香豆素衍生物的制备、药理作用及治疗脑缺血的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学、药理学与制剂领域，具体包括活性香豆素衍生物的合成与 纯化、药理作用机制研究、治疗脑缺血、脑中风、脑水肿、脑梗死、神经功能损伤的用途、制 剂。
【背景技术】
[0002] 香豆素类化合物是一类具有芳香气味的天然产物，具有苯并α -吡喃酮母核，可 视为顺式邻羟基桂皮酸脱水形成的内酯，是重要的药用天然活性化合物，以香豆素为主要 有效成分的中药-补骨脂、祖师麻、秦皮、蛇床子、前胡等，以苯并α -吡喃酮为基本母核，通 过化学合成与修饰的方法制备非天然的香豆素衍生物，对于探讨与发现这一类结构母核新 的药理活性及构效关系研究，具有重要的研究意义。
[0003] 瞬时感受器电位离子通道（transient receptor potential ion channel，TRP channel)是一类在外周和中枢神经系统分布很广泛的阳离子通道蛋白，TRP家族主要由七 个亚族组成：TRPC、TRPV、TRPM、TRPML、TRPP、TRPA和TRPN。TRP受到多种因素的调节，包 括渗透压、pH值、机械力以及一些内、外源性配体和细胞内信号分子，其参与生物体内感觉 信息传递如视觉、温度觉、痛觉和触觉等，并且具有调节胞内Ca 2+平衡等多种重要的生理功 能。
[0004] TRPV3通道于2002年首次被发现，有三个不同实验室发现了其可以被温热温度 (32°C -39°C )激活。随后的研究发现，该通道还可以被合成化合物2-APB、樟脑、胞内氢离 子激活。TRPV3通道在人体内分布广泛，在感觉神经元如背根神经节、三叉神经节和皮肤角 质细胞中大量表达。对于TRPV3的生理功能，目前研究认为其与人体的温度感受密切相关。 另外，由于TRPV3较为特殊的在皮肤角质细胞中的表达，一系列相关研究发现了 TRPV3与脱 发、瘙痒等皮肤疾病的相关性，但具体机制尚不明了。2012年，Lin et al首次发现了 TRPV3 突变导致的一种严重的皮肤系统遗传疾病一一Olmsted综合症，也暗示着TRPV3在生理、病 理过程中扮演的重要角色。
[0005] FlexStation3技术是一种基于钙荧光的高通量筛选技术。它的主要原理是：应用 可以与钙离子特异性结合的染料孵育细胞，细胞内含有大量可结合钙离子的未发光染料分 子。当所表达通道激活后大量钙离子内流，与胞内的染料结合并发出荧光。通过读取荧光 值的强度，由其强度变化反应离子通道的开合。该方法适用于96孔板或384孔板，可以一 次性筛选多种化合物，实现高通量筛选。
[0006] 研究离子通道活性及评估化合物对其作用的方法是利用电生理技术进行检测，因 其直接、灵敏的优点而成为了检测离子通道的"金标准"。电生理膜片钳技术是应用玻璃微 电极在细胞膜表面形成高阻封接，将细胞上的离子通道接入放大器、电极、浴液组成的电环 路，给予细胞不同刺激，通过人工钳制细胞的膜电位而观察记录电环路中的电流改变情况， 从而反映离子通道的开合。
[0007] Transient receptor potential vanilloid-3 (TRPV3)是非选择性通透|丐离子的 阳离子通道，在皮肤表皮细胞广泛的表达。TRPV3可被非伤害性的温觉刺激和伤害性的热 觉刺激激活。随着人们对TRPV3通道的研究加深，发现点突变导致的TRPV3功能上调导致 皮肤溃烂、产生剧烈瘙痒及疼痛；敲除TRPV3,在AEW处理的慢性瘙痒模型中，搔抓反应明显 减少；而且在研究过敏性皮炎患者时发现TRPV3的表达量明显增高。据此，人们认为TRPV3 有可能成为治疗瘙痒疾病的一个作用靶点。
[0008] 神经细胞钙离子超载的兴奋毒性是脑缺血性损伤的病生理学机制。脑中风是以 脑局部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病，是严重危害人类健康的三大主要 杀手之一。长期以来，人们对脑中风和缺血性脑损伤的关注焦点一直集中在控制和抑制 NMDA(N-甲基-D-天（门）冬氨酸）受体介导的钙内流，其理论依据在于NMDA受体作为谷 氨酸受体的亚型具有高钙离子通透性。NMDA受体的病理性激活导致细胞内钙浓度升高，使 得细胞内下游信号传导通路激活，引发延迟的神经细胞凋亡。然而，过去的20年里所有基 于阻断NMDA受体功能所研发的抑制剂在只在临床前有效，而在抗脑缺血的临床试验中均 告失败。这些研究结果提示，寻找非NMDA通路的分子靶点是探索脑缺血性损伤保护的新希 望。
