改进的抗血清清蛋白结合性单可变区的制作方法

专利名称：改进的抗血清清蛋白结合性单可变区的制作方法
改进的抗血清清蛋白结合性单可变区本发明涉及改进的抗血清清蛋白免疫球蛋白单可变区，以及包含所述结构域的配体和药物偶联物、组合物、核酸、载体和宿主。
背景技术：
W004003019和W02008/096158公开了抗血清清蛋白(SA)结合部分，比如具有可用于治疗的半衰期的抗SA免疫球蛋白单可变区(single variable domains，dAbs)。这些文件公开了抗SA dAbs单体，以及包含这种dAbs的多特异性配体，象例如包含抗SA dAb和特异结合靶抗原(比如TNFR1)的dAb的配体。公开的结合部分能够特异结合来自一个以上物种的血清清蛋白，例如人/小鼠交叉反应性抗SA dAbs。W005118642和W02006/059106公开了将抗SA结合部分，比如抗SA免疫球蛋白单可变区，与药物进行偶联或关联，从而提高药物的半衰期的概念。其中公开并示范了蛋白、 肽和NCE(化学实体)药物。W02006/059106公开了利用这一概念提高促胰岛素分泌剂，例如诸如胰升糖素样肽(GLP)-I的肠促胰岛素的半衰期。还可参考Holt et al,"Anti-Serum Albumin domain antibodies for extending the half-lives of short lived drugs，，，Protein Engineering, Design&Selection, vol21, no 5，pp283-288，2008。希望提供能够与血清清蛋白，优选来自人和非人物种的清蛋白特异结合的改进的重链可变区dAbs，则可用于疾病动物模型和人类的治疗和/或诊断。还希望提供亲和力温和的和亲和力高的抗SA结合部分(dAbs)的选择。所述部分可以与药物连接，抗SA结合部分的选择根据预期的终端应用进行。这使得根据所选的抗SA结合部分，药物能够更好地用于治疗和/或预防慢性或急性适应症。还希望提供在溶液中处于单体形式或者基本处于单体形式的抗SA dAbs。这对于为了拮抗受体，抗SA dAb与结合部分，例如特异结合细胞表面受体(比如TNFR1)的dAb连接的情况尤其有益。抗SA dAb的单体状态有利于减少受体交联的机会，因为形成多聚体的可能较小，而多聚体会结合并交联细胞表面的受体(例如 TNFR1)，从而增加受体激动和有害受体信号转导的可能性。能够提供具有较高熔解温度的抗SA dAbs也是有益的。这一点对于提供稳定制剂(例如可以稳定保存的制剂)和半衰期良好的可变区很有用。发明概述本发明的各方面解决了这些问题。因此发明的一个方面提供了抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单可变区，其包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs =97-191和198-203的氨基酸序列至少80%相同。发明的一个方面提供了抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单可变区，其包含的氨基酸序列与选自SEQ ID NOs :97-191和198-203的氨基酸序列相比，含有最多4个氨基酸变化。发明的一个方面提供了抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单可变区，其包含的氨基酸序列由与选自SEQ ID NOs 1-96和192-197的序列至少80%相同的核苷酸序列编码。发明的一个方面提供了多特异性配体，所述配体包含发明所述抗SA可变区和能够特异结合SA之外的靶抗原的结合部分。发明的一个方面提供了发明所述抗SA单可变区，其中所述可变区与药物(任选是 NCE药物)偶联。发明的一个方面提供了融合产物，例如融合蛋白或者与肽或NCE(新化学实体)药物的融合，所述融合包含融合或偶联(对于NCE) 了本发明的任何抗SA可变区的多肽、蛋白、肽或NCE药物。例如，可变区包含SEQ ID NOs :97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列(或者与SEQ ID NOs =97-103和198-203中任一个的氨基酸序列至少95、96、97、98或 99%相同的氨基酸序列)或者由其构成。发明的一个方面提供了包含发明所述可变区、融合蛋白或配体以及药物可接受稀释剂、载体、赋形剂或媒介物的组合物。发明的一个方面提供了核酸，所述核酸包含的核苷酸序列编码本发明的可变区或多特异性配体或融合蛋白。发明的一个方面提供了核酸，所述核酸包含的核苷酸序列与选自SEQ ID NOs 1-96和192-197的序列至少80%相同。发明的一个方面提供了包含本发明的核酸的载体。发明的一个方面提供了包含本发明的载体的分离的宿主细胞。发明的一个方面提供了治疗或预防患者中疾病或紊乱的方法，所述方法包括将至少一个剂量的本发明的可变区或多特异性配体或融合蛋白给予所述患者。发明任一方面的实施方案提供了具有良好抗血清清蛋白亲和力的抗血清清蛋白单可变区。可变区的选择使得能够根据所需治疗和/或预防情景更好地调节半衰期。例如，在一个实施方案中，可变区对血清清蛋白的亲和力较高，则该可变区可以被包含在用于治疗和/或防止慢性或持续性疾病、状况、毒性或其他慢性适应症的产品中。在一个实施方案中，可变区对血清清蛋白的亲和力相对温和，则该可变区可以包含在用于治疗和/或防止急性疾病、状况、毒性或其他急性适应症的产品中。在一个实施方案中，可变区对血清清蛋白的亲和力中等，则该可变区可以包含在用于治疗和/或防止急性或慢性疾病、状况、毒性或者其他急性或慢性适应症的产品中。可想而知，对血清清蛋白具有合适高亲和力和特异性的分子能够在循环系统中停留足够长的时间而达到希望的治疗效果CTomlinson，Nature Biotechnology 22， 521-522(2004))。高亲和力抗S可变区在血清循环中停留的时间与该物种的血清清蛋白相当(W02008096158)。一旦进入循环，AlbudAb可变区上融合的任何治疗剂，无论是NCEJi 或蛋白，都能因此对目标作用更长时间，显示更长效的治疗效果。这样就可以在不需频繁给药的情况下针对慢性或持续性疾病。具有中等亲和力(但对SA有特异性)的可变区只在血清循环中短时间停留(例如，停留几个小时或几天)，使得融合的治疗剂能够特异靶向急性病涉及的治疗目标。以这种方式，有可能通过选择具有合适清蛋白结合亲和力和/或血清半衰期的抗 S可变区，使含有抗SA的产品被调集到疾病治疗区域。发明详述本说明书，并参考实施方案对发明进行了清楚简洁的描述。所述实施方案意图并且应当理解为可以按各种方式组合或分开，都不会脱离发明。
除非另有定义，文中使用的所有技术和科学名词与本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员通常理解的含义相同。分子、遗传禾口生物化学方法(一般可参见 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2d ed. (1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.禾口 Ausubel et al. , Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John ffiley&Sons, Inc.这些文献通过引用并入本文)和化学方法使用了常规技术。本文中，名词“肿瘤坏死因子受体I(TNFRl)拮抗剂”或“抗TNFRl拮抗剂”或类似的是指能够结合TNFRl并抑制TNFRl ( 一个或多个)功能的试剂(例如，分子、化合物)。例如，TNFRl的拮抗剂可以抑制TNF与TNFRl的结合和/或抑制由TNFRl介导的信号转导。 相应地，可以用TNFRl拮抗剂抑制TNFRl介导的过程和细胞反应(例如，标准细胞毒性检测中的TNF诱导的细胞死亡)。“患者”是动物、例如哺乳动物，例如非人灵长类(比如狒狒、猕猴或食蟹猴 (Cynomolgus monkey))、小鼠、人、兔、大鼠、犬、猫或猪。在一个实施方案中，患者是人。本文中，“肽”是指经由肽键连接在一起的大约两个到大约50个氨基酸。本文中，“多肽”是指通过肽键连接在一起的至少大约50个氨基酸。多肽通常包含三级结构，并折叠成功能结构域。本文中，抗体是指IgG, IgM, IgA, IgD或IgE或者片段(比如Fab、F(ab，)2、Fv、 二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体(closed conformation multispecific antibody)、二硫化物连接的scFv、双体)，无论它们是来源于任何天然产生抗体的物种，或者通过重组DNA技术制备的，或者分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。本文中，“抗体形式(antibody format) ”是指任何合适的多肽结构，其中引入了一或多个抗体可变区从而赋予对结构上抗原的结合特异性。本领域有多种已知的合适抗体形式，比如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、双特异抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同二聚体和杂二聚体、任何以上所述的抗原结合片段(例如Fv片段(例如单链Fv (scFv)，二硫键Fv)、Fab片段、Fab'片段、F (ab，)2片段)、单抗体可变区(例如 dAb、VH、VHH、^和任何以上所述的改造形式(例如通过共价结合聚乙二醇或其他合适聚合物或人源化Vra改造的形式)。短语“免疫球蛋白单可变区”是指独立于不同V区或结构域，特异结合抗原或表位的抗体可变区(VH、VHH、VJ。免疫球蛋白单可变区可以与其他可变区或可变区一起存在于某种形式(例如，同质或异质多聚体)，其中所述其他可变区或可变区对于单免疫球蛋白可变区结合抗原不是必需的(即免疫球蛋白单可变区与抗原的结合不依赖其他可变区)。“结构域抗体，，或“ dAb ”与本文中使用的名词“免疫球蛋白单可变区”相同。“单免疫球蛋白可变区”与本文中使用的名词“免疫球蛋白单可变区”相同。“单抗体可变区”或“抗体单可变区”与本文中使用的名词“免疫球蛋白单可变区”相同。免疫球蛋白单可变区在一个实施方案中是人抗体可变区，但也包括来自其他物种的单抗体可变区，比如啮齿动物(例如，象 WO 00/29004中公开的，该专利申请通过引用全文并入本文)、铰口鲨和骆驼科(Camelid) V11HdAbs0骆驼科Vhh是来自包括骆驼、大羊驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰驼(dromedary) 和原驼(guanaco)的物种的免疫球蛋白单可变区多肽，这些物种产生天然缺失轻链的重链抗体。Vhh可以被人源化。
