一种香豆素二聚体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种香豆素二聚体及其制备方法和应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 蜡梅在我国已有1000多年的栽培历史，作为一种香花植物，其叶和花具有挥发性 的芳香油，香气怡人，常作为花卉盆景和鲜切花来观赏，因此是我国著名观赏植物之一。作 为观赏植物，蜡梅不仅可以在公园、花地等地方孤植或者丛植，也可以栽培在建筑物前、草 坪中或者道路两旁，还可作为盆景，栽培于室内。
[0003] 蜡梅属植物除了观赏价值外还具有药用价值。《贵阳民间药草》中记载，显示蜡梅 花可冲泡为茶，作为一种治疗咳嗽的药茶，因此蜡梅也是一种中药材，广泛被人们利用，在 苏南民间就是用蜡梅花来治疗感冒咳嗽。蜡梅不仅可治疗感冒咳嗽，还可以治疗因风寒引 起的腹痛、腹胀、消化不良，也可以治疗伤食引起的胃炎、胃痛、泛酸。
[0004] 柳叶蜡梅(学名：Chimonanthus salicifolius S.Y.Hu)又名山蜡梅、亮叶蜡梅、毛 山茶、岩马桑、香风茶、石凉茶等，为蜡梅科蜡梅属常绿灌木，是中国特有的属、种，主要产于 安徽、江西、浙江。柳叶蜡梅也被应用于医药研究，表明其具有抗病毒、止咳化痰、抗菌等疗 效。其提取物对人宫颈癌ffiLA和人胃癌SGC-7901的生长有抑制作用。柳叶蜡梅叶具有浓郁 的香味，其精油成分不仅有镇痛、镇咳、祛痰作用，还能抑制食欲，明显减缓小鼠体重增长， 起到减肥作用。该药使用历史悠久、疗效确切、副作用较少，是值得研究开发的药茶多用品 种。经国家有关科研单位测定，柳叶蜡梅含挥发油、槲皮素、碱、黄酮类等多种有效性成分， 铁、钙、锌、镁、硒等微量元素及维生素B1、维生素B2、维生素C等含量丰富，并含18种氨基酸。
[0005] 本发明以柳叶蜡梅枝干等器官为研究对象，进行提取、分离、纯化、结构鉴定得到 7-羟基_6,8_二甲氧基甲氧基-7C香豆素酯），属于香豆素的二聚体类化合物，该化 合物具有明显的抗肿瘤活性。 (三)
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种香豆素二聚体7-羟基-6，8-二甲氧基- 3-(6'-甲氧基-香 豆素酯)及其制备方法和应用。
[0007] 本发明的技术方案为：
[0008] -种式（I)所示的香豆素二聚体：
[0010] -种式(I)所示的香豆素二聚体的制备方法，所述的制备方法按如下步骤进行：
[0011] (1)将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后过滤除去不溶物， 取滤液减压浓缩得到乙醇浸膏；
[0012] (2)将步骤（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到悬浮液，所得悬浮液先用石油醚萃 取，之后石油醚萃余液(水相)再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液，将所得乙酸乙酯萃 取液进行减压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏；
[0013] (3)用200~300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层析分离，以石 油醚/乙酸乙酯体积比为7 :1~1:7的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含目标化合物的 洗脱液，减压浓缩后合并得粗品；
[0014] (4)对步骤(3)所得粗品进行凝胶柱层析分离，以甲醇/氯仿体积比1:0.5~2的混 合液为洗脱剂，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到所述的香豆素二聚体。
[0015] 本发明所述的制备方法，步骤(1)中，推荐用于浸提提取的乙醇为体积分数95%的 乙醇;所述乙醇浸提提取的具体操作方法为:将粉碎干燥后的柳叶蜡梅枝干与乙醇以料液 质量比1:0.8~1混合，常温(20~30°C)浸提5~10天，过滤得到乙醇浸提提取液，重复浸提2 ~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C减压旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏（粘稠状，无 醇味）。
