专利名称：乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法
技术领域：
本发明涉及一种整合膜蛋白活性片段的检测方法，尤其涉及一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法。
背景技术：
益生菌是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物，其广泛存在于地球上的各个角落，是一种对人和动物有益的细菌，它们可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的平衡，在肠道内的黏附和定植能抑制致病菌的损伤，对于保护肠道黏膜的完整性具有重要的意义；自90年代初以来，形形色色的“益生菌”类保健品风靡了整个世界，与此同时，“益生菌”的研究业已成为国际上的热门研究课题。乳酸杆菌是益生菌中及其重要的一种，可以与靶细胞黏附，竞争抑制致病性大肠杆菌(EPEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)和侵袭性大肠杆菌(EIEC)等致病菌对人体肠道屏障功能的损害；激发继发于黏附的细胞内信号转导途径，降低肠上皮细胞(IEC)的通透性；调节人体肠道黏膜免疫功能，促进树突状细胞(DC)分化成熟，以及诱导肠道T细胞分化成熟寸。近几年来研究表明，乳酸杆菌的表面蛋白(surface layer protein, SLP)在乳酸杆菌益生作用中起着核心作用。有学者将SLP进行分离和纯化，发现表面蛋白P40和P70与乳酸杆菌类似，能增加IEC紧密连接(TJ)蛋白的表达，维持TJ的完整性，进一步研究发现其调节机制可能与促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路有关。Bernet等研究益生菌与体外培养Caco-2细胞的黏附，认为其黏附成分可能是细菌表面的不稳定蛋白质。Fujiwara 等从益生菌液上清中分离出一种分子量为52kDa的蛋白质，此种物质能抑制EPEC对人肠道上皮细胞(HIEC)的黏附。Konstantinov等在研究嗜酸性乳酸杆菌与树突状细胞相互作用时，发现其SLP能调节IL-10和IL-12的合成与分泌(Proc Natl Acad Sci U. S. A.，2008 ； 105 (49):19474-79)。我们的前期研究(BMC Microbiol，2008 ;9 :63)也发现经植物乳酸杆菌(LP)分离纯化的SLP具有生物学活性，能上调IEC表面TJ的表达，抑制EPEC对IEC的损伤作用，但其蛋白片段较大，结构域不清，作用机制尚不明，抗病能力较弱。我们通过对乳酸杆菌SLP进行筛选，质谱分析，克隆表达和反复筛选验证，发现其表层黏附蛋白为整合膜蛋白(integral membrane protein, IMP, GI :28378881 )，并且黏附区域为与表层蛋白的中间片段IMP455-755 (中华实验外科杂志，2009 ；26 (5):1626_1631)。但是对于乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的研究较少，而活性片段为具有黏附活性的微小片段(Micro Integral Membrane Protein，MIMP)，其分子较小，具有较高的效价和特异性，应用价值较大；此外，因其特有的亲疏水性结构及其所发挥的生物学效应，可以弥补乳酸杆菌易位及不耐抗生素的缺陷，有着重要的临床应用价值。因此，对乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的确认具有重要的应用价值。
本发明提供了一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段(MIMP)的检测方法，通过构建 N-末端或C-末端缺失的突变蛋白，得到6个突变蛋白；以HRP标记的黏蛋白为指标一抗， 通过Wfestern bolt (WB)检测结果与拷马斯亮蓝(Coomassiebrilliant Blue)染检测结果进行对比，进行确认MIMP。本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段(MIMP)检测方法，步骤如下
步骤1，以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入引物进行RT-PCR反应，构建出7 种PCR扩增产物；其中，所述PCR扩增产物包括IMP455-755，以及N-末端或C-末端缺失的 6 种突变蛋白 IMP455 515，IMP455^635, IMP455 575，IMP635^755, IMP575 755 和 IMP515 755 ；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下