“结构域”是折叠的蛋白结构，其具有独立于蛋白其他部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的分别的功能特性，许多情况中可以添加、去除或转移给其他蛋白，而不会造成蛋白和/或结构域其他部分的功能的丧失。“单抗体可变区”是包含抗体可变区特征序列的折叠多肽结构域。因此包括完整的抗体可变区和改造过的可变区，例如，其中的一或多个环替代为不是抗体可变区特有的序列，或者被截短的抗体可变区或者包含N-或C-端延伸的抗体可变区，以及可变区中至少保留全长结构域的结合活性和特异性的折叠片段。在本申请中，名词“防止(prevention或preventing) ”涉及在诱发疾病或状况前给予保护性组合物。“治疗(treatment或treating)”涉及在疾病或状况的症状变得明显后给予保护性组合物。“抑制(suppression或suppressing)，，是指在诱发事件后，但在临床表现出疾病或状况之前给予所述组合物。本文中，名词“剂量”是指给予受试对象的一次配体总量(单位剂量)或者在给定时间段内两次或多次给药的配体量。例如，剂量可以指在一天( 小时)(每日剂量)、两天、一周、两周、三周或者一或多个月的过程中(通过例如单次给药或者两次或多次给药) 给予受试对象的配体(例如，包含结合靶抗原的免疫球蛋白单可变区的配体)量。剂量之间的间隔可以是任何希望的时间大小。谈及剂量时，名词“药学有效的”意味着足够提供所需效果的配体、结构域或药学活性剂的量。根据个体的年龄和整体状况、具体药物或药学活性剂等，“有效的”量在受试对象之间会有不同。因此，有时无法确定所有患者都适用的准确 “有效”量。但本领域普通技术人员可以利用常规试验给任何个例确定合适的“有效”剂量。药代动力学分析和确定配体(例如单可变区、融合蛋白或多特异性配体)半衰期的方法是本领域技术人员熟悉的。详细可见Kenneth，A et al =Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists and in Peters et al. Pharmacokinetc analysis :A Practical Approach(1996)。还可参考"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi&D Perron, published by Marcel Dekker, 2ndRev. ex edition (1982)，该书描述了药代动力学参数，比如ta和ti3半衰期，以及曲线下面积(AUC)。任选地，本文引用的所有药代动力学参数和数值应当理解为在人体中的数值。任选地，本文引用的所有药代动力学参数和数值应当理解为在小鼠或大鼠或食蟹猴体内的数值。半衰期(tl/2a和tl/2i3)和AUC可以由配体随时间变化的血清浓度曲线来确定。可以利用例如5. 1版本的WinNonlin分析包(Pharsight Corp.，Mountain View, CA94040, USA提供)给例如曲线建模。当使用两室模型时，在第一相(α相)，配体主要在患者体内进行分布，有部分清除。第二相(β相)是配体已经分布完成，随着配体被从患者体内清除，血清浓度逐渐下降的时期。ta半衰期是第一相的半衰期，ti3半衰期是第二相的半衰期。因此，在本发明语境中，一个实施方案中，可变区、融合蛋白或配体的t半衰期在 (或者大约在)15分钟或以上的范围。在一个实施方案中，范围的下限是(或者大约是)30 分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12 小时。此外，或者替代地，本发明的可变区、融合蛋白或配体具有的t半衰期在最多并且包括1小时或者大约1小时.的范围。在一个实施方案中，范围的上限是(或者大约是)11、 10、9、8、7、6或5小时。合适范围的例子是(或者大约是)1-6小时、2-5小时或3-4小时。在一个实施方案中，本发明提供的可变区、融合蛋白或配体根据发明具有范围在 (或者大约在)2. 5小时或以上范围的t半衰期。在一个实施方案中，范围的下限是(或者大约是)3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、10小时、11小时或12小时。此外，或者替代地，t半衰期是或者大约是最多并且包括21或25天。在一个实施方案中，范围的上限是 (或者大约是)12小时、24小时、2天、3天、5天、10天、15天、19天、20天、21天或22天。例如，本发明的可变区、融合蛋白或配体具有的ti3半衰期在12-60小时(或者大约12-60小时)的范围内。再一个实施方案中，ti3半衰期在12-48小时(或者大约12-48小时)的范围内。还有一个实施方案中，在12-26小时(或者大约12-26小时)的范围内。作为二室模型的替代，技术人员也熟悉非隔室模型的使用，该模型可用于确定终端半衰期(这一意义上，名词“终端半衰期”用于本文意味着利用非隔室模型确定的终端半衰期)。可以利用例如 5. 1 版本的 WinNonlin 分析包(Pharsight Corp.，Mountain View, CA94040，USA提供)以这种方式对曲线进行建模。这种情况下，一个实施方案中的单可变区、融合蛋白或配体具有至少(或者至少大约)8小时、10小时、12小时、15小时、28小时、 20小时、2天、2天、3天、7天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23 天、M天或25天的终端半衰期。在一个实施方案中，该范围的上限是(或者大约是) 小时、48小时、60小时或72小时或120小时。例如，在例如人体的终端半衰期是(或者大约是)8-60小时，或8-48小时或12-120小时。除了以上标准，或者作为以上标准的替代，本发明的可变区、融合蛋白或配体具有范围在(或者大约在)lmg.min/ml或以上的AUC值(曲线下面积)。在一个实施方案中，范围的下限是(或者大约是)5、10、15、20、30、100、200或300mg.min/ml。此外或者替代地， 本发明的可变区、融合蛋白或配体具有范围是(或者大约是)最多600mg.min/ml的AUC。 在一个实施方案中，范围的上限是(或者大约是)500、400、300、200、150、100、75或50mg. min/mL·有益的是可变区、融合蛋白或配体具有的AUC在(或者大约在)选自以下的范围 15-150mg. min/ml、15-lOOmg· min/ml、15_75mg. min/ml 禾口 15_50mg. min/ml。“表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance) ” :竞争分析可用于确定特定抗原或表位(比如人血清清蛋白)是否与另一种抗原或表位(比如食蟹猴血清清蛋白)竞争结合本文描述的血清清蛋白结合配体，比如特定dAb。类似地，竞争分析可用于确定第一配体(比如dAb)是否与第二配体(比如dAb)竞争结合靶抗原或表位。名词“竞争”用于本文是指物质(比如分子、化合物，优选蛋白质)能够以任何程度影响两个或多个分子之间的特异结合相互作用。短语“不会竞争性抑制”意味着物质(比如分子、化合物，优选蛋白质) 不会以任何可测量的或显著的程度干扰两个或多个分子之间的特异结合相互作用。两个或多个分子之间的特异结合相互作用优选包括单可变区和它的相应伙伴或目标物之间的特异结合相互作用。所述干扰或竞争分子可以是另一个单可变区或者它可以是与相应伙伴或目标物结构和/或功能类似的分子。名词“结合部分(binding moiety) ”是指独立于不同表位或抗原结构域，特异结合抗原或表位的结构域。结合部分可以是结构域抗体(dAb)或者是来源于非免疫球蛋白的蛋白支架的结构域，例如所述支架选自与天然配体之外的配体结合(对于本发明，所述结合部分结合血清清蛋白)的CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocalin), SpA, adnectin、亲和体、avimer、GroEl、转铁蛋白、GroES和纤连蛋白。参见W02008/096158，该专利申请公开了蛋白支架的例子和从中选择抗原或表位特异结合结构域的方法(参见实施例17-25)。 W02008/096158中这些特定公开内容通过引用特别地并入本文，如同在此明确写出来一样，并且为了本发明使用，这些公开中的任何部分可以并入文中的一或多个权利要求)。在一个实施方案中，本发明的可变区包括一或多个以下动力学特性_(a)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合人SA的解离常数(KD)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)0. 