分钟，吸取50微升上清液，涂布 在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养10天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌 种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number KM999948)确定 为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃 薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在50毫升的三角瓶中，每个三 角瓶含20毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养10天（180 rpm)。大规模发 酵在500个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中 接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养45天。
[0034]所得发酵物用乙酸乙酯超声提取5次，每次45min，提取液合并并过滤，减压浓缩提 取液，静置，滤除沉淀物，浓缩1500克浸膏a。浸膏a用1500克80~100目硅胶拌样，用200~300 目硅胶10000克装柱，用体积比分别为1 :〇、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-甲醇混 合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分， 体积比8:2的氯仿-甲醇混合有机溶剂的洗脱液b为95g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶 剂的洗脱液c为17g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇 水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分;取以体积含 量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以75%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 X 250mm，5 mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为220 nm，每次进样50 mL，收集21.0 min和24.0 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香 豆素类化合物米曲霉素 B。
[0035] 实施例3 将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖 杆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成 为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，2000 rpm离心8分钟，吸取50微升上清液，涂布 在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌 种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number KM999948)确定 为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃 薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三 角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养5天（180 rpm)。大规模发 酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中 接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
[0036]所得发酵物用乙酸乙酯超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩提 取液，静置，滤除沉淀物，浓缩500克浸膏a。浸膏a用500克80~100目硅胶拌样，用200~300目 硅胶4000克装柱，用体积比分别为1: 0、20:1、9:1、8:2、3:2、1 :1、1:2、0:1的石油醚-乙酸乙 酯混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部 分，体积比8: 2的石油醚-乙酸乙酯混合有机溶剂的洗脱液b为56g，体积比7: 3的氯仿-甲醇 混合有机溶剂的洗脱液c为12g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~ 80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分； 取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12 mL/ min，21.2 X 250mm，5 mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波 长为254 nm，每次进样50 mL，收集25.0 min和27.0 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所 述的异香豆素类化合物米曲霉素 B。
[0037] 实施例4 将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖 杆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成 为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，3000 rpm离心2分钟，吸取50微升上清液，涂布 在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌 种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number KM999948)确定 为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃 薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三 角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养5天（180 rpm)。大规模发 酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中 接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
[0038]所得发酵物用乙酸乙酯超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩提 取液，静置，滤除沉淀物，浓缩600克浸膏a。浸膏a用500克80~100目硅胶拌样，用200~300目 硅胶6000克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的环己烷-异丙醇 混合有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部 分，体积比8: 2的环己烷-异丙醇混合有机溶剂的洗脱液b为80g，体积比7: 3的氯仿-甲醇混 合有机溶剂的洗脱液c为17g。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~ 80%的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分； 取以体积含量50~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12 mL/ min，21.2 X 250mm，5 mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波 长为254 nm，每次进样50 mL，收集25.0 min和27.0 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所 述的异香豆素类化合物米曲霉素 B。
[0039] 实施例5 将75%酒精消毒过的百合科重楼属滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis)莖 杆和叶片放入无菌的研钵中，加入少量水并放有少量的石英砂进行彻底研磨，直至茎叶成 为碎片，将碎片溶液转入无菌的塑料管内，1000 rpm离心10分钟，吸取50微升上清液，涂布 在BL平板上，倒置于培养箱中，28摄氏度黑暗培养5天，反复挑取单菌落培养并编号保存菌 种，从而获得单一内生真菌菌落，经ITS测序(Genbank Accession number KM999948)确定 为曲霉属真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。将分离得到的杂色曲霉在室温下接种在马铃 薯葡萄糖琼脂培养基上，28摄氏度培养7天。将杂色曲霉接种在250毫升的三角瓶中，每个三 角瓶含100毫升马铃薯葡萄糖培养基，置于28摄氏度下震荡培养5天（180 rpm)。大规模发 酵在200个500毫升的冯巴赫瓶中进行，每个瓶含有100克大米和100毫升蒸馏水。每个瓶中 接种5.0毫升含菌营养基，28摄氏度培养30天。
[0040] 所得发酵物用甲醇超声提取4次，每次60min，提取液合并并过滤，减压浓缩提取 液，静置，滤除沉淀物，浓缩400克浸膏a。浸膏a用400克80~100目硅胶拌样，用200~300目硅 胶2400克装柱，用体积比分别为1:0、20:1、9:1、8:2、3:2、1:1、1:2、0:1的氯仿-丙酮混合有 机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分，得到8个部分，体积 比8:2的氯仿-丙酮混合有机溶剂的洗脱液b为60g，体积比7:3的氯仿-甲醇混合有机溶剂的 洗脱液c为1 lg。用反相材料C-18装柱，洗脱液b上反相柱，以体积含量为20~80%的甲醇水溶 液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，经TLC监测，合并相同的部分;取以体积含量50 ~70%甲醇水溶液洗脱得到的洗脱液，再以72%的甲醇为流动相，流速12 mL/min，21.2 X 250mm，5 mm的Zorbax PrepHT GF反相制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为254 nm，每 次进样50 mL，收集25.0 min和27.0 min的色谱峰，多次累加后蒸干，即得所述的异香豆素 类化合物米曲霉素 B。
[0041 ] 实施例6 取实施例1制备得到的异香豆素类化合物米曲霉素 B进行结构测定：用核磁共振，结合 其它波谱技术鉴定结构。
[0042]实施例1制备得到的化合物的紫外光谱（溶剂为甲醇）为Amax (logs): 210 (3.78)，270 (3.57)，288 (3.32)，325 (3.36) nm。红外光谱(溴化钾压片）为vmax 3430， 3085，2957，2848，1724，1654，1615，1568，1469，1350，1182，1128，1071 cm-、 HRESMS显示实施例1制备得到的化合物准分子离子峰m/z 313.1058 [Μ + Na]+ (calcd 313.1052 for C16H18〇5Na)。结合13C和1H NMR谱（图1和图2,碳谱氢谱数据归属见表1)，推出 分子式为Ci6H18〇5，不饱和度为8。咕NMR谱（图2 )中显示了 1个甲氧基，1个1，2，3，4-四取代苯 环信号，1个三取代烯氢信号，4个亚甲基信号和1个甲基信号。在碳谱和DEPT(图1)中观测到 了 16个碳原子信号，其中2个甲基(包括了 1个甲氧基信号），4个亚甲基，3个芳香次甲基和7 个季碳信号(包括了