编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列及其应用，涉及基因工程【技术领域】。一种编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列，所述核苷酸序列是序列表中SEQ?ID?NO:1。或者，所述核苷酸序列为在高严谨条件下与序列表中SEQ?ID?NO:1的核苷酸序列杂交且编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28。或者，所述核苷酸序列为与序列表中SEQ?ID?NO:1具有90％以上同源性且编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28。一种双峰驼形成通道的整合膜蛋白28，由如上所述核苷酸序列编码。优选的，由序列表中SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸组成；调节细胞膨胀和收缩以适应细胞间渗透性的变化。
【专利说明】编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列及其 应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程【技术领域】，特别是涉及编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28 的核苷酸序列、其编码的蛋白、及该核苷酸序列的应用。
【背景技术】
[0002] 水通道蛋白（Aquaporin，AQP)是膜内在蛋白质，形成专门输送水的穿膜通道，存 在于红细胞和肾组织中，由4个相同的亚基组成，每个亚基（28kDa)含6个穿膜α螺旋，极 大地增加膜的水通透性。从Agre等（1988)发现水通道蛋白以来，人们就对其基因结构、 基因表达调控、染色体定位、蛋白质结构、组织分布和生理功能不断进行研究，到目前为止， Preston等在哺乳动物至少发现有13种水通道蛋白，即AQP0?12。
[0003] Agre等（1988)在分离纯化红细胞膜上的Rh多肽时，发现了一个28kD的疏 水性跨膜蛋白，称为形成通道的整合膜蛋白28(channel-forminginte_gral membrane protein，CHIP28)，1991年完成了其eDNA克隆（Verkman，2003)。为进一步确定其功能，又 将其构于蛋白磷脂体内，通过活化能及渗透系数的测定及后来的抑制剂敏感性等研究，证 实其为水通道蛋白。从此确定了细胞膜上存在转运水的特异性通道蛋白，并称CHIP28为 Aquaporinl(AQP1)〇
[0004] AQP1是红细胞膜的一种主要蛋白，它可以使红细胞膨胀和收缩以适应细胞间渗透 性的变化。AQP1及它的同系物能够让水自由通过（不必结合），但是不允许离子或是其他 的小分子（包括蛋白质）通过。AQP1在质膜中以四聚体的形式存在，每个单体都由6个贯 穿膜两面的长a螺旋构成基本骨架，其间还有两个嵌入但不贯穿膜的短a螺旋。每个单体 蛋白的中空部分都形成具有高度选择性的通道，只允许水分子跨膜运输而不允许带电质子 或其他离子通过，在功能上都可以作为一个独立水通道。
[0005] 骆驼之所以能够耐渴，主要与其生理机能和组织结构有关。其中非常重要的一点 就是与骆驼的红细胞有关，除骆驼和鹿的红细胞呈卵圆形状外，人和大多数哺乳动物正常 成熟的红细胞呈双凹圆盘形，中央较薄，周缘较厚，无细胞核和细胞器，胞质内含有血红蛋 白，因而使血液呈红色。骆驼红细胞对低渗的抵抗力较强，在缺水致使血浆脱水时，红细胞 水分渗出，体积缩小，但并不显著影响红细胞膜的生物学特性，重新饮水后，红细胞膨大，又 能恢复或接近正常生理状态。
[0006] 由于骆驼红细胞同其他动物的红细胞相比有较强的抗低渗能力在沙漠中能够适 应缺水环境，这与红细胞膜的组成有很重要的关系，AQP1是红细胞膜的一独立的水通道，所 以研究骆驼的AQP1有非常重要的意义。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明实施例提供一种编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷 酸序列，即提供双峰驼AQP1基因的cDNA序列，以及由该序列编码的AQP1。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
[0009] -方面，本发明实施例提供了一种编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷 酸序列，
[0010] 所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID N0:1。优选，所述核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO: 1 第 21-839 位。
[0011] 或者，所述核苷酸序列为在高严谨条件下与序列表中SEQ ID NO: 1的核苷酸序列 杂交且编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28。
[0012] 或者，所述核苷酸序列为与序列表中SEQ ID NO: 1具有90%以上同源性且编码双 峰驼形成通道的整合膜蛋白28。
[0013] 另一方面，本发明实施例还提供一种双峰驼形成通道的整合膜蛋白28,由如上所 述核苷酸序列编码。
[0014] 在一种实施例中双峰驼形成通道的整合膜蛋白28,由序列表中SEQ ID N0:2所示 的氨基酸组成；调节细胞膨胀和收缩以适应细胞间渗透性的变化。
[0015] 或者，为序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且具有调节细胞膨胀和收缩以适应细胞间渗透性的变化功能的 衍生蛋白质。
[0016] 另一方面，本发明实施例还提供一种重组表达载体，包含如上的所述核苷酸序列， 或编码如上所述蛋白质。
[0017] 另一方面，本发明实施例还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的重 组表达载体。
[0018] 另一方面，本发明实施例还提供一种如上所述核昔酸序列在提1?动物耐渴能力中 的应用。
[0019] 另一方面，本发明实施例还提供一种获取编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28 的核苷酸序列的方法，该方法中：
[0020] PCR的正向引物为：
[0021] SEQ ID N0:3:5' -GTCTTCATCAGCATCGGTTC-3' ；反向引物为：
[0022] SEQ ID N0:4:5'-GTCGGCATCCAGGTCATACT-3'。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0024] 克隆并测序得到了双峰驼驼乳中AQP1基因的cDNA序列，参考其他八种动物的 AQP1基因序列，并对上述基因的CDS序列进行同源性比较并制作进化树，为今后研究双峰 驼AQP1提供基础资料。