1到(或者大约到)ΙΟΟΟΟηΜ，任选是从(或者大约从)1到(或者大约到)6000nM;(b)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合人SA的解离速率常数(Kd)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)1. 5xl0-4到(或者大约到)0. lsec—1，任选是从 (或者大约从)3xl0_4到(或者大约到)0. Isec-1 ；(c)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合人SA的结合速率常数(Ka)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)2xl06到(或者大约到UxK^M—isec—1，任选是从 (或者大约从)IxlO6到(或者大约到)^10 -1%;1 ；(d)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合食蟹猴SA的解离常数(KD)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)0. 1到(或者大约到)ΙΟΟΟΟηΜ，任选是从(或者大约从)1到(或者大约到)6000nM ；(e)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合食蟹猴SA的解离速率常数 (Kd)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)1. 5x10-4到(或者大约到)0. Ised 选是从(或者大约从)3χ10_4到(或者大约到)0. Isec-1 ；(f)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合食蟹猴SA的结合速率常数 (Ka)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)2xl06到(或者大约到UxK^M—isec—1，任选是从(或者大约从)IxlO6到(或者大约到)hlO^^sec—1 ；(g)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合大鼠SA的解离常数(KD)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)1到(或者大约到)ΙΟΟΟΟηΜ，任选是从(或者大约从)20到(或者大约到)6000ηΜ ；(h)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合大鼠SA的解离速率常数(Kd) 通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)1&10_3到(或者大约到)0. lkec—1，任选是从(或者大约从)9xl0_3到(或者大约到)0. Hsec-1 ；(i)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合大鼠SA的结合速率常数(Ka) 通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)2xl06到(或者大约到UxK^M—isec—1，任选是从(或者大约从)IxlO6到(或者大约到)3110 4%;1 ；(j)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合小鼠SA的解离常数(KD)通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)1到(或者大约到)IOOOOnM ；(k)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合小鼠SA的解离速率常数(Kd) 通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)2χ10_3到(或者大约到)0. ISsec-1 ；和/或(1)所述可变区包含结合位点，该结合位点特异结合小鼠SA的结合速率常数(Ka) 通过表面等离子共振确定是从(或者大约从)2xl06到(或者大约到UxK^M—isec—1，任选是从(或者大约从)2xl06到(或者大约到U.^clOlbec—1。任选地，所述可变区具有I 符合(a)和(d)的KD，符合(b)和(e)的Kd，和符合(c)和(f)的Ka ；或者II 符合(a)和(g)的KD，符合(b)和(h)的Kd，和符合(c)和⑴的Ka ；或者
III 符合(a)和(j)的KD，符合(b)和(k)的Kd，和符合(c)和(1)的Ka ；或者IV 符合I和II的动力学；或者V 符合I和III的动力学；或者VI 符合I、II和III的动力学。发明还提供了配体，所述配体包含任何以上发明方面或实施方案的可变区。例如， 配体可以是双特异性配体(参见W004003019中双特异性配体的例子)。发明的一个方面提供了多特异性配体，所述配体包含任何以上发明方面或实施方案的抗S可变区和与SA之外的靶抗原特异结合的结合部分。所述结合部分可以是特异结合目标物的任何结合部分， 例如所述部分是抗体、抗体片段、scFv, Fab、dAb或者是包含非免疫球蛋白蛋白支架的结合部分。W02008/096158中详细公开了这类部分(参见实施例17到25，这些公开内容通过引用并入本文)。非免疫球蛋白支架的例子是CTLA-4、脂质运载蛋白、葡萄球菌蛋白A(spA)、 Affibody , Avimers 、adnectins、GroEL 和纤连蛋白。在一个实施方案中，抗靶结合部分和抗SA可变区之间提供了连接肽，所述连接肽包含氨基酸序列AST，任选包含ASTSGPS。W02007085814(通过引用并入本文)和 W02008/096158(参见135页12行到140页14行的段落，这些公开内容和连接肽的所有序列特别地通过引用并入本文，如同在此明确写出来一样，并且为了本发明使用，这些公开中的任何部分可以并入文中的一或多个权利要求)中描述了替代的连接肽。在一个多特异性配体的实施方案中，靶抗原可以是天然的或者合成的多肽、蛋白或核酸，或者是它们的一部分。就这方面来说，本发明的配体可以结合靶抗原并作为拮抗剂或激动剂(例如EPO受体激动剂)。本领域技术人员可以理解选择的数量和种类很多。它们可以是例如人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体，其中所述细胞因子受体包括细胞因子、酶、辅酶或DNA结合蛋白的受体。合适的细胞因子和生长因子包括，但优选不限于ApoE、Apo-SAA, BDNF、心肌营养因子-1、EGF、EGF 受体、ENA-78、Eotaxin, Eotaxin-2、Exodus-2、EpoR、FGF-酸性、FGF-碱性、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、 Fractalkine (CX3C)、ffl)NF、G-CSF、GM-CSF、GF-3 1、胰岛素、IFN-γ、IGF-I、IGF-II、IL-1 α、 IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8 (72a. a.)、IL-8 (77a. a.)、IL-9、IL-10、 IL-IU IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18 (IGIF)、抑制素 α、抑制素 β、ΙΡ-10、角质细胞生长因子_2(KGF-2)、KGF、瘦素、LIF、淋巴细胞趋化因子、缪勒管抑制物(Mullerian inhibitory substance)、单核细胞集落刺激因子、单核细胞趋化蛋白、M-CSF、MDC(67a. a.)、MDC (69a. a.)、MCP-I (MCAF)、MCP—2、MCP—3、MCP—4、MDC (67a. a.)、MDC (69a. a.)、MIG、 MIP-I α ,MIP-I β、MIP_3 α、MIP_3 β、MIP_4、骨髓抑制因子 _1 (MPIF-I)、NAP_2、Neurturin、 神经生长因子、β -NGF, ΝΤ-3、ΝΤ-4、抑瘤素 M、PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4、RANTES, SDFl α、SDFl β、SCF, SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC, TGF- α、TGF- β、TGF- β 2、TGF- β 3、 肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNF 受体 I、TNF 受体 II、TNIL-1、TPO、VEGF、VEGF 受体 1、VEGF 受体 2、VEGF 受体 3、GCP-2、GRO/MGSA、GRO- β、GRO- y ,HCCU1-309、HER 1、HER 2、HER 3和HER 4、⑶4、人趋化因子受体CXCR4或CCR5、来自丙型肝炎病毒的非结构蛋白 3 (NS3), TNF- α、IgE, IFN-γ、MMP-12、CEA、幽门螺旋杆菌、TB、流感、戊型肝炎、MMP-12、在某些细胞上过表达的内在化受体，比如表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤细胞上的ErBl^受体、内在化细胞受体、LDL受体、TOF2受体、ErbB2受体、转铁蛋白受体、PDGF受体、VEGF受体、PsmAr、胞外基质蛋白弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、1-抗胰蛋白酶、组织因子蛋白酶抑制剂、PDKl、GSKl、Bad、半胱天冬酶(caspase)-9、Forlihead、幽门螺旋杆菌抗原、结核分枝杆菌抗原和流感病毒的抗原。应当理解这个列表不是穷举性的。