一类苯并吡喃类化合物及其应用的制作方法

本发明涉及新化合物及其抗菌应用，具体涉及一类苯并吡喃类化合物及其抗细菌生物膜的应用。

背景技术：

吡喃类化合物是一种重要的含氧杂环化合物，很多天然化合物如香豆素、黄烷、黄酮、生物碱、紫檀素等中常出现这类结构，具有广泛的特性和应用价值。吡喃类化合物中的两个刚性环结构使其在可见光区范围内具有很强的荧光性能，在荧光探针、荧光增白剂、荧光燃料，等功能材料方面应用较好。此外，此类化合物具有良好的药理活性和生物学活性，如抗氧化活性、抗凝血、抗肿瘤活性等，被广泛应用于抗凝剂、抗癌药、抗过敏药等多种药剂，具有巨大的临床应用前景。

细菌生物膜是指细菌粘附于惰性表面，通过分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的膜样聚合物。在临床，生物膜可以在生物及非生物表面附着，如肺组织、植人物、心脏瓣膜、骨骼、牙齿及各种医疗设备。在细菌生物被膜的保护下，细菌可以增强自身对抗生素、环境压力及宿主免疫系统攻击的耐受能力，使其耐药性提高10-1000倍。因此，细菌生物膜感染是临床感染迁延不愈，病原菌难以彻底清除的重要原因。然而截止目前，尚未有抗细菌生物膜药物应用于临床。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一类苯并吡喃类化合物。

所提供化合物结构式如式ⅰ所示：

式ⅰ中：r＝3-f、4-f、3,5-2f、3,4,5-3f、4-cl、3,4-2cl、3-br或4-br。

本发明的另一目的在于提供上述化合物作用于制备抗金黄色葡萄球菌生物膜制剂的应用。

本发明的化合物对金黄色葡萄球菌生物膜形成具有较强的抑制作用。

附图说明

图1为本发明的化合物9的核磁共振图谱；

图2为本发明的化合物10的核磁共振图谱；

图3为本发明的化合物11的核磁共振图谱；

图4为本发明的化合物12的核磁共振图谱；

图5为本发明的化合物13的核磁共振图谱；

图6为本发明的化合物14的核磁共振图谱；

图7为本发明的化合物15的核磁共振图谱；

图8为本发明的化合物16的核磁共振图谱；

图9为化合物对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用；

图10为化合物对金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制作用的荧光染色观察结果，其中c:空白对照、9-16分别为9-16号化合物，比例尺为20nm。

具体实施方式

本发明合成了的系列新型吡喃类化合物，并针对临床容易形成生物膜的金黄色葡萄球菌，评价化合物抑制细菌生物膜形成的活性。

本发明化合物的合成路线及方法为：

a：将适量的1,3-环己二酮，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩尔混合后加热至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加热回流3-4小时；

c：冷却后固体析出，抽滤，固体再用无水乙醇重结晶，最终得纯品。

实施例：

该实施例合成通式如式ⅱ所示的化合物：

其中：

(1)仅有苯环，即无取代基r；

(2)r＝2-no2,4-no2,2-cn,4-cn,5-cn,4-oh,4-ch3,3-f,4-f,3,5-2f,3,4,5-3f,4-cl,3,4-2cl,3-br,4-br。

合成方法为：

a：在250ml三口烧瓶中将适量的1,3-环己二酮，丙二腈和不同取代基的芳香醛按照1:1:1摩尔混合后加热至溶解；

b：加入催化量的4-二甲氨基吡啶,加热回流3-4小时；

c：冷却后固体析出，抽滤，固体再用无水乙醇重结晶，最终得纯品。

结构鉴定：

利用质谱(ms)、核磁共振波谱(nmr)、红外吸收光谱(ir)和紫外吸收光谱(uv)等有机波谱，对上述合成的系列新型吡喃类化合物进行分子量、结构和纯度等鉴定。

鉴定结果为：

化合物1：

2-amino-5-oxo-4-phenyl-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:

1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.269-7.306(t,2h),7.146-7.205(m,3h),7.019(s,2h),4.183(s,1h),2.599-2.640(q,2h),2.226-2.318(m,2h),1.876-1.988(m,2h).

化合物2：

2-amino-4-(2-nitrophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.800-7.823(q,1h),7.634-7.656(q,1h),7.374-7.451(m,2h),7.202(s,2h),4.933(s,1h),2.578-2.608(t,2h),2.133-2.255(m,2h),1.824-1.953(m,2h).

化合物3：

2-amino-4-(4-nitrophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):8.156-8.178(d,2h),7.454-7.475(d,2h),7.199(s,2h),4.366(s,1h),2.624-2.654(t,2h),2.255-2.330(m,2h),1.913-1.978(m,2h).

化合物4：

2-amino-4-(2-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.750-7.769(d,1h),7.612-7.635(q,1h),7.377-7.419(q,2h),7.191(s,2h),4.525(s,1h),2.606-2.619(d,2h),2.224-2.315(m,2h),1.906-1.983(m,2h).

化合物5：

2-amino-4-(4-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.759-7.780(d,2h),7.366-7.386(d,2h),7.159(s,2h),4.293(s,1h),2.607-2.632(t,2h),2.253-2.322(m,2h),1.907-1.970(m,2h).

化合物6：

2-amino-4-(3-cyanophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.662–7.678(d,1h),7.626(s,1h),7.509–7.525(d,2h),7.104(s,2h),4.289(s,1h),2.591–2.683(m,2h),2.228–2.311(m,2h),1.922–1.962(q,2h).