[0016] 步骤(2)中，将所述乙醇浸膏分散于水中时，推荐所述乙醇浸膏与水的质量比为1: 2~4;所述悬浮液用石油醚进行萃取时，推荐所述悬浮液用等体积的石油醚萃取3次，石油 醚萃取之后的萃余液(即下层水相)继续用等体积的乙酸乙酯萃取3次。
[0017]步骤(3)中，用200~300目柱层析硅胶对乙酸乙酯浸膏进行柱层析分离时，所述梯 度洗脱的具体操作方法为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1: 2、1: 3.5、1:5、1:7的混合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为4~1 OmL/min (优选 6mL/min)，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为200min~500min，收集含目标化合物的洗脱 液，减压浓缩后合并得粗品。
[0018]步骤(4)中，推荐采用Sephadex LH-60进行凝胶柱层析分离，所述分离的方法具体 为：以甲醇/氯仿体积比1:0.5~2的混合液为洗脱剂，洗脱剂的流速为0.5~2mL/min(优选 0.8mL/min)，洗脱时间为100~400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到所 述的香豆素二聚体。
[0019]本发明中，所述的目标化合物(香豆素二聚体)进行薄层层析(TLC)时，通常以乙酸 乙酯：甲醇= 1:1为展开剂，其Rf值为0.4。所述的制备方法步骤(3)或步骤(4)中，可通过TLC 检测收集含目标化合物的洗脱液。
[0020] 本发明所述的香豆素二聚体在制备抗肿瘤药物中具有应用前景。实验证明，本发 明香豆素二聚体对肿瘤细胞Hela、HL-60有较好的抑制作用，IC 5Q(yM)分别为18.3±0.3、 23.1 ±0.3，对PC-3的抗肿瘤活性较弱，IC5Q(yM)为76.1 ±0.6。由此可知，该化合物是潜在的 抗肿瘤药物。
[0021] 本发明的有益效果在于：
[0022] 本发明所述香豆素二聚体的提取、分离、纯化方法简单，化学结构经各种波谱学数 据得到确认，不存在异构体，抗肿瘤活性明确，具有潜在的工业化制备和开发为抗肿瘤药物 的价值。 (四）【具体实施方式】
[0023]下面通过具体实施例对本发明进行进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限 于此。
[0024]实施例1:香豆素的二聚体的制备
[0025]提取:将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥，得到干燥的柳叶蜡梅粉末879g，用1.2L 95 %乙醇常温浸提一周，过滤得到浸提液，重复浸提3次，合并每次所得浸提液，减压蒸馏回 收乙醇，得到乙醇浸膏765g，将所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到悬浮液，所得悬浮液 先用等体积的石油醚萃取3次，之后石油醚萃余液（即下层水相)再用等体积的乙酸乙酯萃 取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液，将所得乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩，得到乙酸乙酯浸 膏336g;
[0026]分离：用200~300目柱层析硅胶（500g)对乙酸乙酯浸膏进行柱层析分离，以石油 醚/乙酸乙酯体积比分别为7:1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1: 2、1:3.5、1: 5、1:7的混合液为洗脱 剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为6ml/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为350min，收 集含目标化合物的洗脱液，减压浓缩得到粗品30.7g。
[0027] 提纯:所得粗品通过Sephadex LH-60柱层析进行分离，以甲醇：氯仿体积比1:1的 混合液进行洗脱，流速为0.8ml/min，洗脱时间为300min，收集含目标化合物的洗脱液，减压 浓缩得到香豆素的二聚体22.5mg。
[0028]实施例2:香豆素的二聚体的制备