[0009] 脑缺血性损伤和缺血再灌注损伤（在缺血基础上恢复血流后，组织器官的结构破 坏不但未减轻反而加重）重要的病理特征表现为脑缺血引起的组织酸化和缺血引起的代 谢性酸中毒。其原因在于脑缺血激活了醣酵解的厌氧途径，导致乳酸在细胞内和细胞外间 隙的堆积。研究表明，乳酸酸中毒可以激活氢离子门控的非选择性阳离子TRP通道和ASIC 通道，导致细胞内钙超载而进一步加重脑缺血性损伤（见说明书附图）。我们近期的研究发 现，细胞内氢离子浓度升高即细胞内酸化可特异性激活增强TRPV3通道的功能，导致细胞 钙超载并引起凋亡。这些研究结果提示，脑缺血引起的组织酸化以及缺血引起的代谢性酸 中毒激活TRPV3通道，过度激活的TRPV3导致细胞钙离子内流超载引起细胞凋亡，进而加重 大脑细胞的缺血性损伤。
[0010] 技术方案
[0011] 本发明涉及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位 为羟基取代。
[0012]
[0013] &、或、和、R2为甲基、氯甲基、三氟甲基、乙羧基、乙酸甲酯基、乙酰基、乙羧基、丁 基、苯基、氟、氯、溴中的任意一种或多种。
[0014] R3、或、和、R4为羟基
[0015] 本发明涉及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环4位被三氟甲基取代，7、8位为羟基取 代。
[0016]
[0017] 7,8_ 羟基-4-三氣甲基-苯并P比喃-2-酮（7,8-dihydroxy-4-trifluo;romethyl-2H-chromen_2-〇ne)
[0018] 本发明涉及香豆素类化合物，它结构是如下任意一种或多种：
[0020] 本发明涉及香豆素类化合物的制备。
[0021] 本发明涉及香豆素类化合物的制备、后处理及纯化方法。采用连苯三酚、间苯二 酚、3-甲氧基邻羟基苯甲醛、或5-溴邻羟基苯甲醛，与乙酰乙酸乙酯衍生物、丙酮二羧酸、 或丁酰乙酸乙酯衍生物在浓H2S04、70% H2S04、TiC14、哌啶、TUD的催化条件下生成香豆素 类化合物。
[0022] 本发明涉及香豆素类化合物的结构，衍生合成的其它同系列化合物的制备及后处 理方法。
[0023] 本发明涉及香豆素类化合物制备调节瞬时离子通道蛋白TRPV3亚型的组合物。本 发明涉及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位为羟基取 代。本发明涉及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环4位被三氟甲基取代，7、8位为羟基取代。
[0024] 本发明涉及香豆素类化合物用于瞬时受体电位离子通道蛋白（transient receptor potential channels)中的TRPV亚型家族的分子生物学机制研究，通过 FlexStation3技术及电生理技术对该类化合物的生物学机制进行系统研究。本发明涉及分 子生物学方法模型的搭建与实验方法，实验结果及数据分析。
[0025] 7, 8_ 羟基 _4_ 三氣甲基-苯并吡喃 _2_ 酮（7, 8-dihydroxy-4-trif luoromethyl-2H-chromen-2-〇ne)电生理实验 IC5。值=21±1· 0 μΜ〇
[0026] 本发明涉及香豆素类化合物用于制备治疗脑缺血的药物组合物。本发明涉及香豆 素类化合物，苯并吡喃酮环3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位为羟基取代。本发明涉及 香豆素类化合物，苯并吡喃酮环4位被三氟甲基取代，7、8位为羟基取代。
[0027] 本发明涉及香豆素类化合物作用于脑缺血动物模型的搭建与实验方法，实验结果 及数据分析。
[0028] 本发明涉及香豆素类化合物作用于制备治疗脑缺血的药物组合物。本发明涉及香 豆素类化合物，苯并吡喃酮环3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位为羟基取代。本发明涉 及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环4位被三氟甲基取代，7、8位为羟基取代。
[0029] 本发明涉及香豆素类化合物用于制备治疗脑缺血、脑中风、脑水肿、脑梗死、神经 功能损伤中任意一种或多种疾病的药物组合物。
[0030] 本发明涉及香豆素类化合物作用于制备抑制脑缺血引起的神经功能损伤及脑梗 死、降低脑水含量、缓解脑水肿现象中任意一种或多种疾病的药物组合物。
[0031] 7,8_ 羟基 _4_ 三氣甲基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4_trif luoromethyl-2H-chromen-2_one)用于制备治疗脑缺血、脑中风、脑水肿、脑梗死、神经功能损伤中任意一 种或多种疾病的药物组合物，该化合物用于小鼠神经功能缺损、脑梗死体积测定及脑水含 量，口服用量范围是〇. l_500mg/kg，50、100、200mg/kg灌胃给药可明显抑制小鼠脑缺血引 起的神经功能损伤及脑梗死、降低脑水含量、缓解脑水肿现象.