在一个实施方案中，多特异性配体包含本发明的抗SA dAb可变区和抗TNFRl结合部分，例如抗TNFRl dAb。任选地，所述配体只含有一个抗TNFRl结合部分(例如dAb)以减少受体发生交联的可能。在一个实施方案中，抗SA dAb包含SEQ ID NOs :97-103和198-203 中任何一个的氨基酸序列(或者与SEQ ID NOs :97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列)或者由所述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，抗TNFRl结合部分是W02008149148中公开的 D0Mlh-131-206(该PCT申请中公开的其氨基酸序列和核苷酸序列通过引用特别并入本文， 如同在此明确写出来一样，并且为了本发明使用，这些公开内容中的任何部分可以并入文中的一或多个权利要求)。在一个实施方案中，多特异性配体包含D0Mlh-131-206的氨基酸序列以及SEQ ID NOs :97-103和198 to 203中任何一个的氨基酸序列(或者与SEQ ID NOs =97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%相同的氨基酸序列)或者由所述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，抗TNFRl结合部分或dAb是同时待审的申请USSN61/153，746 中公开的任何这类部分或dAb，该申请的公开内容通过引用并入本文。在一个实施方案中， 抗 TNFRl 结合部分包含的氨基酸序列与 DOMlh-574-156、D0Mlh_574_72、D0Mlh-574-109、 D0Mlh-574-138、D0Mlh-574-162 或 D0Mlh_574_180 或者本文公开的任何抗 TNFRl dAb 的氨基酸序列至少95%相同。在一个实施方案中，多特异性配体包含DOMlh-574-156的氨基酸序列以及SEQ ID NOs :97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列(或者与SEQ ID NOs 97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列至少95、96、97、98或99 %相同的氨基酸序列) 或者由所述氨基酸序列组成。 在一个实施方案中，本发明的配体是融合蛋白，所述融合蛋白包含本发明的可变区与一或多个多肽直接或间接融合在一起。例如，融合蛋白可以是W02005/118642(其公开内容通过引用并入本文)中公开的“药物融合(drug fusion)”，包含本发明的可变区和那个PCT申请中定义的多肽药物。本文中，“药物”是指任何这样的化合物(例如，小的有机分子、核酸、多肽)，所述化合物可以给予个体，通过与个体内的生物靶分子结合和/或改变其功能从而产生有益的治疗或诊断效果。靶分子可以是由个体的基因组编码的内源靶分子(例如个体基因组所编码的酶、受体、生长因子、细胞因子)或者由病原体的基因组编码的外源靶分子(例如病毒、 细菌、真菌、线虫或其他病原体基因组所编码的酶)。W02005/118642和W02006/059106(两份申请的全部公开内容通过引用并入本文，包括完整的具体药物的名单，如同在这里明确写出该名单，这种并入给本文权利要求中包含特定药物提供了公开)公开了适合在包含发明所述抗SA dAb结构域的融合蛋白和偶联物中使用的药物。例如，药物可以是胰升糖素样肽1 (GLP-I)或其变体；干扰素α 2b或变体；毒蜥外泌肽(eXendin)-4或变体。在一个实施方案中，发明提供了象W02005/118642和W02006/059106中定义和公开的药物偶联物，其中所述偶联物包含本发明的可变区。在一个实施方案中，药物与可变区共价连接(例如，可变区和药物表达为单个多肽的一部分)。替代地，在一个实施例中，药物与可变区非共价地联结或关联。药物与可变区的共价或非共价联结可以是直接或间接的 (例如，经由合适的连接分子和/或非共价结合互补的结合伙伴(例如生物素和抗生物素蛋白))。当采用互补结合伙伴时，结合伙伴之一可以与药物直接或者通过合适的连接子部分共价联结，而互补结合伙伴可以直接或者通过合适的连接子部分共价联结可变区。当药物是多肽或肽时，药物组合物可以是融合蛋白，其中所述多肽或肽、药物和多肽结合部分是连续多肽链中的个别部分(part^moieties)。正如文中描述的，多肽结合部分和多肽药物部分可以直接通过肽键相互联结，或者经由合适的氨基酸或肽或多肽连接子连起来。本发明中能够特异结合血清清蛋白的含有一个单可变区的配体(单体)或者一个以上单结构域的配体(多聚体，如本文定义的融合蛋白、偶联物和双特异性配体)还可以包含一或多个实体，所述实体选自，但优选不限于标记、标签、其他单可变区、dAb、抗体、抗体片段、标记物和药物。包含单可变区(免疫球蛋白或非免疫球蛋白单可变区)的配体的 COOH末端或N末端，或者N和COOH两个末端都可以有一或多个这类实体。与配体血清清蛋白特异结合的单可变区的COOH末端或N末端，或者N和COOH两个末端都可以有一或多个这类实体，其中所述配体含有一个单可变区(单体)或者一个以上单可变区(多聚体，如本文定义的融合蛋白、偶联物和双特异性配体)。可以放置在所述一个末端或者两端都放置的标签的非限制性例子包括HA、his或myc标签。这些实体，包括一或多个标签、标记和药物， 可以联结到配体上，所述配体含有一个单可变区(单体)或者一个以上单可变区(多聚体， 如本文定义的融合蛋白、偶联物和双特异性配体)，并如上文所述与血清清蛋白直接结合或者经由连接分子结合。发明一个方面提供了融合产物，例如融合蛋白或者与肽的融合或者与NCE(新化学实体)药物形成的偶联物，所述融合产物包含多肽药物与以上描述的任何可变区融合或偶联(对于NCE)，任选地，其中所述可变区包含SEQ ID NOs :97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列(或者与SEQ ID NOs =97-103和198-203中任何一个的氨基酸序列至少95、 96、97、98或99%相同的氨基酸序列)或者由所述氨基酸序列组成。发明提供了组合物，该组合物包含发明任一方面所述的可变区、融合蛋白、偶联物或配体以及药物可接受稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。本文还涵盖了分离的核酸，所述核酸编码本文描述的任何可变区、融合蛋白、偶联物或配体，例如含有一个本发明的单可变区(单体)或者一个以上单可变区(多聚体，如本文定义的融合蛋白、偶联物和双特异性配体)的配体，所述配体特异结合血清清蛋白，或者与人血清清蛋白和至少一个非人血清清蛋白或者它们的功能活性片段特异结合。本文还涵盖了载体和/或表达载体；包含载体的宿主细胞(例如非人宿主细胞或者不是从人或人胚胎分离到的宿主细胞)，例如转化了所述载体的植物或动物细胞和/或细胞系；表达和/或产生一或多个可变区、融合蛋白或配体的方法，其中所述配体含有一个单可变区(单体)或者一个以上单可变区(例如多聚体，如本文定义的融合蛋白、偶联物和双特异性配体)，并特异结合由所述载体编码的血清清蛋白或其片段，所述方法某些情况下包括培养宿主细胞使一或多个可变区、融合蛋白或配体或其片段被表达，和任选地从宿主细胞培养基中回收配体，所述配体含有一个单可变区(单体)或者一个以上单可变区(例如多聚体，如本文定义的融合蛋白、偶联物和双特异性配体)，并特异结合血清清蛋白。还涵盖了将本文描述的配体与血清清蛋白(包括血清清蛋白和/或非人血清清蛋白)和/或血清清蛋白之外的一或多个靶分子接触的方法，其中所述靶分子包括生物活性分子，包括以上列举的动物蛋白、 细胞因子；所述方法包括接触在体外进行的方法和将本文描述的任何可变区、融合蛋白或配体体内和/或离体给予个体宿主动物或细胞的方法。优选地，给予本文描述的配体将提高抗目标物配体的半衰期，包括T β和/或终端半衰期，其中所述配体包含针对血清清蛋白和/或非人血清清蛋白的单可变区(免疫球蛋白或非免疫球蛋白)，以及一或多个针对血清清蛋白之外的一或多个目标物的结构域。本文考虑了核酸分子，所述核酸分子编码结构域、 融合蛋白或含有单结构域的配体或其片段，包括它们的功能片段。编码所述核酸分子的载体，包括但优选不限于表达载体，还有来自含有一或多个这类表达载体的细胞系或生物体的宿主细胞也在本文进行了考虑。还考虑了制备任何结构域、融合蛋白或配体的方法，包括但优选不限于制备以上提及的任何核酸、载体和宿主细胞的方法。发明一个方面提供了核酸，所述核酸包含编码本发明的可变区或本发明的多特异性配体或本发明的融合蛋白的核苷酸序列。发明一个方面提供了核酸，所述核酸包含选自SEQ ID NOs :1_96和192-197中任一个的核苷酸序列，或者包含与所述选定序列至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99% 相同的核苷酸序列。发明一个方面提供了包含本发明的核酸的载体。发明一个方面提供了包含所述载体的分离的宿主细胞。参考W02008/096158中关于文库载体系统、单可变区的组合、双特异性配体的表征、双特异性配体的结构、用于构建双特异性配体的支架、抗血清清蛋白dAbs和多特异性配体和半衰期延长的配体的使用、以及包含抗血清清蛋白dAbs的组合物和制剂的细节。这些公开内容通过引用并入本文以便给使用本发明，包括使用结构域、配体、融合蛋白、偶联物、核酸、载体、宿主和本发明的组合物提供指导。抗血清清蛋白VH单可变区的序列经SI3R证实所有可变区与至少一个物种的血清清蛋白结合。