[0029]提取:将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥，得到干燥的柳叶蜡梅粉末859g，用0.9L 95 %乙醇常温浸提一周，过滤得到浸提液，重复浸提3次，合并每次所得浸提液，减压蒸馏回 收乙醇，得到乙醇浸膏648g，将所得乙醇浸膏分散于2500mL水中，得到悬浮液，所得悬浮液 先用等体积的石油醚萃取3次，之后石油醚萃余液（即下层水相)再用等体积的乙酸乙酯萃 取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液，将所得乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩，得到乙酸乙酯浸 膏296g;
[0030]分离：用200~300目柱层析硅胶（500g)对乙酸乙酯浸膏进行柱层析分离，以石油 醚/乙酸乙酯体积比分别为7:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1 :5、1:7的混合液为洗脱剂，进行梯度洗 脱，洗脱剂的流速为7ml/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为300min，收集含目标化合 物的洗脱液，减压浓缩得到粗品28.6g。
[0031 ] 提纯:所得粗品通过Sephadex LH-60柱层析进行分离，以甲醇：氯仿体积比1:2的 混合液进行洗脱，流速为0.6ml/min，洗脱时间为400min，收集含目标化合物的洗脱液，减压 浓缩得到香豆素的二聚体18.7mg。
[0032]实施例3:香豆素的二聚体的制备
[0033]提取:将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥，得到干燥的柳叶蜡梅粉末867g，用1.0L 95 %乙醇常温浸提一周，过滤得到浸提液，重复浸提3次，合并每次所得浸提液，减压蒸馏回 收乙醇，得到乙醇浸膏699g，将所得乙醇浸膏分散于3000mL水中，得到悬浮液，所得悬浮液 先用等体积的石油醚萃取3次，之后石油醚萃余液（即下层水相)再用等体积的乙酸乙酯萃 取3次，合并得到乙酸乙酯萃取液，将所得乙酸乙酯萃取液进行减压浓缩，得到乙酸乙酯浸 膏273g;
[0034]分离：用200~300目柱层析硅胶(400g)对乙酸乙酯浸膏进行柱层析分离，以石油 醚/乙酸乙酯体积比分别为7:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1 :5、1:7的混合液为洗脱剂，进行梯度洗 脱，洗脱剂的流速为5ml/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱时间为400min，收集含目标化合 物的洗脱液，减压浓缩得到粗品19.7g。
[0035] 提纯:所得粗品通过Sephadex LH-60柱层析进行分离，以甲醇：氯仿体积比2:1的 混合液进行洗脱，流速为0.9ml/min，洗脱时间为200min，收集含目标化合物的洗脱液，减压 浓缩得到香豆素的二聚体14.5mg。
[0036]实施例4:化合物测试 [0037]表1:实验所用仪器
[0039]试剂:溶剂均为分析纯试剂，未进行处理。
[0040]对实施例1，实施例2或实施例3制得的对称的香豆素二聚体化合物进行化合物测 试:1114.15〇-151°(：，￡51-]/^111/2:413[]/1+11] +，冊-￡51-]/^111/2:411.0726[021111609-11]-，计算 值为411.0722，可确定其分子式为C 21H16〇9，分子量为412。
[0041 ] 表2:香豆素二聚体化合物的NMR数据(DMS0)
[0044] 实施例5:抗肿瘤活性测试
[0045] 对实施例1~3制得的香豆素的二聚体化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。
[0046] 方法:用MTT法测定制得的香豆素二聚体对肿瘤细胞(He la，PC-3，HL-60)生长的影 响。用含有10%新生牛血清的DEME高糖型完全培养基，在37°C的C02孵育箱中培养3种肿瘤 细胞，待肿瘤细胞迅速生长时，将其配制成细胞悬浮液，细胞密度为1 X 105个/mL，以每孔 100此移接于96孔细胞培养板中，于37°C的⑶2孵育箱中培养24h。然后依次加入3个不同浓 度受试化合物，各l〇〇yL，以不同浓度的顺铂作为阳性对照组，受试化合物及顺铂的浓度设 定为:200、100、50、25、12.5yM，每个浓度设5个复孔，空白对照组加100yL DEME完全培养基， 再放置于37 °C的⑶2孵育箱中继续培养。72小时以后每孔中加入5mg/mL MTT 20yL，继续培 养4h。吸去上清液，每孔加入200yL DMS0，震荡摇匀10min，使甲瓒完全溶解，用酶标仪测定 490nm处的每孔内溶液的0D值。重复3次试验。药物抑制率=(1-实验组0D值/对照组0D值）X 100%，从而计算IC 5〇值。