[0032] 本发明涉及香豆素类化合物的制剂，每制剂单位含有l_200mg的活性化合物。
[0033] 本发明涉及香豆素类化合物的制剂，制剂类型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、 缓释胶囊剂、冻干粉针剂、注射剂等。
[0034] 在小鼠脑缺血模型中，100mg/kg的化合物FHZ-1与20mg/kg的尼莫地平效果相当。 该类化合物针对脑缺血的作用机制新颖有效，具有较好的市场应用前景。
[0035] 该类化合物针对治疗脑缺血、脑中风、脑水肿、脑梗死、神经功能损伤的作用机制 新颖有效，具有较好的市场应用前景。
[0036] 本发明的香豆素类化合物
[0037] 本发明涉及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环3位、或、和、4位被取代，7、或、和、8位 为羟基取代。
[0038]
[0039] &、或、和、R2为甲基、氯甲基、三氟甲基、乙羧基、乙酸甲酯基、乙酰基、乙羧基、丁 基、苯基、氟、氯、溴、中的任意一种或多种。
[0040] R3、或、和、心为羟基。
[0041] 本发明涉及香豆素类化合物，苯并吡喃酮环4位被三氟甲基取代，7、8位为羟基取 代。
[0042] 本发明涉及香豆素类化合物，它结构是如下任意一种或多种：
[0043]
[0044] 本发明的香豆素类化合物的催化条件的选择
[0045] 本发明采用Pechmann反应进行香豆素类化合物的合成，该反应的基本类型为连 苯三酚与乙酰乙酸乙酯衍生物在浓H 2S04、70% H2S04、TiCl4、TUD的催化条件下生成香豆素 类化合物，本发明首先比较不同的催化剂对于Pechmann反应的催化效率。
[0046] 本发明的预试验1:
[0047] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与2ml浓H2S0 4混合搅拌均勾，室 温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入30ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体化 合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶。
[0048] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与10ml70% ]^04混合搅拌均勾， 室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体 化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶。
[0049] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与lmmol TiCl4混合搅拌均勾，室 温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入10ml乙酸乙酯，过滤除去反应液中的固体， 将滤液蒸干，硅胶拌样，色谱柱分离，洗脱剂比例为石油醚：乙酸乙酯（1:1)。
[0050] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的乙酰乙酸乙酯与lmmol TUD混合搅拌均勾， 130°C熔融条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入30ml甲醇溶解反应物，硅胶拌样， 色谱柱分离，洗脱剂比例为石油醚：乙酸乙酯（1:1)。
[0051] 本发明通过比较四种不同的催化条件，比较不同的乙酰乙酸乙酯衍生物的反应条 件、后处理及目标产物的收率，结果表明70% H2S04的催化条件下具有底物适应性广、后处 理简单、收率较高等优点，因此本发明在后面的反应中采用70% H2S04作为Pechmann反应 的催化条件合成了一系列的香豆素衍生物。
[0052] 本发明的香豆素类化合物的合成与纯化
[0053] 本发明涉及香豆素类化合物的制备、后处理及纯化方法。采用连苯三酚、间苯二 酚、3-甲氧基邻羟基苯甲醛、或5-溴邻羟基苯甲醛，与乙酰乙酸乙酯衍生物、丙酮二羧酸、 或丁酰乙酸乙酯衍生物在浓H 2S04、70% H2S04、TiCl4、哌啶、TUD的催化条件下生成香豆素类 化合物。
[0054]
[0055] 4_ 三氣甲基 _7,8_ 羟基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4-trif luoromethyl-2H-chromen_2-〇ne)
[0056] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的三氟乙酰乙酸乙酯与10ml70% H2S(V?§合搅拌 均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗 涤固体化合物，将固体产物烘干，70 %乙醇/水溶液重结晶。
[0057]
[0058] 4_ 乙駿基 _7,8-羟基-苯并吡喃 _2_ 酮（7,8-dihydroxy-4_acetic ac i d-2H-chromen-2-〇ne)
[0059] 将lOmmol的连苯三酚和lOmmol的丙酮二羧酸与10ml70%职04混合搅拌均匀， 室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤洗涤固体 化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0060]
[0061] 3_ 溴 _4_ 甲基 _7,8_ 羟基-苯并吡喃 _2_ 酮（3-bromo_7,8-dihydroxy-4_methyl -2H-chromen_2-〇ne)
[0062] 将lOmmol的连苯三酚和lOmmol的2-溴乙酰乙酸乙酯与10ml70% H2S04混合搅 拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤 洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0063]
[0064] 3_ 氣-4-甲基-7-羟基-苯并吡喃-2-酮（3_f luor〇-7-hydroxy-4-methyl-2H-c hromen_2-〇ne)
[0065] 将lOmmol的间苯二酸和lOmmol的2-氟乙酰乙酸乙酯与10ml70 % H2S04混合搅 拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤 洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0066]
[0067] 3_ 氣 _4_ 甲基 _7,8_ 羟基-苯并吡喃 _2_ 酮（3_f luoro-7,8-dihydroxy-4_methy l-2H-chromen_2-〇ne)
[0068] 将lOmmol的连苯三酸和lOmmol的2-氟乙酰乙酸乙酯与10ml70 % H2S04混合搅 拌均匀，室温条件下反应约6hr，反应结束后向反应液加入20ml水，有大量固体析出，过滤 洗涤固体化合物，将固体产物烘干，70%乙醇/水溶液重结晶
[0069]