一种异香豆素类化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种异香豆素类化合物及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 曲霉属真菌广泛存在于自然界中。其中，米曲霉是一种能产生复合酶的菌株，该菌 株除可产生蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等多种功能的酶，因而广泛 应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业。同时，米曲霉次生代谢产物也被认为是一个亟待开发 的重要资源。从不同来源的米曲霉发酵产物中也分离得到了一系列具有生物活性的天然产 物，包括了生物碱、多肽、萜类化合物以及多酚类化合物。如从海洋生物红藻 Heterosiphonia japonica中分离得到的米曲霉发酵产物中分离得到了一系列新颖的Π 引噪 二砲类化合物asporyzins A-C。
【发明内容】
[0003] 本发明以百合科重楼属漬重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)中分离得 到的曲霉属内生真菌米曲霉的固态发酵物为原料，经有机溶剂提取、硅胶柱层析、高压液相 色谱分离得到一个新的异香豆素类化合物米曲霉素 B，该化合物是从自然界中发现的具有 罕见2-羰基-丙基和3-羟基-丙基片段的异香豆素类化合物，并且该化合物具显著的有抗轮 状病毒活，应用前景突出。
[0004] 本发明的第一目的是提供一种异香豆素类化合物;第二目的在于提供所述异香豆 素类化合物的制备方法;第三目的在于提供所述异香豆素类化合物的应用。
[0005] 本发明的第一目的是这样实现的，所述的异香豆素类化合物是以百合科植物滇重 楼（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)为基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富 集、高压液相色谱分离获得，其分子式为C 16H1805,命名为米曲霉素 B，英文名为oryzaeins B， 其结构式为：
[0006] 本发明的第二目的是这样实现的，是以百合科植物滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)为基础，经菌种 分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离步 骤获得，具体为： A、 内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分离:将75%乙醇消毒后的百合科重楼属 滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖杆和/或叶片放入无菌的研钵中进行研 磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000 rpm离心2~lOmin，吸取1~100微升上清液，涂布 在BL平板上，倒置于培养箱中，25~30摄氏度黑暗培养2~10天，反复挑取单菌落培养并编号 保存菌种，直到获得单一内生真菌菌落，经ITS测序（Genbank Accession number
oryzae)，其曲霉属真菌米曲霉见附图4; B、 内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)菌种培养:A步骤分离得到的米曲霉菌种在 室温下接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25~30°C培养7~10天，再接种在50~500毫升的三 角瓶中，每个三角瓶含10~100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于25~30摄氏度下震荡培养5~10 天得到液体发酵种子； C、 米曲霉(Aspergi 1 lus oryzae)的规模化发酵:将B步骤培养得到的的液体发酵种子 进行规模化发酵，规模化发酵是在100~1000个100~500ml的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有10 ~200g大米和10~200ml蒸馏水，每个瓶中接种1.0~5.0ml步骤B培养得到的液体发酵种子，于 25~30°C培养15~45天得到米曲霉发酵物； D、 浸膏提取:将C步骤发酵得到的米曲霉发酵物用有机溶剂超声提取2~5次，每次30~ 60min，合并提取液后过滤提取液，减压浓缩，静置，滤除沉淀物，浓缩得到浸膏a; E、 硅胶柱层析:将D步骤所得的浸膏a用浸膏a重量的1.5~3倍量的丙酮或者二氯甲烷溶 解，用浸膏a重量的1~1.5倍量的80~100目硅胶拌样，然后上硅胶柱层析，装柱硅胶为200~ 300目，用量为浸膏a重量的6~10倍量;用体积配比为20:1~0:1的混合有机溶剂梯度洗脱，收 集梯度洗脱液、浓缩，经TLC或分析型HPLC监测，合并相同的部分； F、 反相柱层析:将E步骤中以7:3配比的混合有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液上反相柱 层析，反相柱是用反相材料C-18装柱；用体积浓度为20~80%的甲醇溶液进行梯度洗脱，收集 各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分。
