一种汞-IgG螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种汞-IgG螯合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] IgG主要由脾、淋巴结中的浆细胞合成和分泌，以单体形式存在。在个体发育过程 中机体合成IgG的年龄要晚于IgM，在出生后第3个月开始合成，3~5岁接近成年人水平。 IgG是血清中主要的抗体成分，约占血清总Ig的75%。IgG是唯一能通过胎盘的Ig，在自 然被动免疫中起重要作用。此外IgG还具有调理吞噬、ADCC和结合SPA等作用。由于IgG 上述特点，IgG在机体免疫防护中起着主要的作用，大多数抗菌、抗病毒、抗毒素抗体都属于 IgG类抗体。应用对麻疹、甲型肝炎等有免疫力的产妇或正常人丙种或胎盘球蛋白可进行人 工被动免疫，能有郊地预防相应的传染性疾病。
[0003] 萊（Mercury，Hg)是一种无处不在的重金属，广泛应用于工业、农业、医药业，是 一种非常重要的环境污染物。2011年，美国毒物和疾病登记署（United States Agency for Toxic Substances and Disease Registry，ATSDR)已将其列入物质优先列表内 (Substance Priority List)，而世界卫生组织（World Health 0rganization，WH0)也早已 将其列为10大最易引起健康问题的化学品之一。在美国，Cr与Hg、Cd、Pb被认为是四大环 境污染物，严重影响着人们的身体健康。常见的汞职业暴露人群包括从事金属冶炼、开采金 矿、烧煤、电产业和木材生产的人群，而对于普通人群主要通过食入汞污染的海鲜、饮入汞 污染水源、吸入燃料燃烧或蒸发的汞蒸气。此外，含汞化妆品的接触、填充汞合金牙科填充 物、接触疫苗防腐剂中的乙基汞、含汞杀虫剂的接触都是常见的汞暴露方式，汞与人们的生 活密切相关。2009年，国家健康与营养测试调查中发现（National Health and Nutrition Examination Study, NHANES)，2%的美国育龄期妇女体内的汞都超标。汞被认为是对人体 及其有害的，会影响人体的多个组织、器官及系统，包括心血管系统、呼吸系统、神经系统、 内分泌系统、消化系统、泌尿系统、免疫系统等，对人体危害极大。
[0004] 目前可以运用多种方法检测出血汞含量，包括ELISA、原子吸收光谱（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)定量检测法、电感親合等离子体质谱仪（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)定量检测法等，但仍存在一定缺陷。
[0005] 关于汞中毒，特别是慢性汞中毒的评价，仅能通过检测血汞含量，间接反应人体内 的循环汞含量，无法进一步评估汞对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发展， 汞与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可以从机体功能角度评价汞中毒，特别是慢性 汞中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0006] 针对汞污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种汞-IgG螯合物及其制备方 法，并建立萊-IgG螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测萊-IgG螯合物在评价一个 地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞-IgG螯合物可以间接反映 这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种汞-IgG螯合物，汞离子与 IgG通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的汞-IgG螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] A)汞与IgG的螯合反应：在人源的IgG中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶 液；
[0010] B)纯化汞-IgG螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgG以及多余的汞离子，即得汞-IgG螯合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0012] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使汞-IgG螯合物 复溶；
[0013] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgG特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgG与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0016] (5)收集：收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0017] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0021] (10)收集：收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0022] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得汞-IgG螯合物。
[0023] 其中，上述汞-IgG螯合物的制备方法，还包括步骤C):对汞-IgG螯合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下：
[0025] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的汞-IgG螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法检测是否含有汞以及检测汞的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的汞-IgG螯合物在制备检测人体内汞-IgG螯合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的汞-IgG螯合物作为对照品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有可捕获IgG的蛋白或捕获金属 汞的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测汞-IgG螯合物的方法，以已知含量的上述的汞-IgG 螯合物作为对照品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-IgG螯合物与酶联免疫结 合法、提纯汞-IgG螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯汞-IgG螯合物与电感耦合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的汞-IgG螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成或从全血中提取汞-IgG螯合物；
[0035] 2.本发明首次提出汞-IgG螯合物可用于制备检测血样中汞-IgG螯合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了汞-IgG螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测汞-IgG螯合 物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞-IgG螯合物 可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。本发明 建立的汞-IgG螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 尚。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明所述的汞-IgG螯合物的非变性电泳条带图；
[0038] 图2为本发明所述的汞-IgG螯合物的同步辐射X线电泳条带的荧光分析图；其 中，图1中，M为Marker，5为萊-IgG螯合物；图2中，横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该 蛋白条带中汞金属能量。
【具体实施方式】
[0039] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0040] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0041] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0042] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0043] 本发明中的所述能与IgG特异性结合的填料，为表面附有能捕获IgG的蛋白的硅 胶或树脂；
[0044] 本发明中的能捕获IgG的蛋白（抗IgG抗体），包括但不限于兔Anti-人类IgG H&L，其品牌为Abeam、型号为ab6715 ;
[0045] 本发明中的能与汞特异性结合的填料，为表面附有能捕获汞的物质的硅胶或树 脂；
[0046] 本发明中的能捕获汞的物质，包括但不限于鼠抗Hg mAb，购买自巴傲德生物技术 公司（BioWorld Inc)、货号为 AP7014;
[0047] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0048] 底物为甲基联苯胺（TMB)溶液；
[0049] 洗涤液为含有 KH2PO4 0· 2mg/ml、Na2HPO4 · 12H20 2. 90mg/ml、NaCl 8. Omg/ml、KCl 0· 2mg/ml、0. 5% Tween-20 的 pH 为 7· 4 的 0· 15M PBS 溶液；
[0050] 封闭液为I % -5 %牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
[0051] 稀释缓冲液为含 I. 5mg/mL Na2C03、2. 93mg/ml NaHCO3的 PH 为 9. 6 的 0· 05M 磷酸 盐缓冲液；
[0052] 酶标抗体为HRP酶标抗体；
[0053] 终止液为：将21. 7ml的2M H2SO4定容至200ml的ddH 20中