乳酸杆菌益生菌CGMCCNO.12422及在制备降脂药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种益生菌及其应用，属于微生物领域。

背景技术：

人体血清胆固醇含量和冠心病、动脉硬化、高脂血症等心血管疾病密切相关，高脂血症主要症状表现在血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯等含量过高。如何控制降低人体血清胆固醇水平已成为促进健康的重要问题，很多降血脂药物有很好的降脂效果，但长期服用所致的副作用也越来越多被研究证实，寻求新的副作用小，又能够调节降低血脂的研究成为新的需求。

益生菌(Probiotics)被定义为“一类活的微生物，以合适的数量被摄入后能给机体带来益处”。目前普遍认为可作为益生菌制品的细菌应具备以下条件：(1)对宿主有益；(2)无毒性作用和致病作用；(3)能在消化道内存活；(4)能适应胃酸和胆盐；(5)能在消化道表面定植；(6)能产生有用的脂类和代谢物；(7)在加工和储藏过程中能保持活性；(8)具有良好的感官特性。1963年非洲部落由于大量食用乳酸菌发酵制品而使体内血清胆固醇含量较低的发现引起了科学界对益生菌降低胆固醇功效的关注。乳酸杆菌在体外环境下降低胆固醇的机理主要包括共沉淀机制，菌体吸收和代谢机制，膜镶嵌机制。国内外已经有许多关于乳酸菌降胆固醇作用的文献报道，但具体的乳酸菌筛选指标、调节血脂的体内效果和机理等尚不明确，而且乳酸菌降胆固醇的效果还难以达到令人满意的效果。动物和植物饮食会促进不同的肠道菌群生长，本发明旨在从只摄食植物的青海野生旱獭粪便中分离筛选具有良好降胆固醇功能的乳酸菌株，并进一步开发其在制备降脂药物中的应用。

技术实现要素：

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述益生菌菌株的保藏编号为CGMCC NO.12422，保藏日期为2016年5月6日，保藏分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

本发明还提供了一种乳酸杆菌益生菌菌株，所述菌株的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了上述菌株在制备降脂药物中的应用。

本发明还提供了上述菌株在制备食品和/或保健品中的应用。

本发明还提供了含有上述菌株的组合物，所述菌株的保藏号为CGMCC NO.12422。

在一个优选的技术方案中，所述组合物被制备为胶囊、冻干粉或者菌液制剂。

本发明是从野生旱獭粪便中分离纯化得到具有益生菌特性的乳酸杆菌，实验证明分离得到的乳酸菌对动物无害，且经动物实验确证具有调节血脂的功效。CGMCC NO.12422菌株能显著降低低密度脂蛋白，总胆固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白，和辛伐他丁有相似的调节血脂功效。摄入CGMCC NO.12422菌株的大鼠体征正常，摄入四周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。

附图说明

图1.CGMCC NO.12421菌株生化鉴定结果图；

图2.CGMCC NO.12422菌株生化鉴定结果图；

图3.核心基因组系统进化树图；

图4.CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株胆盐耐受能力示意图；

图5.CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株体外降脂效果示意图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1.乳酸菌的分离、筛选和鉴定

1.乳酸杆菌的分离

1)从保菌管中取出标本100μL，加入到预装900μL无菌PBS的EP管中，依次对样本进行梯度稀释，旱獭粪便标本浓度稀释至10^-6倍；

2)取不同稀释度的样品100μL涂布于MRS培养基上，放入培养箱中；

3)在37℃，0.5％CO₂环境中培养48h；

4)取出培养皿，用无菌接种环挑取不同形态特征的菌落，转接至新的MRS固体培养基中进行纯化，37℃厌氧培养48h，连续转接3次，将纯化菌株在pH＝3.5的液体MRS中培养，筛选耐酸生长优良的菌株可用于实验或冷冻保藏。