[0007] G、高效液相色谱分离:将以体积浓度50~70%甲醇溶液洗脱得到的洗脱液经高效液 相色谱分离纯化，即得所述的异香豆素类化合物米曲霉素 B，英文名为oryzaeins B。
[0008] 本发明制备得到的异香豆素类化合物的结构是用核磁共振结合其他波谱技术鉴 定确认的，具体为： 化合物的紫外光谱（溶剂为甲醇）为Amax(log〇: 210 (3.78)，270 (3.57)，288 (3.32)，325 (3.36) nm。红外光谱（溴化钾压片）为vmax 3430，3085，2957，2848，1724， 1654，1615，1568，1469，1350，1182，1128，1071 cm-'HRES 頂 S 显示本发明化合物准 分子离子峰m/z 313.1058 [Μ + Na]+ (calcd 313.1052 for Ci6Hi8〇5Na)。结合 13C 和1Η NMR谱（图1和图2,碳谱氢谱数据归属见表1)，推出分子式为C16H18〇5,不饱和度为8</H NMR谱 (图2)中显示了 1个甲氧基，1个1，2,3,4-四取代苯环信号，1个三取代烯氢信号，4个亚甲基 信号和1个甲基信号。在碳谱和DEPT(图1)中观测到了 16个碳原子信号，其中2个甲基(包括 了 1个甲氧基信号），4个亚甲基，3个芳香次甲基和7个季碳信号(包括了 2个羰基和2个含氧 季碳信号）。其中，2个羰基和4对双键碳占用了 6个不饱和度，提示该分子是一个二环类化合 物。通过一维数据的仔细比对和分析，初步推测该化合物是一个含有一个甲氧基、一个2-羰 基-丙基和一个3-羟基-丙基片段的异香豆素类化合物。这些推测通过二维核磁共振图谱得 到确定（图3)。
[0009] 表1米曲霉素 B的1Η和13C NMR数据(溶剂为CDC13)
首先，通过H-4与C-l，C-3，C-4a，C-5和C-8a的相关、H-6与C-4a，C-5，C-7和C-8的相关、 以及H-7与C-5，C-6，C-8和C-8a的相关确定了化合物的基本骨架为异香豆素。其次，两个特 殊的取代基(一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基）分别通过H 3-ll与C-9和C-10相关以及 H2-3 '与C-1 '相关而确定。最后，通过H2-9与C_1，C_3和C-4相关、H3-I '与C_4a和C-6相关以及 8-0Me与C-8相关，确定了三个取代基(一个羟基、一个2-羰基-丙基和一个3-羟基-丙基）的 连接位置分别为C-3，C-5和C-8。因此，该异香豆素类化合物结构得以确定，系统名为8-甲氧 基 _3_( 2-幾基丙基)_5_( 3-羟基丙基)香?素，并命名为米曲霉素 B。其结构式为：
[0010] 本发明的第三目的是这样实现的，所述的异香豆素类化合物在制备抗轮状病毒药 物中的应用。
[0011] 本发明所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)YNCA1292,已在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 9716。
[0012]本发明化合物是首次被分离出来的，通过上述核磁共振和质谱测定方法确定了为 苯丙素类化合物，并表征了其具体结构。经抗轮状病毒的实验，其TC50值为215.2 yg/mU IC50值为8.47 yg/rnL，治疗指数ΤΙ为25.41;其治疗指数超过对照病毒唑的治疗指数18.90; 化合物具有很好的抗轮状病毒活性。以上结果揭示了本发明的化合物在制备抗轮状病毒药 物中有良好的应用前景。本发明化合物结构简单活性较好，可作为抗轮状病毒药物研发的 先导性化合物用于抗轮状病毒药物制剂研发。
【附图说明】
[0013]图1为本发明化合物米曲霉素 Β的核磁共振碳谱(13C NMR); 图2为本发明化合物米曲霉素 B的核磁共振氢谱(4 NMR); 图3为本发明化合物米曲霉素 B的关键HMBC相关； 图4为曲霉属真囷米曲霉曲霉属真囷米曲霉不意图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以 限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0015]本发明所述的异香豆素类化合物，是以百合科植物滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)为基础，经菌种 分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液相色谱分离、 波谱分析获得，其分子式为C 16H1805，命名为米曲霉素 B，英文名为oryzaeins B，其结构式为：
[0016]本发明所述的异香豆素类化合物的制备方法，是以百合科植物滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis)中得到的曲霉属真菌米曲霉（Aspergillus oryzae)为 基础，经菌种分离、菌种培养、规模化发酵、有机溶剂提取、正反相硅胶柱层析富集、高压液 相色谱分离步骤获得，具体为： A、内生真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)的分离:将75%乙醇消毒后的百合科重楼属 滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖杆和/或叶片放入无菌的研钵中进行研 磨，研磨后转入无菌的塑料管内，1000~3000 rpm离心