[0047]结果:实施例制得的香豆素二聚体对肿瘤细胞Hela、HL_60有较好的抑制作用，IC50 (虚)分别为18.3±0.3、23.1±0.3;对卩(：-3的抗肿瘤活性较弱，1(：5()(虚)为76.1±0.6。这提 示该化合物可能是潜在的抗肿瘤药物(如表3所示）。
[0048]表3:制得的香豆素的二聚体体外抗肿瘤活性
【主权项】
1. 一种式(I)所示的香豆素二聚体：2. -种式（I)所示的香豆素二聚体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法按如下步 骤进行： (1) 将柳叶蜡梅的枝干进行粉碎干燥后，用乙醇浸提提取，之后过滤除去不溶物，取滤 液减压浓缩得到乙醇浸膏； (2) 将步骤（1)所得乙醇浸膏分散于水中，得到悬浮液，所得悬浮液先用石油醚萃取，之 后石油醚萃余液再用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取液，将所得乙酸乙酯萃取液进行减 压浓缩，得到乙酸乙酯浸膏； (3) 用200~300目柱层析硅胶对步骤（2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层析分离，以石油 醚/乙酸乙酯体积比为7:1~1:7的混合液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集含目标化合物的洗 脱液，减压浓缩后合并得粗品； (4) 对步骤(3)所得粗品进行凝胶柱层析分离，以甲醇/氯仿体积比1:0.5~2的混合液 为洗脱剂，收集含目标化合物的洗脱液，减压蒸除溶剂得到所述的香豆素二聚体。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，用于浸提提取的乙醇为体积 分数95 %的乙醇。4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述乙醇浸提提取的具体操 作方法为:将粉碎干燥后的柳叶蜡梅枝干与乙醇以料液质量比1:0.8~1混合，常温浸提5~ 10天，过滤得到乙醇浸提提取液，重复浸提2~4次，合并每次所得乙醇浸提提取液，50°C减 压旋蒸回收乙醇，得到乙醇浸膏。5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇浸膏与水的质量比 为1:2~4〇6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述悬浮液用等体积的石油 醚萃取3次，石油醚萃取之后的萃余液继续用等体积的乙酸乙酯萃取3次。7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述梯度洗脱的具体操作方 法为：以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为7 :1、5:1、3.5:1、2:1、1:1、1 :2、1:3.5、1:5、1:7的混 合液为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱剂的流速为4~10mL/min，每种不同比例洗脱剂的洗脱 时间为200min~500min，收集含目标化合物的洗脱液，减压浓缩后合并得粗品。8. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用Sephadex LH-60进行凝 胶柱层析分离，所述分离的方法具体为：以甲醇/氯仿体积比1:0.5~2的混合液为洗脱剂， 洗脱剂的流速为0.5~2mL/min，洗脱时间为100~400min，收集含目标化合物的洗脱液，减 压蒸除溶剂得到所述的香豆素二聚体。9. 如权利要求1所述的香豆素二聚体在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种式(I)所示的香豆素二聚体及其制备方法，本发明所述香豆素二聚体的提取、分离、纯化方法简单，化学结构经各种波谱学数据得到确认，不存在异构体，抗肿瘤活性明确，具有潜在的工业化制备和开发为抗肿瘤药物的价值；
【IPC分类】C07D311/16, A61P35/00, A61K31/37
【公开号】CN105712963
【申请号】CN201610046373
【发明人】王奎武, 李丹
【申请人】浙江工商大学