核苷酸序列D0M7h-112 SEQ ID NO 1GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGGGGGGTATGTGATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAGCTATTAATAGGTTTGGTTCGTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGT AGTTTGCGGCATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-98 SEQ ID NO 2GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATGCGATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCTCATCGATTGATATGGTTGGTATTAAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGT TTTCGTATTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r-29 SEQ ID NO 3GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTAAGGATTATGATATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGMGGGTCTAGAGTGGGTCT CAATGATTTCTTCGTCGGGTCTTTGGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGT TTTAGGCTGTTTCCTCGGACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGD0M7r-35 SEQ ID NO :4GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTTCGCTGTATAGGATGGTGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAATGATTTCTCAGTTTGGTAATCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTT AGGTCTTGGGATCAGACTGGTGGTCGTCGTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r-36 SEQ ID NO :5GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTAATCATTATACGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CATTGATTCATCCGAGTGGTACGGTGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGG AGTTCGAGGGCGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r-38 SEQ ID NO 6GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCAGCCTCCGGATTCACCTTTGATAATAATGCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAACTATTAGTGCGAATGGTAATGCGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGGACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGG TTTCGTCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r31 SEQ ID NO 7GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTACA GCCTCCGGATTCACCTTTAGGCATTATCGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CATGGATTCGTCCGGATGGTACGTTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATCT TATATGGGTGATAGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGD0M7h-32 SEQ ID NO :8GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGCGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGGTAATTATCCGATGACGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCT CAACTATTAGTTATGGTGGTCTTGCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATG GCGATTAATGGTGTTAGGCCTAGGCGGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-33 SEQ ID NO :9GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTATGGCGTATCAGATGGCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAACTATTCATCAGACGGGTTTTTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGTG CGTTCTATGCGTCCTTATAAGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-34 SEQ ID NO :10
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGGTGATAAGGCAATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAACGATTAGTGCTCCTGGTAACCGTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGGT TTTCGGAATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-83 SEQ ID NO :11GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGATGGGATGCGTATGGGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAGCTATTGAGGTGAATGGTCAGCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATG GCTCATCCTCAGTCGGGGGTGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-84 SEQ ID NO :12GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTACGCCTGATGCTATGGCGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CATCGATTGGTGTGAATGGTTCTCCGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAGGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATG GCTCATCCTCAGTCGGGGGTGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-85 SEQ ID NO :13GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTTATCAGTCGGATATGTCTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAGGTCTAGAGTGGGTCT CATCTATTTCTTCTCAGGGTCGTTCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATG GCTCATCCTCAGTCGGGGGTGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
