>[0164] 标准品的制备步骤：
[0165] A.标准品的配制
[0166] 1)透析袋的处理：将透析袋放入500ml (根据烧杯体积可变换用量）体积的 5mmol/L EDTA+200mmol/L NaHCO3溶液中，煮沸 IOmin ;倾弃 EDTA/NaHC03液，用超纯水轻轻 漂洗，再用500ml 5mmol/L EDTA煮沸IOmin ;弃掉煮沸液，彻底用超纯水清洗，加入大量的 超纯水浸泡透析袋4°C过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋，用大量的超纯水彻底冲洗其内 外表面；
[0167] 2)取 2. Omg ITCBE 溶于 2ml DMSO 中；
[0168] 3)称取4. OmgIgG溶于4. OmL 0· OlM pH9. 0硼酸盐缓冲液中，充分振荡溶解，配制 成1.0 mg/mL的蛋白溶液；
[0169] 4)缓慢将步骤2制备的液体加入IgG溶液中，边滴加边震荡，于25°C，lOOr/min的 摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgG结合的ITCBE ;
[0170] 5)将透析所得的液体用lmol/L HCl调节pH值至7. 0,然后缓慢逐渐滴加80 μ 1 lmmol/L汞离子溶液，边滴加边振荡，以免汞离子使蛋白变性沉淀；
[0171] 6)将加好的溶液在25°C，lOOr/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析 24h ；
[0172] 7)将透析好的液体于-20°C分装保存。
[0173] B)纯化汞-IgG螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgG以及多余的汞离子，即得汞-IgG螯合物，具体步骤如下：
[0174] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使汞-IgG螯合物 复溶；
[0175] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgG特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0176] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgG与 填料特异性结合；
[0177] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0178] (5)收集：收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0179] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0180] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0181] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0182] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱；
[0183] (10)收集：收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；
[0184] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得汞-IgG螯合物
[0185] C)对汞-IgG螯合物的鉴定，具体步骤如下：
[0186] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
[0187] (2)加样：取步骤B)中8 μ L提取纯化得到的汞-IgG螯合物，加入2 μ L上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0188] (3)电泳：连接电泳板，加入电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为22mA恒流， 环境温度为4度；至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳；
[0189] (4)检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶， 然后再采用AAS法检测是否含有汞以及检测汞的含量。
[0190] D)检测结果
[0191] (1)电泳结果：
[0192] 其中，图1为本发明所述的汞-IgG螯合物的非变性电泳条带图。
[0193] (2)同步辐射X荧光分析：
[0194] 蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机（BEPC)的4W1〃 同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2. 2GeV，束流强度100mA。样品移动台 (TSA200型，北京卓立汉光公司）可在计算机控制的步进马达驱动下沿X、Y二维方向上移 动以改变入射光斑位置，移动步长为〇. 〇〇25_。从样品发射出的X射线由Si (Li)探测器 (PGT Inc. LS 30143-DS)探测，探头与入射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信 号用PGT多道分析仪（MCA4000)获取输出。用11. 5keV的单色同步辐射光激发样品，调节 入射光斑（lmmx 3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均勾 缓慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每Imm取一个谱。采用AX IL 软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰进行归一处理，以抵 消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以同样的方式测量定量标准干胶 膜的荧光谱。
