化，弃去上清，取下层液体4°C保存。
实施例2 :视黄醇结合蛋白4 (RBP4)免疫层析检测卡的制备2. I样品垫的制备选用玻璃纤维素膜作为样品垫材料，将其放入处理液(pH=7. 4、0· OlM磷酸缓冲液PBS,含O. 5% I. 0%BSA, O. 3% 0· 8%こ烯基吡咯烷酮PVP，O. 1% O. 3%吐温-20)中浸泡10分钟后取出，37°C烘干备用。2. 2结合垫的制备选用玻璃纤维素膜作为结合垫材料，将上述实施例I所制备的胶体金-RBP抗体复合物按1:20的体积比重新分散于胶体金稀释液(O. 05mol/L、pH=8. OTris-HCl缓冲液，含O. 5% I. 0%BSA, O. 3% O. 8%聚こ烯基吡咯烷酮，O. 2% O. 5%聚こ烯醇2万，I. 0% 3. 0%蔗糖，O. 1% O. 3%吐温-20，均为重量百分比)中，并喷于结合垫上，37°C烘干。2. 3硝酸纤维素膜(NC膜)的包被，制备分析膜用点膜仪在NC膜的不同位置喷点RBP4单抗2及羊抗鼠IgG抗体，自下至上依次为质控线(羊抗鼠IgG抗体)、检测线(RBP4单抗2)，37°C烘干，如图I所示。2. 4组装将吸水纸、分析膜、结合垫、样品垫依次贴在带有粘合剂的底板上，如图I所示；并切成4cm宽的试纸条，装在塑料外壳中(即装卡)。实施例3 :样品稀释液的制备配制一定浓度的磷酸缓冲液PBS (O. 01mol/L, pH7. 2 7· 4)，添加适量的保护蛋白BSA (终浓度5%)，最后加入防腐剂Proclin 300 (O. 3% O. 5%)。将配好的样品稀释液按15mL的量分装到塑料试剂瓶中即得到RBP4样品稀释液。实施例4 :胶体金免疫层析法视黄醇结合蛋白4 (RBP4)检测试剂盒的制备4. I将实施例2制备的人视黄醇结合蛋白4 (RBP4)免疫层析检测卡、一次性塑料滴管和干燥剂一起装入铝箔袋中，封ロ机封ロ，得到I人份的检测试剂。4. 2将20人份检测试剂、I瓶样品稀释液以及I份说明书装在包装盒中。实施例5 =RBP标准溶液的检测5. I将RBP4标准品用PBS作为稀释液配置成系列标准液250ng/mL、300ng/mL，500ng/mLo5. 2将上述标准液分别准确稀释60倍，用一次性塑料滴管分别吸取2滴标准液滴加到检测卡的加样孔中，10分钟后观测結果。结果为阳性则质控线和检测线均显红色；结果为阴性则质控线显色，检测线不显色。实施例6 :性能测试6. I灵敏度对同一批试剂盒用标准溶液进行检测，实验结果为250ng/mL时为阴性，300ng/mL时为弱阳性，500ng/mL时为阳性，即灵敏度为300ng/mL。6. 2特异性取同一批试剂盒，对5例阴性质控品进行检测，阴性质控品分别为尿微量白蛋白(20000ng/ml)、转铁蛋白(2 X 106ng/ml)、纤维连接蛋白(300ng/ml)、β 2-微球蛋白(200ng/ml)、溶菌酶(2000ng/ml)，检测结果100%为阴性。6. 3.重复性6. 3. I批内差异
取同一批号试剂盒，分别检测300ng/mL和500ng/mL阳性质控品各5次,检测结果100%为阳性，反应结果应一致，显色应均一；质控线显色，检测线显色为红色。6. 3. 2批间差异取3个批号的试剂盒检测500ng/ml阳性样本各5次，检测结果100%为阳性，反应结果应一致，显色应均一；质控线显色，检测线显色为红色。6. 4.稳定性 试剂盒在37°C条件放置20d后，灵敏度和重复性结果依然符合6. 1-6. 3。
权利要求
1.一种用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，制备方法为将人视黄醇蛋白4单克隆抗体I标记于胶体金颗粒表面，包括以下步骤 将含有胶体金颗粒的溶液PH调节至8. 2 8. 7，加入人视黄醇蛋白4单克隆抗体1，震荡反应5 15分钟，封闭后离心、沉淀重悬后再次离心纯化。
2.权利要求I所述用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，所述胶体金颗粒的粒径为10 30nm，含有胶体金颗粒的溶液浓度为O. 5 2mg/mL。
3.权利要求I所述用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在干，人视黄醇蛋白4单克隆抗体I与胶体金颗粒用量比为I 8μ g :lmg。
4.权利要求I所述用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物，其特征在于，用pH=8.5 9. 5、浓度为O. 001 O. 005mol/L的硼酸缓冲液重悬沉淀。
5.人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，结构包括结合垫、样品垫、分析膜和吸水纸，分析膜上包括检测线和质控线； 所述的结合垫上含有权利要求I 4任一项所述的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物； 所述的检测线上含有人视黄醇蛋白4单克隆抗体2。
6.权利要求5所述人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，所述质控线上含有羊抗鼠IgG抗体。
7.权利要求5所述人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，所述结合垫的制备方法为用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物与胶体金稀释液混合按1:15 30的体积比混合后喷在结合垫材料上； 样品垫的制备方法为样品垫材料用处理液浸泡并干燥。
8.权利要求7所述人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡，其特征在于，样品垫材料选自玻璃纤维素膜；结合垫材料选自玻璃纤维素膜；处理液为pH=7. 2 7. 5,0. 005 0.02mol/L的磷酸缓冲液，含O. 5% I. 0%BSA，0. 3% O. 8%聚こ烯基吡咯烷酮，O. 1% O. 3%吐温-20 ； 胶体金稀释液为O. 03 O. 08mol/L、pH=7. 8 8. 2的Tris-HCl缓冲液，含O. 5% 1.0%BSA, O. 3% O. 8%聚こ烯基吡咯烷酮，O. 2% O. 5%聚こ烯醇，I. 0% 3. 0%蔗糖，O.1% O. 3%吐温-20，聚こ烯醇的分子量为10000 25000。
9.一种检测人视黄醇结合蛋白4的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5 8任ー项所述的人视黄醇结合蛋白4的免疫层析检测卡和样品稀释液，所述样品稀释液为pH7. 2 7.4,0. 005 O. 02mol/L的磷酸缓冲液，含有3% 6%BSA和O. 3% O. 5%防腐剤。
10.权利要求I 4任一项所述的用于检测人视黄醇蛋白4的抗体复合物在制备检测人视黄醇蛋白4的试剂方面的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，具体为检测人视黄醇结合蛋白4的抗体复合物及免疫层析检测卡，将人视黄醇结合蛋白4单克隆抗体1与胶体金颗粒连接，得到的抗体复合物用来制备人视黄醇结合蛋白4疫层析检测卡和试剂盒，具有灵敏度好，特异性强等优点。
文档编号G01N33/558GK102650642SQ20121014159
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者沈鹤柏, 邢国杰 申请人:上海师范大学