D0M7h-86 SEQ ID NO :14GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTACA GCCTCCGGATTCACCTTTGCGGCGAGGGATATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCT CAAGTATTTCTGCTCAGGGTGCTCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACGA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGATACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACCT CGGCATCCTCAGGGGGGGGTTACTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-87 SEQ ID NO :15GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGATAATGGGGATATGGTTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAGGGATTGCGCATAATGGTCGTAATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAAAT TTGGGTCAGGGTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-88 SEQ ID NO :16GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCACCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTGAATGGTACGTCGATGGGGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGATCTAGAGTGGGTCT CATCTATTATGCCTGTGGGTTCTCATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATG GCTCATCCTCAGTCGGGGGTGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7h-89 SEQ ID NO :17GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGATCATGCGCCTATGAAGTGGGCCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CATATATTGGGTCGGCGGGTAATATGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAGAT GAGGGGC
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D0M7r-55 SEQ ID NO :54GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTAAGTGGTATCCGATGAAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAACTATTGCTTATGATGGTGTTCAGACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATTG GGTCCGACTAGTCGTGTGTTTGCTGCTACTGATTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r-56 SEQ ID NO :55GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTCCGAATTATGCGATGAAGTGGGGCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAACTATTGATACGAGTGGTAGTACTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAACTT ACTCATCCTATGGCGCCGCGTCCGGCTTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r-57 SEQ ID NO :56 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGATCTTACGGAGATGGAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCT CATCGATTGGGCCTTGGGGTACTCCTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAAATT TCGCATCCTCAGGCGATGTATCATACGTTTGACTACTGGGGTCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCD0M7r-58 SEQ ID NO :57GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGCGTCTCTCCTGTGCA GCCTCCGGATTCACCTTTGCGCATCAGGATATGACGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGTCTAGAGTGGGTCT CAGATATTGATCATTCGGGTTCGTATACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGCGACAA TTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCCGAGGACACCGCGGTATATTACTGTGCGAAATGG TGGCATC
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EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRNEPMSWVRQAPVKGLEWVSTISPDGSGTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGHPQGARFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-74 SEQ ID NO :169EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFLNSEMSWVRQAPGKGLEWVSTIGYAGTPTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPRHPQGGVTFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-75 SEQ ID NO :170EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFARGPMSWVRQAPGKGLEWVSTITNDGTSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAEPPHSGRPMFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-76 SEQ ID NO :171EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFQRTAMSWVRQAPGKGLEWVSSIEASGRYTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQSHPQNGRFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-77 SEQ ID NO :172EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDASEMAWVRQAPGKGLEWVSSITVYGDRTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPRHPQGGVTFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-78 SEQ ID NO :173EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDSHMAWVRQAPGKGLEWVSRISREGKATYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAPNDQSAAFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-79 SEQ ID NO :174EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDMSEMSWVRQAPGKGLEWVSAITSDGSSTYYADSVKGRFT ISRDNSK NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPSLPHVTAFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-80 SEQ ID NO :175EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFERSTMHWVRQAPGKGLEWVSEIDALGTDTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSDHPQNSFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-81 SEQ ID NO :176EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEPREMYWARQAPGKGLEWVARIGWDGHTTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQLGQFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-82 SEQ ID NO :177EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDAYSMMWVRQAPGKGLEWVSTIGRWGEITYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRRYIGPYMLSGRFDYWGQGTLVTVSS