[0195] 图2为本发明所述的汞-IgG螯合物的同步辐射X线电泳条带的荧光分析图，图中 横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该蛋白条带中汞金属能量（含量）值。
[0196] (3)采用石墨炉原子吸收光谱法（AAS)初步测定本实施例得到的汞-IgG螯合物中 的汞含量，其含量为146. 944 μ g/L。
[0197] 本发明一种宙量检测汞-IgG罄合物的方法的检测条件的确宙：
[0198] 1.补体蛋白最佳工作浓度以及血浆的最佳稀释倍数的确定
[0199] 步骤如下：
[0200] (1)将IgG Ab用稀释缓冲液按照以下配比稀释（1:500000、1:1000000、 1:2000000、1:4000000)，加入ELISA板微孔中，将抗IgG Ab包被于固相载体上，每个浓度包 被三排，4°C过夜18小时；
[0201] (2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
[0202] (3)待检样品按以下浓度稀释（1:10、1:20、1:40)，加入微孔中，按照上述包被的 抗IgG Ab浓度，同一个浓度的抗IgG Ab的分别加入不同稀释度血浆，37°C作用1小时；
[0203] (4)移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入抗Hg Ab，抗Hg Ab 按以下浓度稀释（即1:2500、1:5000、1:10000、1:20000)，按照每一个相同抗IgG Ab、血清 稀释浓度，不同浓度抗Hg Ab各加2孔，37°C作用1小时，使抗Hg Ab与IgG上的金属汞反 应；
[0204] (5)酶标抗体选择最适工作浓度，即2ng/ml，移去抗Hg抗体，并用洗涤液进行洗 涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使HRP酶标抗体 与汞-IgG螯合物反应；
[0205] (6)移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0206] (7)以与加底物液相同的速度和顺序滴加终止液至每一微孔；
[0207] (8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上分别读取各孔OD值。 根据各孔OD值数值，选择抗IgG Ab、抗Hg-Ab的最佳工作浓度以及血衆的最佳稀释倍数。
[0208] 试验中同时以所制对照品作为阳性对照，选择IgG抗体+封闭+Hg抗+酶标+底 物（即不加检测样本）作为阴性对照1、IgG抗体+封闭+血浆+酶标+底物（即不加 Hg 抗）作为阴性对照2、IgG抗体+封闭+酶标+底物（即不加检测样本和Hg抗）作为阴性 对照3、IgG抗体+封闭+血浆+Hg抗+底物（即不加酶标）作为阴性对照4,封闭+血浆 +Hg抗+酶标+底物（即不加 IgG抗体）作为空白对照1，只加底物及PBS作为空白对照2 ; 检测结果见表1-2。
[0209] 表1 :抗IgG Ab和Hg抗体最佳工作浓度以及血浆稀释倍数的确定
[0210]
[0213] 由表1-2数据显示，我们可以看出当人IgG抗体的稀释度为1:1000000、全血稀释 度为1:20、Hg抗稀释度为1:5000时，OD值最大，虽然OD值小于0. 8,但是其所对应的阴性 对照组OD值全部小于0. 1，并且其所对应的阳性对照组，OD值大于0. 8,所以选此值所对应 的浓度作为最佳工作浓度（即人IgG抗体浓度为1:1000000,全血稀释度为1:20, Hg抗稀 释浓度为1:5000)。
[0214] 2. ELISA洗脱液最佳工作浓度及时间确定
[0215] 步骤如下：（1)将人IgG抗体用稀释缓冲液稀释至1000000倍（质量体积比），加 入ELISA板微孔中，37°C水浴3小时，储存冰箱；
[0216] (2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2%牛血清白蛋白 作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
[0217] (3)移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的 HRP酶标抗体，37°C作用2小时，使其与人IgG抗体反应；
[0218] (4)准备洗脱液：将木瓜蛋白酶用pH 8.0,0. lmol/L Tris-HCI缓冲液配制成 l-2mg/ml，再加入 lmmol/L 二硫苏糖醇（DTT)37°C孵育 30min ;
[0219] (5)移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中的木瓜蛋白酶浓 度：酶标抗体浓度比=1:80、1:40、1:20、1:10、1:5，其中，每个浓度作3个复孔，分别放置于 37°C温度下洗脱lh、2h、3h ;
[0220] (6)移去洗脱液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37°C避光作用 30分钟；
[0221] (7)以与加底物液相同的速度和顺序滴加终止液至每一微孔；
[0222] (8)取405nm波长，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上分别读取每组OD值， 通过与PBS缓冲液组比