山姜素或豆蔻明与血清作用的差异蛋白检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用双向电泳研究技术检测山姜素或豆蔻明与人血清蛋白相互作 用差异显示蛋白的方法，属于生物化学研究领域。
【背景技术】
[0002] 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，含量约为4g/100mL(0. 6mmol ·〇,占 血浆总蛋白的60%，是血浆蛋白质中少有的非糖蛋白之一，它能与许多内源及外源性化合 物结合，起到存储和转运作用。大多数药物小分子通过与生物体内的大分子（如血液蛋白） 结合起一定作用，这也是决定药物是否具有良好的生物利用度、药理活性、代谢稳定性和低 毒性的主要因素。药物进入血液后，必然或多或少与血液蛋白结合，结合后的药物不易穿 透毛细血管壁、血脑屏障及肾小球等多种生物膜，限制其进一步运输，从而对药物在体内 的分布与代谢产生重要影响，同时药物与血液蛋白结合的程度决定了药物储留于血液中的 量，影响药物的最大作用强度，有利于防止作用大幅度波动以及延长药物作用时间起到缓 释作用。因此药物小分子与血液蛋白的结合为药物分子结构与药效之间关系提供了有利的 信息，同时有助于了解药物小分子在血液蛋白的转运和代谢过程，为新的高活性的药物小 分子的设计与开发研究提供有价值的信息及重要理论。通过差异蛋白质组学方法，对药物 小分子影响血液蛋白质组成、动态变化和相互作用的组学研究，可更加深入理解药物对血 液生理状态的影响，从而协助阐释血液中相关体内细胞信号传导的途径，有助于全面地发 现和验证新的血液代谢相互作用网络和分子间信号传导途径、蛋白质靶向物及生物标志物 在细胞体内的结构和功能关系。
[0003] 迄今为止，利用2-DE联合MS技术路线进行人体血清样品和药物的直接相互作用 研究尚未见报道，血清具有所含蛋白质种类多，样品获取容易和安全等优点，此外血清样品 中含机体在各种特殊时刻及时分泌是各种蛋白质表型，是寻求疾病标志物的重要源泉。
[0004] 本发明中所用的山姜素（Alpinetin，7-羟基-5甲氧基二氢黄酮）和豆蔻明 (Cardamonin，2'，4'-二羟基-6'-甲氧基查耳酮，结构图见图1)为姜科植物草豆蔻中主要 的两种互为同分异构体的黄酮类成分，其药理活性主要表现在抑制血小板聚集，抑制肿瘤 的形成，抗炎抑菌的方面，并且毒性很低，安全性好。
[0005] 通过在模拟人生理温度条件下，进行血清与药物相互结合的体外培养， 并采用蛋白质组学研究方法结合基质辅助激光解吸离子化一串联飞行时间质谱 技术(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlightMass Spectr〇ment，MALDI-T0F-MS)开展存在山姜素或豆蔻明时的血清蛋白质组学研究，分析差 异表达蛋白，寻找特定疾病的特异血清蛋白标志物或者发现新的疾病相关蛋白质，为疾病 的诊断或治疗提供新的依据，为新药物的开发提供更加直观的理论基础。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于建立一种利用双向电泳研究技术检测山姜素或豆蔻明与血清作 用的差异蛋白的技术方法，该技术经反复实验证明重复性好，图谱清晰，是一套适用于血清 样品与药物相互作用后寻找差异显示蛋白的双向电泳技术。
[0007] 本发明所述的一种山姜素或豆蔻明与血清作用的差异蛋白检测的双向电泳研究 方法技术，包括以下步骤：
[0008] a.将血清蛋白与浓度为1. 0X10 3mol/L~3. 0X10 3mol/L的山姜素或豆蔻明低 速摇勾，恒温培养。
[0009] b.把培养好的样品按血清白蛋白清除剂步骤除去高丰度蛋白。
[0010] c.得到的蛋白粉用蛋白质上样缓冲液复溶，再用Bradford法进行定量。
[0011] d.按蛋白质上样量为1200 μ g~1500 μ g/24cm胶条，进行第一向等电聚焦。
[0012] e.第一向等电聚焦完毕，胶条平衡后转到聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行第二垂直电 泳。
[0013] f.电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色，保存，扫描分析。
[0014] g.差异蛋白点的酶解及质谱鉴定。
[0015] 具体地，药物溶液的溶剂是水、乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇中的至少一种。
[0016] 优选地，所述药物溶液的溶剂是甲醇。
[0017] 优选地，所述药物浓度为：1. OX 10 3mol/L~3. OX 10 3mol/L。
[0018] 优选地，所述蛋白质上样量为：1200 yg~1500 yg/24cm胶条。
[0019] 优选地，所述恒温培养为：35°C~37°C，r = 0~300rpm，20min~50min。
[0020] 优选地，所述去除血清高丰度蛋白按血清白蛋白清除剂步骤操作。
[0021] 优选地，所述蛋白上样缓冲液为含尿素7M，硫脲2M，CHAPS 2%的水溶液。
[0022] 优选地，所述蛋白粉复溶按：蛋白质样品10mg/lmL上样缓冲液复溶。
[0023] 优选地，所述胶条为：IPG pH = 3~10NL。
[0024] 优选地，所述胶条平衡为IOmin~20min。
[0025] 优选地，所述平衡液为：PH = 8. 8, I. 5M tris-HCl，尿素 6M，甘油 30%，SDS 2%， 溴酚蓝0. 002%。
[0026] 优选地，所述第二向垂直电泳的温度为：16°C~20°C。
[0027] 优选地，所述第二向垂直电泳参数为4~6W/60min，7~9W直至结束。