D0M7r-83 SEQ ID NO :178EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFMRYPMVWVRQAPGRGLEWVSSISPAGYGTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGHEISRFSRffSSFDYffGQGTLVTVSSD0M7r-84 SEQ ID NO :179EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRKYRMSWVRQAPGKGLEWVSSIARNGRSTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTTSGFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-85 SEQ ID NO :180EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNKKEMGWVRQAPGKGLEWVSSIDVSGNVTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKMAHPQSGVAFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-88 SEQ ID NO :181EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRMYDMAWVRQAPGKGLKWVSTILSSGKGTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLAHPQKGSIFDYRGQGTLVTVSSD0M7r-89 SEQ ID NO :182EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFHQGPMGWVRQAPGKGLEWVSWIQATGGATYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGMHPQSGTLFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-90 SEQ ID NO :183EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDVADMDWVRQAPGKGLEWVSGISSSGGYTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNLGQGFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-92 SEQ ID NO :184EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDTSSMLWVRQAPGKGLEWVSVIHQSGTPTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKFPFTHGKFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-93 SEQ ID NO :185EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNNYTMGWVRQAPGKGLEWVSLIHTSGTVTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWSSRAFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-94 SEQ ID NO :186EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYRMTWVRQAPGKGLEWVSTISPLGTYTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRWSIFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-95 SEQ ID NO :187EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYPMGWVRQAPGKGLEWVSWIRGRGLATYYADSVKGRFT ISRDNSK
NTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYFHGKFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-96 SEQ ID NO :188EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYVMGWVRQAPGKGLEWVSSIRMPGYLTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKRTPFFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-97 SEQ ID NO :189EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFEHYSMGWVRQAPGKGLEWVSEIDPDGIMTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAPGVLEMWITHFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-98 SEQ ID NO :190EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRHYVMGWVRQAPGKGLEWVSAISAHGNRTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYSLALTPFDYWGQGTLVTVSSD0M7r-99 SEQ ID NO :191EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTVYEMKWVRQAPGKGLEWVSAISAGGKYTYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEIRHLDNAVEFDYffGQGTLVTVSS示锣 Ij实施例1生物物理表征在Onex培养基中于30°C，250rpm培养48小时后，确定2. 5L摇瓶中的常规细菌表达水平。通过SEC MALLS和DSC确定生物物理特性。SEC MALLS (带有多角度激光光散射的大小排阻层析)是研究溶液中大分子的一种非侵入性技术。简单来说，通过大小排阻层析(层析柱TSK3000 ；S200)将蛋白质(lmg/ mL的浓度溶于缓冲液Dulbecco's PBS)按照水动力特性分开。分开后，利用多角度激光光散射(MALLQ检测仪测量蛋白质对光的取向。蛋白通过检测仪时散射光的强度测量为角度的函数。这一测量值与利用折射率(RI)检测仪确定的蛋白浓度一起可以用合适的公式(分析软件Astra v. 5. 3. 4. 12的不可缺少的部分)计算摩尔质量。洗脱峰中点的最高浓度大约8-lOuM，这就是MALLS确定蛋白质处于溶液中状态时的浓度。DSC(差示扫描量热法)简单来说，以180°C /小时的恒速加热蛋白质(lmg/mL 溶于PBQ，测量与热变性关联的可检测热量变化。确定转变中点(appTm)，所述转变中点是 50%蛋白质处于天然构象而另外50%变性时的温度。这里，由于多数被检验的蛋白没有完全重新折叠，DSC确定的是表观转变中点(appTm)。Tm越高，分子越稳定。使用的软件包是 Origin" v7. 0383。下表1中总结了 VH dAbs的特性。利用表面等离子共振(SPR)确定AlbudAbS (即抗血清清蛋白dAbs)抗人、食蟹猴(cyno)、大鼠和小鼠血清清蛋白(表中的“4AGs”)的交叉反应性。本情况中，使用了 Biacore 。利用STO和纯化的共价偶联在CM5芯片(氨基偶联)上的HAS各个结构域(自有)，进行了表位向人血清清蛋白(HSA)结构域1、2和/或 3(D1、2、3)的作图。表达于30°C，250rpm在2. 5L带折流板玻璃瓶中的500mL OverNightExpressTM 中进行。MALLS结果单个VH AlbudAb的大小为14kDa。MALLS确定的14和28kDa之间的任何数值表明不同程度的自我结合或二聚体形成(即16kDa在测试条件下主要是单体形式，而22kDa表明在MALLS条件下形成二聚体的强烈倾向)。DSC结果与MALLS相比，DSC试验中实际反应池中的蛋白浓度高得多是lmg/mL。 从表1看出某些AlbudAbs存在两个appTms，这可以部分地解释更高浓度的现象；第一个Tm 构成二聚体复合物的解离，而第二个Tm代表实际AlbudAb蛋白的解折叠。表 1