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步骤
2，将上述PCR扩增产物进行SDS-PAGE电泳，然后以HRP标记的黏蛋白为直标一抗，进行WB 和拷马斯亮蓝染检测，将WB结果与拷马斯亮蓝染结果进行对比；在WB检测结果呈阳性反应的DNA片段中，找出与呈阴性反应DNA片段没有重复区域的DNA片段1，和完全包含呈阴性反应DNA片段的DNA片段2 ；所述DNA片段1和2的重复区域为所述整合膜蛋白活性片段。
所述N-末端或C-末端缺失的突变蛋白构建方法如下
步骤1，加入所述引物和质粒模板，进行PCR扩增反应；优选地，反应体系包括10X缓冲溶液，dNTP，引物，质粒模板，rTag聚合酶和重蒸水；
步骤2，PCR产物进行电泳分离，然后进行凝胶回收得到所述6个突变DNA和 IMP455-755 ；步骤3，加入核酸内切酶、IMP455-755分别对6个突变DNA进行酶切；然后将酶切产物与载体BL21 (DE3)按10 1比例，在连接酶的作用下进行连接；优选地，酶切反应体系包括 醋酸盐缓冲溶液，酶切产物，载体BL21 (DE3)，BSA和两种内切酶，所述两种内切酶可以是 Xho I和Hind III ；连接反应体系包括突变DNA酶切产物，IMP455-755酶切产物，DNA连接酶及其IOX缓冲溶液，所述DNA连接酶可以是T4 DNA连接酶；
步骤4，加热至65°C将连接产物灭活，用T0P10感受态细胞、无抗LB培养基以及涂有 Amp抗性的平皿进行转化；
步骤5，取所述转化产物，用Rosetta (DE3) XplyE、无抗LB培养基以及涂有Chi、Amp 抗性的平皿进一步培养；挑取菌落接种于TB培养基，IPTG进行诱导表达；离心分离后悬浮， 95°C煮20分钟，然后进行SDS-PAGE电泳纯化。所述HRP标记黏蛋白方法如下
步骤1，取黏蛋白溶解于碳酸盐缓冲液，配置成黏蛋白溶液；
步骤2，配置HRP溶液HRP溶于水中，加入过碘酸盐溶液，进行搅拌；然后于乙酸盐缓冲液中，透析；向所述透析产物中加入碳酸盐缓冲液，调节PH值至9. O 9. 5，制备出HRP溶液；优选地，所述乙酸盐缓冲溶液PH值为4. 4。步骤3，将所述黏蛋白溶液与所述HRP溶液混合，搅拌；
步骤4，向步骤3所得混合溶液中加入硼氢化钠，然后置于硼酸缓冲溶液中透析；制备出HRP标记的黏蛋白。根据所述HRP标记黏蛋白的方法，优选地，所述透析均在4°C下进行。肠道微生物生态系统数量庞大、组成复杂，其细菌数量大约10倍于人体体细胞， 与人类健康状况的维持和疾病的发生有着密切的联系。其中，益生菌在肠道内的黏附和定植对抑制病菌的定植、移位和感染，维护肠道黏膜的完整性具有特别重要的意义。乳酸杆菌是益生菌中重要的一类，其在发挥益生作用时，表面蛋白(surface layer protein , SLP) 的黏附结构起着核心作用。本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段(MIMP)的检测方法，通过 PCR扩增反应，构建了 6种N-或C-末端缺失的突变蛋白，并根据WB结果和SDS-PAGE胶电泳后拷马斯亮蓝染结果的对比发现，MIMP为IMP结构区域片段，该黏附结构区域位于菌体表面的整合膜蛋白中，为具有黏附活性的微小片段。我们研究发现=MIMP分子量为6. 95kDa, 分子式为C315H5tl2N86O87S2，等电点9. 90，共包含61个氨基酸，其中酸性氨基酸数量较多，占 13. 1%。MIMP分子小，具有较高的特异性，因其特有的亲疏水性结构及该结构所发挥的生物学效应，由于蛋白不会发生易位，也不会与抗生素作用，故可以很好弥补乳酸杆菌易位和不耐抗生素的缺陷，因此临床应用价值较大，有着广阔的医药应用前景。
图1为构建的6个突变蛋白和IMP455 755序列示意图； 图2为WB检测结果；
图3为拷马斯亮蓝染的染色结果。
具体实施例方式发明人长期研究发现，乳酸杆菌的黏附结构区域位于菌体表面的整合膜蛋白中，为具有黏附性的微小片段。原料采用植物乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum，简称LP，CGMCC No. 1258)，对本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段MIMP的检测方法具体介绍如下 乳酸杆菌(CGMCC No. 1258)表面整合膜蛋白序列(即SEQ ID No 1) 1 mktvrkiplv vwytamfvvi atitysglf1 agrtliwevd giaqhfpill efqrilqhhp 61 qqlfswswnl glgadqlttf syyvvgdpfn ylvafvsrah lewayqalil lrlyfvglaf