[0028] 相比现有技术，本发明山姜素或豆蔻明与人血清作用的差异蛋白检测的双向电泳 研究方法，优点是使用血清白蛋白清除剂能够去除血清中高丰度蛋白，样品处理时间短，操 作简单，得到的图谱清晰，重复性好。
【附图说明】
[0029] 图1为山姜素的结构图。
[0030] 图2为豆蔻明的结构图。
[0031] 图3为人血清样品与山姜素相互结合的双向电泳图谱。
[0032] 图4为人血清样品与豆蔻明相互结合的双向电泳图谱。
[0033] 图5为载脂蛋白E(编号3)的匹配的肽段序列图谱。
[0034] 图6为间α胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白（编号4)的匹配肽段序列图谱。
[0035] 图7为链C，人类补体成分补体3 (C3c)(编号5)的匹配肽段序列图谱。
[0036] 图8为补体B因子（编号6)的匹配肽段序列图谱。
[0037] 图9为1-抗胰蛋白酶（编号7)的匹配肽段序列图谱。
[0038] 图10为丝氨酸肽酶抑制剂，进化枝Α(α 1-抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）（编号8)的匹 配肽段序列图谱。
[0039] 图11为类型II角质亚单位蛋白，不完整的（编号9)的匹配的肽段序列图谱。
[0040] 图12为链Α，游离型人类载脂蛋白A-I的晶体结构（编号10)的匹配肽段序列图 谱。
[0041] 图13为载脂蛋白E(编号3)匹配的肽段分子量为2730.4(+1)的二级图谱，基质： HCCA(下同）。
[0042] 图14为间α胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白（编号4)匹配的肽段分子量为 2968. 4 (+1)的二级图谱
[0043] 图15为链C，人类补体成分补体3 (C3c)(编号5)匹配的肽段分子量为3107. 5 (+1) 的二级图谱。
[0044] 图16为补体B因子（编号6)匹配的肽段分子量为3788.8(+1)的二级图谱。
[0045] 图17为1-抗胰蛋白酶（编号7)匹配的肽段分子量为2574.3(+1)的二级图谱。
[0046] 图18为丝氨酸肽酶抑制剂，进化枝Α(α 1-抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）（编号8)匹配 的肽段分子量为2574.6(+1)的二级图谱。
[0047] 图19为类型II角质亚单位蛋白，不完整的（编号9)匹配的肽段分子量为 1475.8(+1)的二级图谱。
[0048] 图20为链A，游离型人类载脂蛋白A-I的晶体结构（编号10)匹配的肽段分子量 为2618.3(+1)的二级图谱。
【具体实施方式】
[0049] 以下通过具体实例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明， 不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0050] 通过采集健康人血清样品，取10例血清样品等体积混合，再从中取出ImL血 清置于PE管中，加入优选I. 0X10 3mol/L~3. 0X10 3mol/L，更优选2. 0X10 3mol/L~ 2. 5X10 3mol/L的山姜素或豆蔻明，于恒温箱中优选35~37 °C，更优选36~37 °C，优选 20min~50min，更优选25min~35min培养，按血清白蛋白清除剂步骤除去高丰度蛋白，通 过利用Bradford法进行蛋白定量，以上处理方法和实验条件能够得到稳定性和重复性较 好的血清蛋白质2-DE图谱，蛋白质点能够较好分离。利用ImageMaster5. 0凝胶图像分析 软件找出10个差异表达蛋白质点，再通过NCBInr的Blast的检索，确定了它们的蛋白名称 (见表1)，其中编号1-5号为经山姜素处理后得到的差异表达蛋白质点，6-10号为豆蔻明处 理后的差异表达蛋白质点，而1号和6号、2和7号分别为共同的差异表达蛋白质点。
[0051] 载脂蛋白E主要是由肝脏合成的299个氨基酸组成的糖蛋白，位于19号染色体长 臂3区，含有4个外显因子和3个内含子，是血浆中一种重要载脂蛋白，具有明显而丰富的 多态性，在脂质及脂蛋白代谢中起重要的作用。间α胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白 可由一系列炎症介质导致表达分泌，是一种不稳定的蛋白，其可以抑制毒素的活性，也可以 连接多形核白细胞表面的活性因子，抑制吞噬细胞活性，所以被认为是抗炎蛋白质。链C， 人类补体成分补体C3c是由C3bi被I因子及其他蛋白酶裂解而来。补体B因子作为一个 单链多肽因子在血液中循环，是补体旁路激活途径中的一个重要成份，不仅在抗感染中具 有重要意义，在免疫复合物所致的炎性组织损伤亦起着极其重要的作用。1-抗胰蛋白酶是 一种糖蛋白，主要由肝脏合成，广泛分布于正常人血清和体液中，是血清中最主要的蛋白酶 抑制剂，对凝血酶、尿激酶等其他酶也有抑制作用，也是一种急性时相反应蛋白，在炎症性 疾患时，可以透过毛细管进入组织液，在炎症局部往往浓度很高，对急性炎性疾病有一定限 制作用。丝氨酸肽酶抑制剂，进化枝Α(α1_抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）由这个基因编码的蛋 白质分泌和丝氨酸蛋白酶抑制剂，其目标包括弹性蛋白酶、血纤维蛋白溶酶、凝血酶、胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶原激活物。这个基因缺陷可能导致肺气肿或肝脏疾病。人载脂 蛋白A-I基因位于第11号染色体长臂末端区域内，由3个内含子和4个外显子组成，全长 1863bp，可在肝和小肠中表达。
[0052] 表1差异显示蛋白的结果
[0053]
[0054] 通过以下具体的实施例加以说明。
[0055] 实施例1
[0056] (1)从-80°C冰箱中取出人血清样品，取10例人血清样品等体