ΛX-反应':生MA1.I.SDSC |°C|表达与 IISA 1)1/2/3 的结合克隆名称(4AGs)[kDa]appTmlappTm2(大肠杆菌) mg/L摇瓶SPRDOM7h-112人类无反应； 其他3种抗原有反应16626646.6无结合DOM7h-98有14.76528.3D2DOM7r-29有16.962.521D2DOM7r-35有21.858.761.833.5D2DOM7r-36有98/45 / 1667.469.931.5D2DOM7r-38有14.861.364.561.5D2DOM7r-31有1567.974.525D2* 通过ITC、平衡透析或荧光偏振可以确定领先克隆的确切溶液态亲和力除了 DOM^1-112，所有以上领先AlbudAbs在四种血清清蛋白种类之间都有交叉反应性。所有鉴定到的AlbudAbs均能结合HAS的结构域2，在未优化的条件下在摇瓶中表达相当不错。经MALLS确定7个AlbudAbs中的5个处于单体，而D0M7r_35在MALLS条件下表现出明显的形成二聚体的倾向。单体状态是有益的，因为这样避免了二聚体化和产物与靶分子(比如表面受体)交联的风险。D0M7r_36显示出某些程度的集聚形成(用MALLS定量时低于10% )。7个AlbudAbs 中的5个可以确定2appTms。这是因为DSC试验中的试验浓度较高，和在这样的提高的浓度下dAb的溶液态略有不同(更多详情，参见以上解释)。实施例2在大鼠中确定血清半衰期
AlbudAbs被克隆至pD0M5载体中。pD0M5载体是基于pUC119的表达载体，其中的蛋白表达由LacZ启动子驱动。GASl前导序列(参见W02005/093074)确保分离的可溶性 dAbs分泌到大肠杆菌的细胞周质和培养物上清液中。dAbs通过Sall/NotI克隆到该载体中，使dAb的C末端被附加myc标签。对于每个AlbudAb，20-50mg的量在大肠杆菌中表达， 并利用蛋白A亲和树脂从细菌培养物上清中纯化和用IOOmM甘氨酸(pH2)洗脱。将蛋白质浓缩到lmg/ml以上，缓冲液交换为PBS，利用Q Spin columns (Vivascience)清除内毒素。 为了进行大鼠药代动力学(PK)分析，2. 5mg/kg的AlbudAbs以单个i. ν注射给药，每个化合物使用三只大鼠。0. 16、1、4、12、24、48、72、96、120、168小时取血清样品。血清水平分析通过抗myc捕获，然后按照以下描述的方法进行抗VH检测ELISA。结果如表2所示。所有测试的AlbudAbs显示出程度不同的延长血清半衰期的能力(阴性对照HEL4dAb在大鼠中的T1/2是20分钟)，从有最长tl/2的计算AUC值最高也可以看出这一趋势。34. 5小时的最长血清半衰期接近大鼠血清清蛋白的血清半衰期。需要确定AlbudAbs对RSA的特异亲和力。表2
VHdAbT Χ/2*AUC 0-inf[hr][hr*ug/mL]DOM7h-9813.5577.5DOM7r-2921.9697.6DOM7r-3534.41249.6DOM7r-3626.5910.8DOM7r-388.8203.4DOM7r-3111239*大鼠血清清蛋白的血清半衰期是35小时。T1/2是分子在受试对象中循环时间的衡量尺度。AUC =曲线下面积，它是1 性质参数。利用MSD进行的抗myc ELISA方法血清中的AlbudAb浓度通过抗myc ELISA测量。简单来说，山羊抗myc多克隆抗体(1 500 ;Abcam，产品目录号ab9132)过夜包埋到Nunc 96孔Maxisorp板上，用5 % BSA/PBS+1% TWEEN 封闭。血清样品以系列稀释和浓度已知的标准样品一起加入。然后利用直接标记MSD磺基标签的兔多克隆抗VH检测结合的带myc标签的AlbudAb。每个 dAb在含有10%对照大鼠血清的分析缓冲液中稀释(1 1000 ；自有试剂)(方法DM222)。 MSD(MesoScaleDiscovery ；MesoScale. com)在电化学刺激后利用电化学发光检测磺基标签。由这些原始ELISA数据，相对标准曲线通过插值并考虑到稀释因子确定未知样品的浓度。由样品的重复数值确定每个时间点的平均浓度结果并输入WinNonLin分析软件包 (例如 5. 1 版本(Pharsight Corp.，Mountain View, CA94040, USA 提供)。数据利用非隔室模型进行拟合以便给出终端半衰期，其中I3K参数由软件估计。挑选反映每个1 谱末期的用药信息和时间点。
实施例3:幼稚化fnaiive)VHAlbudAbsTM的亲和力成熟将初次挑选分离到的12个领先VH AlbudAb接着进行亲和力成熟。制备了 D0M7r-36、D0M7r_35、D0M7r_31、D0M7h_98、D0M7h_112、D0M7r-38 和 D0M7r_29 的各自易错文库(EP)，而以下亲代克隆被汇集合并到单个EP文库中，一起筛选D0M7r-83、D0M7r_85、 D0M7r-92、D0M7r_94 和 D0M7r_95。所有文库高于 hl09CFU/mL。筛选在可溶抗原(生物素-HSA ；生物素-RSA ；用2% Marvel封闭)上进行了四轮(以浓度逐渐降低的抗原通过交叉选择进行第1轮在1 μ M(HAS或RSA)，第2轮在 1 μ M (RSA或HSA)，然后分别在IOOnM和IOnM再进行2轮挑选，与第2轮使用的抗原相同。 两轮均得到Ca. 3000样品，R3和R4的选择输出通过上清液BIAcore进行筛选，并仅根据它们的解离速率将克隆排名。对改进的克隆进行了 8点稀释动力学亲和力测量(Eight-point dilution kinetic affinity measurements)(数据如下)。表权利要求
1.抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单可变区，其包含与选自SEQID NOs :97-191和 198-203的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
2.抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单可变区，其包含的氨基酸序列与选自SEQID NOs 97-191和198-203的氨基酸序列相比，有最多4个氨基酸改变。
3.抗血清清蛋白(SA)免疫球蛋白单可变区，其包含的氨基酸序列由与选自SEQID NOs 1-96和192-197的核苷酸序列至少80%相同的核苷酸序列编码。
4.以上权利要求任一项所述的可变区，其中所述可变区包含SEQID NOs :97-103和 198-203中任何一个的氨基酸序列。
5.以上权利要求任一项所述的可变区，其包含结合位点，该结合位点特异结合人SA的解离常数(KD)通过表面等离子共振确定是从大约0. 1到大约ΙΟΟΟΟηΜ，任选是从大约1到大约 6000nM。
6.以上权利要求任一项所述的可变区，其包含结合位点，该结合位点特异结合人SA的解离速率常数(Kd)通过表面等离子共振确定是从大约1. 5xl0-4到大约0. lsec—1，任选是从大约3xl(T4到大约0. lsec4。
7.以上权利要求任一项所述的可变区，其包含结合位点，该结合位点特异结合人SA的结合速率常数(Ka)通过表面等离子共振确定是从大约hio6到大约lxK^M—isec—1，任选是从大约IxlO6到大约hK^I^secr1。
8.以上权利要求任一项所述的可变区，其包含结合位点，该结合位点特异结合食蟹猴 SA的解离常数(KD)通过表面等离子共振确定是从大约0. 1到大约ΙΟΟΟΟηΜ，任选是从大约 1到大约6000nMo
9.以上权利要求任一项所述的可变区，其包含结合位点，该结合位点特异结合食蟹猴 SA的解离速率常数(Kd)通过表面等离子共振确定是从大约1. 5χ10-4到大约0. lsec—1，任选是从大约3x10-4到大约到0. lsec—1。
10.以上权利要求任一项所述的可变区，其包含结合位点，该结合位点特异结合食蟹猴 SA的结合速率常数(Ka)通过表面等离子共振确定是从大约hlO6到大约lxK^iTsec、任选是从大约IxlO6到大约^clO3M-1Sec-1。
11.以上权利要求任一项所述的可变区，其中所述可变区的熔解温度通过DSC(差示扫描量热法)确定是至少阳摄氏度，任选55彡Tm < 75摄氏度。
12.以上权利要求任一项所述的可变区，其中所述可变区通过SEC-MALLS(带有多角度激光光散射的大小排阻层析)确定基本是单体形式。
13.多特异性配体，其包含以上权利要求任一项所述的抗SA可变区和特异结合除SA以外的靶抗原的结合部分，任选其中的结合部分是TNFRl拮抗剂。
14.权利要求1-12中任一项所述的抗SA单可变区，其中所述可变区偶联了药物(任选 NCE药物)，任选其中选中的可变区如权利要求4所述。
15.融合蛋白，其包含与权利要求1-12中任一项所述的可变区融合的多肽或肽药物， 任选其中选中的可变区如权利要求4所述。
16.组合物，其包含以上权利要求任一项所述的可变区、融合蛋白或配体以，及药物可接受的稀释剂、载体、赋形剂或媒介物。
17.核酸，其包含的核苷酸序列编码如权利要求1-12和14中任一项所述的可变区，或者权利要求13的多特异性配体或权利要求15的融合蛋白。
18.核酸，其包含与选自SEQID NOs 1_96和192-197的序列至少80%相同的核苷酸序列。
19.载体，其包含权利要求17或18所述的核酸。
20.分离的宿主细胞，其包含如权利要求19所述的载体。
21.治疗或防止患者中疾病或紊乱的方法，所述方法包括给予患者至少一剂如权利要求1-12和14中任一项所述的可变区，或权利要求13所述的多特异性配体，或权利要求15 所述的融合蛋白。
全文摘要
发明涉及改进的抗血清清蛋白免疫球蛋白单可变区，以及包含所述可变区的配体和药物偶联物、组合物、核酸、载体和宿主。
文档编号A61K39/395GK102574914SQ201080041433
公开日2012年7月11日 申请日期2010年7月14日 优先权日2009年7月16日
发明者E.库尔斯托克, E.德安格里斯, O.舍恩, 刘海群 申请人:葛兰素集团有限公司