较，比较出洗脱液的最适浓度及洗脱时间，具体结果参见表3。
[0223] 表3 :ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
[0224]
[0225] 从表4中我们可以发现，洗脱液中的木瓜蛋白酶的浓度与酶标抗体的浓度之比= 1:20时，即木瓜蛋白酶的浓度100ng/ml时，各组OD值均低于其他几组，说明该浓度洗脱液 洗脱效果最优（即将ELISA孔壁上结合的人IgG抗体-酶标复合物洗脱程度达到最大，因 而OD值最低）；而作用时间不管是lh、2h、3h，各组OD值变化均不大，可见随着时间的延长， 酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的情况下，延长消化时间并不能提高消化率，所以本实验中 洗脱液的作用时间为l_3h皆可。
[0226] 应用实施例1
[0227] 取采用ELISA法检测100份标本血浆中的汞-IgG螯合物，按照以下步骤进行检 测：酶联免疫法（ELISA法）检测汞-IgG螯合物，按照如下步骤检测：
[0228] 1)将抗IgG Ab包被于固相载体上：用稀释缓冲液稀释抗IgG Ab至1000000倍， 加入ELISA板微孔中，37°C水浴1小时，储存冰箱；
[0229] 2)从循环系统取全血，作待检样品，再加入甲苯，溶解细胞膜；
[0230] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加2%牛血清白 蛋白作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA 板于37°C放置1小时；
[0231] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgG螯合 物作标准品；用稀释缓冲液稀释待检样品稀释至相应倍数，即稀释20倍，加入微孔中，37°C 作用1小时；
[0232] 5)加入可以捕获汞的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗 涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释5000倍，37°C作用1小时，使抗HgAb与IgG上的金属汞 反应；
[0233] 6)酶结合物温育：移去抗汞抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀 释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37°C作用1小时，使其与酶标抗体反应；
[0234] 7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物， 37°C避光作用30分钟；
[0235] 8)终止反应：滴加终止液至每一微孔；
[0236] 9)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上分别读取待检样品和标 准品的OD值（也可不使用酶标仪，直接通过染色情况进行定性检测），检测结果如表4所 不。
[0237] 表4 :100份血样标本中汞-IgG螯合物的ELISA检测结果
[0240] 应用实施例2
[0241] 采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法（ELISA法+AAS法）检测100分标本血样中 的汞-IgG螯合物，按照如下步骤检测：
[0242] 1)将能够捕获IgG的物质，如抗IgG抗体（抗IgG Ab)包被于固相载体上：用稀 释缓冲液稀释抗IgG Ab至1000000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜18小时；
[0243] 2)从循环系统取全血，作待检样品，再加入甲苯，溶解细胞膜；
[0244] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2%牛血清 白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤 完成后，ELISA板于37°C放置1小时；
[0245] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgG螯合 物作标准品；用稀释缓冲液稀释待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0246] 5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以木瓜蛋白酶 的浓度为l〇〇ng/ml的洗脱液，洗脱1小时；
[0247] 6)检测：从ELISA微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于IgG上的萊，检测值 如表5所示。
[0248] 表5 :100份血样标本中汞-IgG螯合物的AAS检测结果
[0249]
[0250] 应用实施例3
[0251] 采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法（ELISA法+ICP-MS法）检测100 分标本血样中的汞-IgG螯合物含量，按照如下步骤检测：
[0252] 1)将能够捕获IgG的物质，如抗IgG抗体（抗IgG Ab)包被于固相载体上：用稀 释缓冲液稀释抗IgG Ab至1000000倍，加入ELISA板微孔中，4°C过夜18小时；
[0253] 2)取100份标准血样作为待检样品，再加入甲苯，溶解细胞膜；
[0254] 3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2%牛血 清白蛋白作为封闭液，37°C放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后， ELISA板于37°C放置1小时；
[0255] 4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的汞-IgG螯合 物作标准品；用稀释缓冲液稀释待检样品稀释至20倍，加入微孔中，37°C作用1小时；
[0256] 5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以木瓜蛋白酶 的浓度为l〇〇ng/ml的洗脱液，洗脱1小时；
[0257] 6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化；
[0258] 7)检测：加入过氧化氢，并且加热赶酸，并从溶液中取样，于电感耦合等离子体质 谱仪下检测螯合于IgG的汞，检测值如表6所示。
[0259] 表6 100份标本血样汞-IgG螯合物的ICP-MS检测结果
[0260]
[0261]
[0262] 对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种 相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围 之内。
【主权项】
1. 一种汞-IgG螯合物，其特征在于，汞离子与IgG通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合 而成。2. -种如权利要求1所述的汞-IgG螯合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A) 汞与IgG的螯合反应：在人源的的IgG或按照生物学方法重组的IgG中加入汞离子 进行螯合反应，得到反应溶液； B) 纯化汞-IgG螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgG以 及多余的汞离子，即得汞-IgG螯合物。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于， 所述步骤B)具体如下： (1) 溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水，使汞-IgG螯合物复 溶； (2) 平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgG特异性 结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱； (3) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)中样品，然后上柱，IgG与填料 特异性结合； (4) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0. lmol/L的磷酸盐 溶液进行洗脱； (5) 收集：收集经过步骤（4)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性； (6) 透析：将步骤（5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后， 4 °C透析过夜，收集样本； (7) 平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞 特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱； (8) 上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6)中样本，然后上柱； (9) 洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L的磷酸盐 溶液进行洗脱； (10) 收集：收集经过步骤（9)洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性； (11) 透析：将步骤（10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用CldH2O透析除盐，换水三次后， 4°C透析过夜，收集样本，即得汞-IgG螯合物。4. 根据权利要求2所述的汞-IgG螯合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤C):对 萊-IgG螯合物的鉴定； 其中，步骤C)中具体如下： (1) 制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床； (2) 加样：取步骤B)中提取纯化得到的汞-IgG螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀，然后 加样于样品槽中； (3) 电泳：连接电泳板，进行电泳； (4) 检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶，然后 再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法检测是否含有汞以及检测汞的含量。5. -种如权利要求1所述的汞-IgG螯合物在制备检测血样中汞-IgG螯合物的试剂或 试剂盒中的应用。6. -种至少包括如权利要求1所述的汞-IgG螯合物作为标准品的试剂盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液含有可捕获 IgG的蛋白或可捕获金属汞的物质。8. -种定量检测汞-IgG螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利要求1所述的 汞-IgG螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与 原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-IgG螯合物与酶 联免疫结合法、提纯汞-IgG螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯汞-IgG螯合物与电感耦合 等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
【专利摘要】本发明公开了一种汞-IgG螯合物及其制备方法和应用，该汞-IgG螯合物是汞离子与IgG通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。本发明建立了汞-IgG螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测汞-IgG螯合物在评价一个地区汞污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中汞-IgG螯合物可以间接反映这个地区人群受汞污染的情况，从而间接反映这个地区汞污染程度。本发明建立的汞-IgG螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。
【IPC分类】G01N21/31, G01N27/447, G01N33/53, G01N27/62, G01N1/28
【公开号】CN105044006
【申请号】CN201510412924
【发明人】张积仁, 阳帆, 董欣敏, 吴婧, 蔡睿, 孙遥, 赵乙木
【申请人】上海拜豪生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月14日