[0025] 双峰驼的水通道蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼水通道蛋白序列与 其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼的输送水的穿膜通道提供实验数据，同时 对研究双峰驼及其他物种以及人类水通道蛋白的基因结构、基因表达调控、染色体定位、蛋 白质结构、组织分布和生理功能不断进行研究提供一定的理论依据，并且对膜的水通透性 的研究提供一定的生物学依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为实施例1中双峰驼AQP1基因 RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0027] 图2为不同物种AQP1氨基酸序列系统进化树；
[0028] 图3为构建系统发生树所用AQP1氨基酸同源性比较。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
[0030] 在本发明中，术语"形成通道的整合膜蛋白28"是一种水通道蛋白，英文名称为 Aquaporinl (AQP1)〇
[0031] 以下实施例中，所用百分比浓度如未特定指明，均为体积百分比浓度。
[0032] 实施例1 :双峰驼AQP1基因 cDNA序列的克隆
[0033] 1、组织分离（Isolation)
[0034] 从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻 后于-70°C保存，实验室保存准备提取组织总RNA。
[0035] 2、总 RNA 的分离（Total RNA isolation)
[0036] (1)提取RNA的准备工作
[0037] 玻璃制品用0. 1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍， 180°C烘烤4小时。
[0038] 匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC(焦碳酸二乙 酯）水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5 %的SDS (十二烷基硫酸钠） 处理。
[0039] Tip头、离心管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
[0040] 双蒸水和溶液用DEPC处理，即每100ml水或溶液加0. lmlDEPC液，室温放置过夜， 高压灭菌30分钟DEPC失活。
[0041] (2)组织总RNA提取
[0042] 取 100mg在液氮中冻存的组织样放入有 lml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15-30°C温育5分钟， 加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2-3分钟，4°C 12000g离心15 分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10 分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加 lml75v/v%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g离 心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水（RNase free)中分装，-70°C保存。
[0043] (3)组织总RNA的鉴定
[0044] 通过分光光度计测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下： 电泳槽用RNA清洗液（100mM NaOH，ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反复 冲洗数次后倒入lXTBE(Tris硼酸）待用，琼脂糖凝胶用1XTBE配制。在10ul上样缓冲 液（2XTBE，13%菲可，0. 1%溴酚兰，7M尿素）中加入lul以上组织总RNA，65°C变性10分 钟后立即放入冰水中2 - 3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。
[0045] 3.全长 cDNA 的克隆（Cloning of Full-length cDNA)
[0046] (1)引物设计及合成
[0047] 参考人、鼠、牛等物种的AQP1基因的同源序列设计引物，用于以双峰驼肝脏组织 中总RNA为模板的PCR扩增，以获得双峰驼AQP1基因 cDNA序列。引物用Primer Premier5. 0 自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID N0:3(正向）和SEQ ID N0:4(反向），序列信息如下：
[0048] SEQ ID N0:3(正向）：5, -GTCTTCATCAGCATCGGTTC-3，
[0049] SEQ ID N0:4(反向）：5, -GTCGGCATCCAGGTCATACT-3'
[0050] (2) RT-PCR 扩增
[0051] 按大连宝生物反转录试剂盒（BcaBEST RNA PCR Kit Ver. 1. 1)要求进行反转录。 反转录反应液组成：10ul2XBcalst Buffer，4ul25Mm MgS04，lul dNTP Mixture，0.5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer,lul RNA Sample，1.5ul Rnase Free dH20,总体系为 20ul。反转录反应条件：65°C1 分钟，30°C5 分钟（15分钟-30分钟内匀速升温），65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件： 97 °C变性5分钟；95 °C 30秒一55 °C 30秒一72 °C 1分钟，如此进行30次循环；72 °C延伸10 分钟，4 °C保存。
[0052] (3)克隆和测序
[0053] PCR扩增片段的回收。片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过 程如下：尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5ml离心管中。按每100mg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加 S1液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，10000g离心 1分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul W1液，10000g离心15秒。倒掉管中液体， 在吸附柱中加入500ul W1液，静置1分钟后，10000g离心15秒，倒掉管中液体。离心1分 钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置1分钟 后，10000g离心1分钟，离心管中液体即为回收的DNA。
[0054] 回收片段同T载体的连接。连接用TaKaRa pMD18-T Vector试剂盒，操作过程 如下：在离心管中制备下列连接反应液：pMD 18-T Vector(50ng/ul)0.5ul，DNA20_40ng， Solutionl 5ul，加 dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟（过夜也可以），产物 用于转化感受态细胞。