化合物7：

2-amino-4-(4-hydroxyphenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):9.263(s,1h),6.926-6.947(q,4h),6.644-6.665(q,2h),4.074(s,1h),2.573-2.606(q,2h),2.214-2.302(m,2h),1.854-1.973(m,2h).

化合物8：

2-amino-4-(4-methylphenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):6.989-7.073(m,6h),4.138(s,1h),2.585-2.623(m,2h),2.250-2.305(m,5h),1.869-1.978(m,2h).

化合物9：

2-amino-4-(3-fluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.310-7.365(m,1h),7.088(s,2h),7.008-7.049(m,2h),6.941-6.976(m,1h),4.231(s,1h),2.610-2.651(q,2h),2.270-2.322(m,2h),1.922-1.967(q,2h).

化合物10：

2-amino-4-(4-fluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.178-7.214(q,2h),7.084-7.128(t,2h),7.051(s,2h),4.210(s,1h),2.592-2.627(q,2h),2.252-2.314(m,2h),1.885-1.961(m,2h).

化合物11：

2-amino-4-(3,5-difluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.144(s,2h),7.042-7.088(m,1h),6.878-6.904(q,2h),4.267(s,1h),2.601-2.660(q,2h),2.281-2.324(m,2h),1.924-1.966(q,2h).

化合物12：

2-amino-4-(3,4,5-trifluorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.130-7.168(t,4h),4.264(s,1h),2.580-2.678(m,2h),2.272-2.317(q,2h),1.933-1.979(q,2h).

化合物13：

2-amino-4-(4-chlorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.335-7.356(d,2h),7.177-7.199(d,2h),7.081(s,2h),4.202(s,1h),2.593-2.626(t,2h),2.248-2.313(m,2h),1.875-1.980(m,2h).

化合物14：

2-amino-4-(3,4-dichlorophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.549-7.570(d,1h),7.409-7.414(d,1h),7.153-7.163(d,3h),4.249(s,1h),2.589-2.642(q,2h),2.260-2.315(m,2h),1.902-1.957(m,2h).

化合物15：

2-amino-4-(3-bromophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.388-7.409(q,1h),7.320-7.329(t,1h),7.249-7.287(t,1h),7.166-7.186(d,1h),7.116(s,2h),4.209(s,1h),2.594-2.651(m,2h),2.266-2.319(m,2h),1.907-1.963(q,2h).

化合物16：

2-amino-4-(4-bromophenyl)-5-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-4h-chromene-3-carbonitrile:1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.469-7.490(q,2h),7.120-7.141(q,2h),7.084(s,2h),4.187(s,1h),2.612-2.625(d,2h),2.247-2.313(m,2h),1.874-1.980(m,2h).

上述实施例制备的化合物对细菌生物膜作用的形态学研究：

(1)结晶紫染色实验过程如下：

a：分别从划线培养的m-h琼脂培养基上挑取不同实验菌株的单克隆菌落，接种于4ml的tsb培养基中，以220r/min，37℃的条件培养至对数生长期。

b：在96孔板每孔中加入100μl的m-h肉汤培养基，吸取100μl的菌液加入第1孔中吹打混匀后吸取100μl加入第2孔中，依次类推，最后1孔混匀后吸取100μl弃去。

c：在酶标仪上选定630nm检测，记录od630值为0.1时菌液所稀释的倍数(此时菌液浓度约为10⁸cfu/ml)，将菌液用含2％葡萄糖的tsb培养基稀释至相对应的倍数后再按1：100的比例向菌液稀释至10⁶cfu/ml。

d：向96孔板每孔分别加入tsb溶解的浓度为8μg/ml上述各化合物100μl后，加入已制备的浓度为10⁶cfu/ml的菌液100μl，取一排孔加入200μl含2％葡萄糖的tsb培养基作为空白对照，将96孔板放入37℃孵箱恒温孵育24h。

e：吸去上清，用0.01m的pbs洗三遍，每孔加入150μl甲醇固定30min，轻柔弃去甲醇，加入150μl1％的结晶紫溶液染色15min。

f：轻柔吸去结晶紫溶液，用0.01m的pbs轻洗3遍，放入烘箱烘干，每孔加入33％冰醋酸溶液150μl，使用酶标仪在630nm处测吸光度。

将没有经过化合物处理的细菌作为空白对照组(c)，和对照组相比，化合物1,2,3,4,5,6,7,8在浓度为8μg/ml时，对生物膜的形成没有抑制作用(p>0.05)。化合物9,10,11,12,13,14,15,16在浓度为8μg/ml时，对生物膜的形成具有显著的抑制作用(p<0.05)，如图9所示。

(2)荧光染色实验过程如下：

a：取指数生长期耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)usa300，用含有0.5％葡萄糖的tsb培养基稀释后接种到24孔板，每孔1ml。

b：向24孔板每孔中加入8μg/ml的化合物9,10,11,12,13,14,15和16，对照孔不加化合物，培养24h。

c：向每孔中加入10mg/ml异硫氰酸荧光素(fitc)染料孵育细菌2h,离心后弃上清液，用pbs缓冲液漂洗细菌3次。

d：荧光显微镜488mm波长处观察细菌生物膜的形态。

和空白对照组(c)相比，8μg/ml的化合物9,10,11,12,13,14,15,16能明显抑制生物膜的形成，如图10所示。