一种铬-IgA螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种铬-IgA螯合物及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] IgA主要由粘膜相关淋巴样组织产生，其中大部分是由胃肠淋巴样组织所合成，少 部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。哺乳期产妇腺组织含有大量IgA产生细胞， 这些细胞主要来自胃肠。在人类，还有少量的IgA来自骨髓。人出生后4~6月开始合成 IgA，4~12岁血清中含量达成人水平，血清型IgA总Ig的10 %左右，半衰期约5~6天。 IgA有IgAl和IgA2两个亚类。IgAl主要存在于血清中，约占血清中IgA的85%，a 1链分 子量为56kD ;IgA2主要存在于外分泌液中，少部分以血清型IgA存在，约占血清中IgA的 15%，α 2链缺乏铰链区，分子量为52kD。血清中的IgA除单体形式外还有由J链共价相连 的二聚体或三聚体等形式。分泌型IgA是由J连接的双体和分泌成分所组成，主要存在于 初乳、唾液、泪液、胃肠液、支气管分泌等外分泌液中，是粘膜局部免疫的最重要因素，分泌 型IgA通过与相应的病原微生物（如脊髓灰质炎病毒）结合，阻抑其吸附到易感细胞上，分 泌型IgA还可中和毒素如霍乱弧菌毒素和大肠杆毒素等。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染 可能与IgA合成不足有关。慢性支气管炎发作与分泌型IgA的减少也有一定关系。产妇可 通过初乳将分泌型IgA传递给婴儿，这也是一种重要的自然被动免疫。嗜酸性粒细胞、中性 粒细胞和巨噬细胞表达Fe a R，血清型单体IgA可介导调理吞噬和ADCC作用。此外，分泌 型IgA具有免疫排除功能，即分泌型IgA结合饮食中大量的可溶性抗原以及肠道正常菌群 或病原微生物所释放的热原物质，防止它们进入血液。
[0003] 络（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的熔点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪以来被广泛应用，每年 全球铬生产量高达107吨，因而铬是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铬广泛应用于 电镀、鞣革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。在美国，Cr与Cr、Cr、Pb被称为四大环境污染物。据统计，每 年有几十个亿的民众都在饮用铬污染的水源，而在加利福利亚有高达30%的水资源都已经 被铬污染，因而铬污染严重影响着人们的身体健康。
[0004]自然界中铬主要以三价和六价的形式存在，而一般认为，三价铬（Cr3+)是人类所 需的微量元素，而六价铬（Cr6+)才是明显的毒性物质。由于六价铬易通过细胞膜进入细 胞，而且可以通过一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铬的毒 性高于三价络，达10-100倍。学者认为当水中的六价铬含量超过0.05mg/L即是有毒的。六 价铬可以通过皮肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性 暴露人群主要是通过呼吸道吸入六价铬灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食 入被污染的食物、吸入等方式摄入六价铬。六价铬进入体内后，可以引发氧化应激、染色体 畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、Cr-DNA 配合物形成等），从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。不仅如此，六价铬还被认为是一 种强有力的致癌物，早在1990年国际癌症研究组织。
[0005] 铬与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。 随着对铬毒性研究的深入，人们逐渐认识到铬与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重 要的角色，被认为是了解铬的毒性机理的关键所在，因此，对铬和蛋白质相互作用的研究就 显得愈发重要。而现在关于铬与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铬之 间的关系还不清楚，因而加强对于铬与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0006] 针对铬污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铬-IgA螯合物及其制备方 法，并建立铬-IgA螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铬-IgA螯合物在评价一个 地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-IgA螯合物可以间接反映 这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铬-IgA螯合物，铬离子与 IgA通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
[0008] 本发明还提供一种上述的铬-IgA螯合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009] A)铬与IgA的螯合反应：在提纯源于人体的IgA或按照生物学方法重组的IgA中 加入铬离子进行螯合反应，得到反应溶液；
[0010] B)纯化铬-IgA螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的 IgA以及多余的铬离子，即得铬-IgA螯合物。
[0011] 其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
[0012] (1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铬-IgA螯合物 复溶；
[0013] (2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgA特 异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0014] (3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgA与 填料特异性结合；
[0015] (4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液I ;
[0016] (5)收集：收集洗脱液I ;
[0017] (6)透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0018] (7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铬特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0019] (8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；
[0020] (9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷 酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液II ;
[0021] (10)收集：收集洗脱液II ;
[0022] (11)透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三 次后，4°C透析过夜，收集样本，即得铬-IgA螯合物。
[0023] 其中，上述铬-IgA螯合物的制备方法，还包括步骤C):对铬-IgA螯合物的鉴定；
[0024] 其中，步骤C)中具体如下：
[0025] (1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0026] (2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的铬-IgA螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀， 然后加样于样品槽中；
[0027] (3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测：在胶床上找出含铬的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有铬以及检测铬的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的铬-IgA螯合物在制备检测人体内铬-IgA螯合物的试 剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的铬-IgA螯合物作为标准品的试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获IgA的物质或捕获铬的物 质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测铬-IgA螯合物的方法，以已知含量的上述的铬-IgA 螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收 光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯铬-IgA螯合物与酶联免疫结 合法、提纯铬-IgA螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯铬-IgA螯合物与电感耦合等离子体 质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
[0033] 实施本发明的铬-IgA螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
[0034] 1.本发明首次体外合成铬-IgA螯合物；
[0035] 2.本发明首次提出铬-IgA螯合物可用于制备检测血样中铬-IgA螯合物的试剂或 试剂盒中的应用。
[0036] 3.本发明建立了铬-IgA螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测铬-IgA螯合 物在评价一个地区铬污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铬-IgA螯合物 可以间接反映这个地区人群受铬污染的情况，从而间接反映这个地区铬污染程度。本发明 建立的铬-IgA螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提 尚。
【附图说明】
[0037] 图1为本发明所述的铬-IgA螯合物的非变性电泳条带图；
[0038] 图2为本发明所述的铬-IgA螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分析图。
【具体实施方式】
[0039] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0040] 本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试剂、材 料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可以通过市购方式 获得：
[0041] 磷酸盐溶液为 0· 05-0. lmol/L Na2HPO4溶液或 0· 5-lmol/L Na 2ΗΡ04溶液；
[0042] 提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0043] 胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
[0044] 捕获IgA的物质购买自艾美捷科技有限公司的型号为Abeam ab8508的兔Anti-人 类IgA H&L ;其中，本发明所述与IgA特异性结合的物质、抗IgA抗体、抗IgA抗体均为捕获 IgA的物质；
[0045] 捕获铬的物质购买自广州然科生物科技有限公司的型号为RK10641的抗铬抗体； 其中，本发明所述与铬特异性结合的物质、抗Cr抗体、抗铬抗体均为捕获铬的物质；
[0046] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0047] 底物为甲基联