121Igfsrqfkfkrvsqligaltytftaytfyvgmhhpfflipmiwfpllcwaiervlrgrhw181Iplslitavvilsnfyfayllalgglvyalvrfwsrrrdhltmrsfgqlfwrllvavglg241vtmagillvptllamltatrasfnfangltsypinyyvnlpnrlltnggsvqywvtlgls301sisfiaiiytlrhfrrywvlnwvlvvmmlgillpqfaavfnvfstpsnrwllmatlvfay361atmafmdqvtaltaadlkwlagisggllviiwlingfylnirkhdiatylillaligvll421vkqslkltnrqfyvlllgivtlnlannglgwlsintnsnsteqlrqgaamkwvknyfdga481qksltttsqfyrtalapnyytmrsaesdvpmvlgthtvgsyfsvqngyvgafsqalgnse541yamnsplgsldgrttmynllgvkylfaredqlkkqalpagyevvkmktgepkifadkfiy601gmsnhtgtillksknalplvytqqhqisqrqfnrlnavdreqallqgavttqqvsgvktv661kptvtgknvaytvqadttnvldtldkviiyrnqhatgasnnaltklpadtitltpeqres721ltpatglttpsnrvlnliaanqklvqknqennadeltsmvsdvqghqipyqltiqhpkky781rntelylvldgisyrrssikhalttsqninvftarpytkvdylddvrdglkgnlsasgys841ltaqttdnltsfsqlgttnmsdyeprtsavinlgyskyarklitlnftsirslhfksakl901iavplgktyrqrtrqlqtsglkhqqvtnnqitgttltktatvlttsipystgwqlrvdgq961tvrtqvvnkgfvgakltagrhqirltyhtpglkigiwssiiggvisiliacwwglhkrvr1021 qs
1.构建N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白 1. 1.克隆 1.1.1. PCR 扩增
以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入引物进行RT-PCR反应，构建出； IMP455-755、以及N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白IMP455 515，IMP455^635, IMP455 575，IMP635^755, IMP575 755 和 IMP515 755 共 7 种 PCR 扩增产物；所述引物与 PCR 扩增产物对应关系如下
7PCR扩_产_引物 1 atcAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 引物 2: atcctcgsgCAAACTTTCTCGTTGTTCCG酬遍引物 1 atCAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC mm 2 atcctcgagAACCTGCTGCGTAGTGACTG1MP455~635引物 1 atcAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 引物 2: atcctcgagAGTTTTCATCTTAACAACCTIMP455-575引物 1 alectcgagAAGATAGAGTTCCGTATTTC 引物 2: atCAAGCt Ι IΙ CAGTTCAAAATGGTTA痛5引_ 1 atCCteeagMGATAGAGTTC CGTATTTC 引_ 2 atcAAOOTTACTOeCOAACCeAAOATTTTIWP575-755通 1 atcctcgagAAGATAGAGTTCCGTATTTC 引物 2: atcA AGCTTAGTGGTGTTAAGA CTGTCAA]Μρ 135- 55引物 1 atCAAGCTTAATACTAATTCTAATAGTAC 彌 2: atcCkgagAAGATAGAGTTCCGTATTTCIMP455-755
地，PCR扩增反应体系如下 IOX缓冲溶液10ul dNTP 2.5mM,8ul 引物 1 :10um，4ul 引物 2 :10um，4ul 质粒:50ng/ul,0. 5ul rTag聚合酶(购自TAKARA公司)2ul 加入重蒸水(ddH20)至反应体系总体积为IOOul。将上述反应体系加热至94°C预变性3分钟；然后进行热循环，热循环条件为94°C 变性30秒，迅速冷却至55°C使引物退火30秒，使引物结合到靶序列上，然后快速升温至 720C (该温度为rTag聚合酶最佳活性温度)，使引物链沿模板延伸1分钟，进行30次热循环；然后在72°C下恒温反应15分钟。1. 1. 2. PCR产物电泳，回收