2.菌种保藏

本实验室用含25％甘油的MRS培养基作为保菌液进行菌种的冷冻保藏，方法如下：

1)将容量为2mL的保菌管经121℃，15min高压灭菌处理后以备使用；

2)乳酸杆菌在MRS固体培养基上连续转接3次后，向培养皿上加入1.5ml的无菌保菌液；

3)用L棒对培养皿进行刮涂，使菌落充分融入保菌液中；

4)将菌液转移到保菌管中，混匀后-80℃保藏。

3.菌落外观和菌体形态观察

乳酸杆菌属兼性厌氧菌，在厌氧条件下生长良好，菌落呈乳白色、表面光滑；在有氧条件下，乳酸杆菌亦可生长，大部分菌种菌落表面较粗糙，菌落颜色多为乳白色。镜下观察乳酸杆菌细胞形态为多形性，多呈细长杆状、较粗杆状、球杆状等，排列呈栅栏状、链状等。

4.细菌总DNA的提取

将单个菌落接种于BHI培养基上，37℃厌氧过夜培养，按照细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)说明书操作，提取DNA。

5.菌株的生化鉴定方法

本研究采用法国梅里埃公司生产的“BioMerieux”细菌系统生化鉴定卡API50 CHL。

结果：根据生化鉴定，获得了一株生化特征为植物乳杆菌的菌株，菌株保藏号为CGMCC NO.12422(生化鉴定结果见图2)，发明人还同时获得了一株生化特征为发酵乳杆菌的菌株，菌株保藏编号为CGMCC NO.12421(生化鉴定结果见图1)，保藏日期为2016年5月6日，保藏分类命名为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

6.细菌通用引物16S rRNA PCR扩增

细菌16S rRNA鉴定：提取细菌基因组DNA，扩增乳酸杆菌通用引物16S rDNA PCR产物测序，序列在NCBI上进行BLAST比对，进行初步鉴定。

本实验所用的细菌16S rRNA PCR扩增的引物以及PCR反应的条件如下所述，实验全部用50μL的PCR体系。通过对待测乳酸杆菌通用引物16S rRNA PCR产物测序结果在NCBI上进行BLAST比对，鉴定。挑选具有代表性的样本PCR产物测序。测序结果根据BLAST的比对完成对乳酸杆菌的初步鉴定。结果显示CGMCC NO.12421菌株为罗氏乳杆菌(SEQ ID NO:1)，CGMCC NO.12422菌株为植物乳杆菌(SEQ ID NO:2)。

通用引物16S rRNA PCR扩增条件

引物序列：

27F， 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'

1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'

反应体系(50μl)

扩增条件

针对CGMCC NO.12421菌株的生化反应和16S rRNA序列的鉴定结果不一致，进一步做基因组测序后，对核心(core-pan)基因组做了系统进化树(参见图3)，通过系统进化树可以看出CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株与其他乳酸杆菌的进化关系，确认了16S rRNA序列的鉴定结果，CGMCC NO.12421菌株为罗氏乳杆菌，而不是生化特征相似的发酵乳杆菌。

7.菌株的耐酸、耐胆盐筛选方法

1)待活化三代的实验菌株生长饱和后，以1×10⁶或1×10⁷CFU/mL的接种量接种于pH＝2.0的MRS培养基中，放入培养箱；

2)在37℃环境中培养2h后，进行10倍梯度稀释，以适宜浓度滴种于MRS固体平板培养基中，放入培养箱；

3)经37℃培养48h后，对平皿上的菌落进行计数，计算出细菌的存活数；

4)选择耐酸效果较好的菌株接种到含有0.3％牛胆汁盐的MRS培养基中；

5)在37℃环境中培养4h后，进行10倍梯度稀释，以适宜浓度滴种于MRS固体平板培养基中，放入培养箱；

6)经37℃培养48h后，对平皿上的菌落进行计数，计算出细菌的存活数。

结果：本实验模拟人体肠道环境来考察菌株在pH＝2.0和0.3％胆盐的MRS培养基中的存活情况，来评价菌株对胃肠道的耐受能力。结果显示两株菌的耐酸和耐胆盐能力良好，和鼠李糖LGG菌株的耐酸耐胆盐功能接近(参见表1)。