[0055] 质粒的转化。从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。100ul感受态细 胞加入10ul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加 400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取100ul铺于LB平板上，平板含0. 1 % (V/V)的 氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。
[0056] 转化菌落的PCR鉴定与培养。用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸 取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液（不含模板）的离心管中晃动，使单菌落充当模 板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker-起进行琼脂糖凝胶电泳（结 果如附图1所示），鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在 平板上的与之对应的单菌落，放入40ml LB液体培养基中，先在液体中加入0.1% (V/V)的 青霉素钠（l〇〇mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
[0057] 质粒的回收。质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下：将转 化培养的菌液加入1. 5ml离心管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不 够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温 和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸 附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中 加入500ulWl，静置1分钟，离心15秒，倒掉液体。离心1分钟，将吸附柱放入一个干净的 1. 5ml离心管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置1分钟后，离心1分钟，离心管中液 体即为回收的质粒。
[0058] 质粒的酶切鉴定。为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切 法鉴定。具体操作如下：根据TaKaRa pMD18-T Vector图，选择内切酶Bam Η I和Hin d III， 保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系：Bam Η I lul，Hin d III lul， 10XK Buffer2ul，DNA彡lul，加 dH20至20ul。30°C反应3小时，琼脂糖凝胶电泳检测。
[0059] 重组质粒的测序。取20ul重组质粒于离心管中，封口膜密封，交生物技术公司测 序。
[0060] 实施例2 :双峰驼AQP1基因编码序列同源性比较和系统发生树构建
[0061] 1、双峰驼AQP1的序列信息与生物信息学分析
[0062] 本发明新的双峰驼AQP1⑶S的长度为850bp，其中21-23位为起始密码子ATG， 837-839位为终止密码子TGA，21-839位为编码蛋白质区域（CDS)，详细序列见SEQ ID NO: 1。根据全长⑶S推导出双峰驼AQP1的氨基酸序列，共271个氨基酸残基，详见SEQ ID N0:2,在线预测（ http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)结果显示，其分子量为 16458. 94道尔顿，等电点（pi)为5.00。
[0063] 2、AQP1基因编码序列系统发生树构建
[0064] 在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条AQP1基因的编码蛋白序列，加 上本发明获得的SEQ ID N0. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树（见附 图2)。结果显示：双峰驼AQP1基因同猪的亲缘关系最近，且与其他物种也有较高的同源性， 间接证明了该序列为双峰驼的AQP1序列。
[0065] 双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的AQP1基因编码氨基酸序列同源 性比较结果见附图3。其氨基酸序列与人、鼠、牛等物种AQP1氨基酸序列具有很高的相似性 (见表1)，其它比较数据见表2和表3。
[0066] 表1 :双峰驼AQP1氨基酸序列与人、鼠、牛等物种AQP1氨基酸序列相似性
[0067]
【权利要求】
1. 一种编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸 序列是序列表中SEQ ID N0:1。
2. -种编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸 序列在高严谨条件下与权利要求1所述的核苷酸序列杂交且编码双峰驼形成通道的整合 膜蛋白28。
3. -种编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸 序列与权利要求1所述的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码双峰驼形成通道的整合 膜蛋白28。
4. 一种双峰驼形成通道的整合膜蛋白28,由权利要求1-3任一项所述核苷酸序列编 码。
5. 根据权利要求4所述的双峰驼形成通道的整合膜蛋白28,其特征在于，由序列表中 SEQ ID NO:2所示的氨基酸组成；调节细胞膨胀和收缩以适应细胞间渗透性的变化。
6. -种双峰驼形成通道的整合膜蛋白28,其特征在于，为序列表中SEQ ID NO:2所示 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加获得且具有调节细 胞膨胀和收缩以适应细胞间渗透性的变化功能的衍生蛋白质。
7. -种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述核苷酸序列，或编码 权利要求4-6任一项所述蛋白质。
8. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的重组表达载体。
9. 一种权利要求1-3任一项所述核苷酸序列在提高动物耐渴能力中的应用。
10. 获取编码双峰驼形成通道的整合膜蛋白28的核苷酸序列的方法，其特征在于： PCR的正向引物为： SEQ ID NO:3:5' -GTCTTCATCAGCATCGGTTC-3' ；反向引物为： SEQ ID NO:4:5' -GTCGGCATCCAGGTCATACT-3'。
【文档编号】C07K14/47GK104152460SQ201410410810
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】陈钢粮, 吉日木图 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司