按照常规方法，将PCR产物进行电泳检测。应注意的是，电泳检测应在PCR扩增反应当日进行，以免电泳检测带型不规则；可以选择10g/L琼脂糖电泳等方式进行电泳检测。经电泳检测，PCR反应完全，然后进行凝胶回收。可以选用Qiagene凝胶回收试剂盒，回收方法如下将回收产物加入到5ul醋酸钠(3M)和120ul冷的乙醇中，_20°C放置15 分钟；然后在离心机上12000rmp离心10分钟；去上清，用70%乙醇洗涤两次；室外晾干，加30ul去离子水溶解，制成DNA片段溶液。1.1.3.将回收后的PCR产物进行酶切
酶切反应所用两种内切酶优选为Hind III和Bio I。酶切反应体系如下 缓冲溶液3M，5ul
DNA片段溶液(或载体):40ul 牛血清白蛋白(BSA) 0. 5ul Hind III :2. 5ul Xho I :2. 5ul
将上述体系在37°C下反应34小时。然后在65°C下灭活10分钟。1. 1.4.将双酶切产物进行连接
将双酶切后的DNA片段与载体进行凝胶定量分析，然后进行连接，优选地，连接反应体系如下
DNA 片段15ul 载体2ul
T4 DNA连接酶lul IOX连接酶缓冲溶液2ul 在16°C下，反应过夜。1.1.5.转化
将连接产物在65°C下灭活10分钟。取IOul连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞(如Rosetta (DE3) XplyE)，在冰上孵育30分钟后，加热至40°C热激1分钟；加入无抗的LB培养基400ul，在37°C温度下保温1小时。取IOOul涂有Amp抗性的平皿，在37°C培养16小时。1.1.6.蛋白的表达与纯化
取5ul转化的Rosetta (DE3) XplyE感受态细胞，在冰上孵育30分钟，42°C热激1小时，加无抗的LB培养基400ul，37°C下保温1小时。取IOOul涂有Amp和Chl抗性的平皿， 在37°C培养16小时。挑取单菌接种于TB培养基，37°C培养2小时，然后加入Iul的IPTG(IM)诱导2小时。12000prm下离心1分钟以收集菌体，倒掉上清，用lOOulXSDS悬浮，然后95°C煮20分钟。进行SDS-PAGE电泳分离。通过上述过程构建出N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白，按照模板序列分别命名为 IMP455 515、IMP455 575、IMP455 635、IMP635 755、IMP575 755 和 IMP515 755。2.辣根过氧化酶(HRP)标记黏蛋白 2.1配制黏蛋白溶液
取黏蛋白溶解于缓冲溶液中，配制成細g/ml的黏蛋白溶液。其中，所述缓冲液优选为碳酸盐缓冲溶液，其PH值优选为9. 5。2.2.配制 HRP 溶液辣根过氧化酶(HRP)8mg溶解于2ml蒸馏水中，加入新鲜配制的过碘酸盐溶液至400ul， 室温搅拌20min ；然后置于乙酸盐缓冲溶液中，透析过夜。其中，所述过碘酸盐优选为过碘酸钠，其溶液浓度优选为0. IM ；所述乙酸盐缓冲液浓度优选为0. 001M，PH值为4. 4 ；透析温度优选为4°C。取出透析后的HRP，加入碳酸盐缓冲溶液调节PH值至9. (Γ9. 5。优选的，碳酸盐缓冲液浓度为0. 1M，PH值为9.5。2. 3进行HRP标记
将配制的HRP溶液和黏蛋白溶液按1 :1体积进行混合，室温搅拌2小时。然后加入新鲜配制的硼氢化钠缓冲溶液Gmg/L) IOOul,以去除连接反应。将混合溶液置于硼酸盐缓冲溶液中透析过夜。优选地，所述硼酸盐缓冲溶液浓度 0. 1M，PH值为7. 4 ；透析温度优选为40C。然后将标记好的黏蛋白等体积加入甘油(80%浓度)，在_20°C进行保持待用。3. Western Bolt (WB)检测和拷马斯亮蓝染检测
Western Bolt (WB)检测纯化的蛋白经^festern bolt 二抗孵育后，转印至保鲜膜上， 按每IOcm2膜加Im的ECL工作液的比例，与HRP标记的黏蛋白进行杂交，然后去除ECL工作液，进行压片或荧光成像仪检测目的蛋白。拷马斯亮蓝染检测电泳转膜后，用TBS清洗膜2次，以去除转移缓冲液和一些碎胶，拷马斯亮蓝进行染色，室温振荡3次，每次30分钟。观察结果。4.结果分析