表1备选菌株的耐酸、耐胆盐情况

实施例二、乳酸菌的降脂功能评价

1.降脂功能体外评价

(1)含胆固醇培养基的配置

1)含0.1％胆盐的MRS培养基：按0.1％秤取胆盐粉末，加入到400ml配置好的MRS液体培养基中，充分混匀后经121℃，15min高压蒸汽灭菌以备使用。

2)MRS—CHOL(高胆固醇MRS培养基)：精确称取胆固醇0.5g，用少量无水乙醇溶解并定容至50mL，终浓度10.0mg/mL，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，按照5％的量加入到已灭菌的MRS液体培养基(或含0.1％胆盐的MRS液体培养基)中，使MRS液体培养基中胆固醇终浓度为500μg/mL。

(2)DAOS法检测胆固醇含量

1)原理

胆固醇被氧化的同时会产生过氧化氢。这些过氧化氢会使试剂内的DAOS和4-氨基安替比林氧化，并且被过氧化物酶(HRP)冷凝，并产生一种蓝色颜料。通过与标准品进行比对，从而使样品中的总胆固醇含量可以通过吸光度来进行定量。

2)胆固醇检测试剂盒(Cholesterol E-test，Wako公司，日本)操作步骤：

1.1)标准品的稀释：胆固醇标准品需要稀释7个浓度，浓度由高到低，逐级对半稀释。取7个1.5mL的EP管，编号1-7，先往2-7号管中各加50μL的超纯水。1号管为用胆固醇标准品原液100μL(2000μg/mL)，震荡混匀后，取50μL加到2号管中，依此类推。

1.2)加样品——取稀释好标准品和被测液2μL精确加到96孔板板底，设复孔。

1.3)加显色剂——每孔加150μL配置好的显色剂溶液(将1瓶显色剂干粉加入到150mL缓冲液中，充分溶解混匀)，37℃条件下避光放置5min。

1.4)终止——5min后，将96孔板取出，用针头刺破气泡，防止影响OD值。

1.5)读数——放入酶标仪读取600nm处OD值。

(3)结果：在含胆固醇的培养基中培养24h后，三种菌株的胆固醇去除率的比较见图4。图4中，1为LGG，2为CGMCC NO.12421菌株，3为CGMCC NO.12422菌株，结果显示CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株在无胆盐条件下，降低胆固醇功能和LGG接近。在含有胆盐条件下，植物乳杆菌CGMCC NO.12422菌株降胆固醇能力高于另两个菌株。

2降脂功能体内评价

将40只约200克体重的雌性SD大鼠和40只约20克BALB/c雌性大鼠分别随机分四组，给予高脂饲料(胆固醇1％，猪油10％，0.2胆酸盐，10％蛋黄粉)共五周终止实验检测血清各项血脂水平，高脂喂食一周后一组经口给予10⁹CFU CGMCC NO.12421乳酸杆菌菌液，一组给予CGMCC NO.12422菌株,一组给予生理盐水，一组在实验终止前两周给予20mg/kg体重的辛伐他丁，观察药物或乳酸菌对脂代谢紊乱模型发生的预防干预效果。

图5为实验菌株对大鼠模型的降脂效果柱状图，其中，1为CGMCC NO.12422菌株组，2为CGMCC NO.12421菌株组，3为辛伐他丁组，对照组以PBS为对照。从图5可以看出，CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株组的低密度脂蛋白(LDL)平均分别是3.534mmol/L和3.341mmol/L，均显著低于模型对照组3.969mmol/L(p<0.05)。CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株组的高密度度脂蛋白(HDL)平均分别是1.542mmol/L和1.5761mmol/L，均显著高于模型对照组1.115mmol/L(p<0.05)。CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株组的血清总胆固醇(TG)分别是4.387mmol/L和4.390mmol/L)均显著低于模型对照组5.774mmol/L(p<0.05)。CGMCC NO.12421菌株和CGMCC NO.12422菌株组的甘油三脂(TC)平均分别是3.47mmol/L和3.288mmol/L，均显著低于模型对照组3.853mmol/L(p<0.05)。上述菌株具有显著降低总胆固醇，甘油三酯，升高高密度脂蛋白，和辛伐他丁有相似的降低血脂功效。

摄入两种乳酸菌的大鼠表现正常，摄入四周结束实验后取胃肠肝脾做病理未见异常。无菌组织做细菌检测未见乳酸菌异位定植。