一种铬-极低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属离子的免疫学检测，具体涉及一种铬-极低密度脂蛋白螯合物 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白（high density lipoprotein，简称HDL)、中间密度脂 蛋白（intermediate density lipoprotein，简称 IDL)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，简称 LDL)、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein,简称 VLDL)、 乳糜颗粒（chylomicron，CM)。血液中大约百分之三十的胆固醇是通过HDL从组织细胞中 运输到肝脏转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。血液中约70%的胆固醇由LDL和VLDL 所携带，肝脏中产生的内源性甘油三酯（triglyceride，TG)也主要依靠 VLDL运输至肝外。 VLDL的增多与高脂血症、脂代谢紊乱息息相关，而血脂异常又是多种疾病发生的重要危险 因素，因而VLDL含量水平的稳定对于人体各方面机能功能的稳定起着重要作用。
[0003] VLDL含量水平及结构功能的稳定对机体意义重大。其含量过高与脂肪肝、脂代谢 紊乱、心血管疾病、肾脏功能损伤等息息相关。定量检测VLDL可以用于这些疾病的早期诊 断以及治疗效果监测，甚至作为预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、肝 功能受损者等患者，血清VLDL含量也会下降，定量检测VLDL也可用于这些疾病的早期诊 断、治疗效果监测以及作为预后评价的指标之一。
[0004] 络（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的熔点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪以来被广泛应用，每年 全球铬生产量高达107吨，因而铬是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铬广泛应用于 电镀、鞣革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。
[0005] 自然界中铬主要以三价和六价的形式存在，而一般认为，三价铬（Cr3+)是人类所 需的微量元素，而六价铬（Cr6+)才是明显的毒性物质。由于六价铬易通过细胞膜进入细胞， 而且可以通过一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铬的毒性 高于三价铬，达10 -100倍。学者认为当水中的六价铬含量超过〇.〇5mg/L即是有毒的。六 价铬可以通过皮肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性 暴露人群主要是通过呼吸道吸入六价铬灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式摄入六价铬。六价铬进入体内后，可以引发氧化应激、显色体 畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、Cr-DNA 配合物形成等），从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。
[0006] 如前所述，铬与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白 酶的活性。随着对铬毒性研究的深入，人们逐渐认识到铬与蛋白的相互作用在其致毒过程 中扮演着重要的角色，被认为是了解铬的毒性机理的关键所在，因此，对铬和蛋白质相互作 用的研究就显得愈发重要。而现在关于铬与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋 白质与铬之间的关系还不清楚，因而加强对于铬与蛋白质之间的关系至关重要。
[0007] 关于铬中毒，特别是慢性铬中毒的评价，通过检测血铬含量也不能准确评价人体 内的循环铬含量，无法进一步评估铬对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发 展，铬与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可以从免疫功能角度评价铬中毒，特别是慢 性铬中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0008] 针对铬污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铬-极低密度脂蛋白螯合物 及其制备方法，并建立铬-极低密度脂蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测 铬-极低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人 群血清中铬-极低密度脂蛋白螯合物，可以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而 间接反映这个地区铬污染程度。
[0009] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铬-极低密度脂蛋白螯合 物，该铬-极低密度脂蛋白螯合物是铬离子与极低密度脂蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残 基螯合而成。
[0010] 本发明还提供一种上述的铬-极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，即体外合成 法，包括以下步骤：
[0011] A)铬-极低密度脂蛋白螯合物的合成：在提纯源于人体的极低密度脂蛋白或按照 生物学方法重组的极低密度脂蛋白中加入铬离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0012] B)铬-极低密度脂蛋白螯合物纯化：采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液 中未反应的极低密度脂蛋白、特异性抗体和铬离子，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物。
[0013] 作为优选，所述步骤B)中具体包括以下步骤：
[0014] (1)溶解样品：将上述步骤A)的铬-极低密度脂蛋白螯合物溶解于生理盐水中， 得铬-极低密度脂蛋白螯合物的溶液；
[0015] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与极低 密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0016] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使极低 密度脂蛋白与填料特异性结合；
[0017] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0018] (5)收集：收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0019] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0020] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0021] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0022] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的 Na2HP0j§液进行洗脱；
[0023] (10)收集：收集步骤（9)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0024] (11)透析：将步骤（10)中的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后， 4°C透析过夜，收集样本，即得铬-极低密度脂蛋白螯合物。
[0025] 作为优选，上述铬-极低密度脂蛋白螯合物的制备方法，还包括以下对铬-极低密 度脂蛋白螯合物的鉴定步骤，具体包括以下步骤：
[0026] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0027] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-极低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓 冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0028] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0029] (4):在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解，然后再 采用ICP-MS或AAS检测是否含有铬以及检测铬的含量。
[0030] 本发明还提供一种如上述的铬-极低密度脂蛋白螯合物在制备检测人体内铬-极 低密度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0031] 本发明还提供一种至少包括如上述的铬-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品的 试剂盒。
[0032] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液包括捕获极低密度脂蛋白的物质或 捕获金属铬的物质。
[0033] 本发明还提供一种定量检测铬-极低密度脂蛋白螯合物的方法，以已知含量的上 述的铬-极低密度脂蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免 疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯 铬-极低密度脂蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯铬-极低密度脂蛋白螯合物与原子吸 收光谱结合法、提纯铬-极低密度脂蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与 酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0034] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0035] 1.本发明首次合成了铬-极低密度脂蛋白螯合物；
[0036] 2.本发明首次提出铬-极低密度脂蛋白螯合物可用于制备检测血样中铬-极低密 度脂蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用；
[0037] 3.本发明实现了铬-极低密度脂蛋白螯合物的特异性识别和定量检测，以便定量 检测人群血清中铬-极低密度脂蛋白螯合物的含量，以评价一个地区铬污染程度的应用， 为工业地区的铬污染水平提供间接指标。本发明建立的铬-极低密度脂蛋白螯合物定量检 测方法的准确度高、重复性好。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物的非变性电泳条带图；
[0039] 图2为本发明所述的铬-极低密度脂蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光 分析图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0041] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0042] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 捕获极低密度脂蛋白的物质为抗极低密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，以下实 施例方式，使用的抗极低密度脂蛋白抗体为货号为"Genetex gtxl6419"的VLDL antibody， 所述与极低密度脂蛋白特异性结合的物质、抗极低密度脂蛋白抗体、抗VLDL抗体均为捕获 极低密度脂蛋白的物质；
[0044] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0045] 稀释缓冲液为pH 9. 6的0. 05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取I. 5g的Na2COjP 2. 93g 的 NaHCO3溶解加 CldH2O 定容至 1000 mL ;
[0046] 洗涤缓冲液为ρΗ7· 4的0· 15M PBS溶液，配制方法示例：取0· 2g的ΚΗ2Ρ04、2. 90g 的 Na2HPO4 · 12Η20、8· Og 的 NaCl、0. 2g 的 KC1、0. 5mLTween-