图1为构建的6个突变蛋白和IMP455-755序列示意图。图2为WB检测结果。以HRP标记的黏蛋白作为直标一抗，对6个突变蛋白作 Western bolt (WB)检测，由图中可以看出，片段 IMP455 575、IMP455 635、IMP455 695 以及IMP515 755均呈阳性反应，而IMP635 755和IMP575 755则呈阴性反应。图3为拷马斯亮蓝染的检测结果。SDS-PAGE胶电泳后，进行拷马斯亮蓝染检测，经过对比，可以看出片段IMP455-575和IMP515-755MIMP的重复区域IMP515 575 (即图1阴影部分)为活性片段MIMP。测试结果显示MIMP包含61个氨基酸，其中酸性氨基酸数量较多，占13. 1% ；MIMP 分子量为6. 95kDa，分子式为C315H5q2N86O8A2。由于MIMP为位于菌体表面的整合膜蛋白中、具有黏附活性的微小片段，分子较小，具有较高的效价和特异性；同时还可以弥补乳酸杆菌易位和不耐抗生素的缺陷，因此具有很大的临床应用价值和前景。上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1. 一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法，其特征在于，以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入7组不同引物进行RT-PCR反应，构建出IMP455 755、以及N-末端或 C-末端缺失的 6 种突变蛋白 IMP455 515，IMP455^635, IMP455 575，IMP635^755, IMP575 755和IMP515 755共7种PCR扩增产物；具体步骤如下步骤1，加入所述引物，将所述膜蛋白进行PCR扩增反应；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下·2，对PCR扩增产物进行电泳分离，凝胶回收后得到所述6个突变DNA和IMP455-755 ；步骤3，加入核酸内切酶、IMP455-755分别对6个突变DNA进行酶切；然后将酶切产物与载体BL21 (DE3)按10 1比例，在连接酶的作用下分别进行连接；步骤4，加热至65°C将连接产物灭活，用T0P10感受态细胞、无抗LB培养基以及涂有 Amp抗性的平皿进行转化，得到转化产物；步骤5，取所述转化产物，用Rosetta (DE3) XplyE、无抗LB培养基以及涂有Chi、Amp 抗性的平皿进一步培养；挑取菌落接种于TB培养基，IPTG进行诱导表达；离心分离后悬浮， 95°C煮20分钟，然后进行SDS-PAGE电泳纯化；步骤6，将上述表达产物进行SDS-PAGE电泳，然后以HRP标记的黏蛋白为直标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，通过WB结果与拷马斯亮蓝染结果进行对比；在WB检测结果呈阳性反应的DNA片段中，找出与呈阴性反应DNA片段没有重复区域的DNA片段1，和完全包含呈阴性反应DNA片段的DNA片段2 ；所述DNA片段1和2的重复区域为所述整合膜蛋白活性片段，其中所述HRP标记粘蛋白方法如下取黏蛋白溶解于碳酸盐缓冲液，配置成黏蛋白溶液；配置HRP溶液HRP溶于水中，加入过碘酸盐溶液，进行搅拌；然后于乙酸盐缓冲液中，透析；向所述透析产物中加入碳酸盐缓冲液，调节PH值至9. 0 9. 5，制备出HRP溶液；将所述黏蛋白溶液与所述HRP溶液混合， 搅拌；向步骤3所得混合溶液中加入硼氢化钠，然后置于硼酸缓冲溶液中透析；制备出HRP 标记的黏蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增反应体系包括10X 缓冲溶液，dNTP，引物，DNA模板，rTag聚合酶和重蒸水。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切过程中，反应体系包括醋酸盐缓冲溶液，插入DNA目的片段，BSA和两种内切酶。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述两种内切酶为B10I和Hindlll。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述连接过程中，反应体系包括载体，所插入的DNA片段，DNA连接酶及其IOX缓冲溶液。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸盐缓冲溶液PH值为4.4。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述透析均在4°C下进行。
全文摘要
本发明涉及一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法，首先构建出N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白，然后以HRP标记的黏蛋白为指标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，将WB结果与拷马斯亮蓝染染色结果进行对比，从而确定活性片段在乳酸杆菌整合膜蛋白序列中的位置。
文档编号G01N33/569GK102375062SQ20101025687
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者刘志华, 秦环龙 申请人:上海市第六人民医院