一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用的制作方法

专利名称：：一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用。
背景技术：
：自1944年青霉素等抗生素投入使用以来，使细菌，尤其是威胁生命的致病菌，如金葡球菌、肺炎链球菌、绿脓杆菌、结核杆菌等已对其产生了耐药性。据美国疾病控制中心(CDC)历年发表的有关报告预测，再过10年至20年，这些抗生素将可能完全失效。上述抗生素主要通过抑制细胞壁合成、抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质代谢与合成途径来达到抗菌目的。然而这些抗菌方式容易诱导细菌发生突变而产生耐药性。因此人们一直在致力于开发新型的抗生素，模仿同种异株细菌之间互相杀伤的工作方式来开发新型抗生素是比较有前途的方向之一，自然界中有不少细菌毒素直接在细菌胞膜上形成离子通道来杀死细菌。其模式标本就是大肠杆菌分泌的一种细菌毒素一大肠菌素。其中大肠菌素Ia自1952年被Jacob发现之后，经过数代人的努力，1996年终于揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上所形成离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构(Qiuetal，Majortmnsmemebranemovementsooeiatedwithcolicinlachannelgating.J.Gen.Physiology,107:313-328(1996))，为在分子7K平上设计和制备新型的抗菌素奠定了理论基础。最近，人们发现细菌分泌信号传导多肽到体外，这些多肽能够自动寻找同种细菌胞膜上的相应受体，与受体结合后将信息传入细菌。这些传导多肽多由数个至十数个氨基酸组成，比如金黄色葡萄球菌的信息素AgrD,就是一个8肽(Jietal,Celldensitycontrolofstaphyliccocalvirulencemediatedbyanoctapeptidepheromone.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:12055-12059(1995))。如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗生素原型，但野生型大肠菌素只能作用于同种异株的大肠杆菌，因此必须改变它的靶向性，才能使大肠菌素转而攻击其它种的致病菌，且野生型大肠菌素的肽链中存在容易引起超敏反应的氨基酸残基；超敏反应指异常的、过高的免疫应答。如能利用致病菌特有的信息素作为诱导物来改变大肠菌素的靶向性，应该是一种理想的抗生素开发方向，目前本发明的发明人获得将大肠杆菌信息素基因与白色链珠球菌信息素基因连接起来表达抗真菌多肽的专利权，专利号为ZL200510020219.9，但由于大肠菌素肽链中存在某些可能引起超敏反应的结构域，因此有必要改进。
发明内容本发明针对上述技术的缺陷与本领域仍然存在的空白，提供一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用。该抗生素的肽链含有大肠菌素，能特异地杀灭该抗生素特异性结合的致病菌而不会伤害人体正常细胞，克服了大肠菌素引起超敏反应的缺陷。一种大肠菌素变构多肽，由能形成离子通道结构域的野生型大肠菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道结构域的肽链突变了氨基酸残基G11A、H22R、A26G、V31L和H40K而获得。所述大肠菌素变构多肽，由野生型大肠菌素Ia变构而来，具有SeqlDN0.36所示的氨基酸序列。编码所述的大肠菌素变构多肽的核苷酸序列。所述的大肠菌素变构多肽在制备抗菌药物中的应用。一种新型抗生素，由上述大肠菌素变构多肽和金黄色葡萄球菌信息素AgrDI、AgrDII、AgrDIII、AgrDIV或表皮葡萄球菌信息素的肽链线性连接而成。所述大肠菌素变构多肽由野生型大肠菌素Ia变构而来，所述金黄色葡萄球菌信息素AgrDI、AgrDII、AgrDIII、AgrDIV或表皮葡萄球菌信息素的氨基端连接在所述大肠菌素变构多肽的羧基端，连接肽分别具有如SeqlDN0.13、SeqlDN0.15、S叫IDN0.17、SeqlDN0.19、SeqIDNO.21所示的氨基酸序列。所述金黄色葡萄球菌信息素AgrDI的羧基端连接在大肠菌素变构多肽的氨基端，具有如SeqIDNO.23所示的氨基酸序列。编码上述新型抗生素的核苷酸序列。具有如SeqlDN0.12、SeqlDN0.14、SeqlDN0.16、SeqIDNO.l8、SeqIDNO.20或S叫IDN0.22所示。包含上述核苷酸序列的重组质粒。上述新型抗生素在制备抗菌药物中的应用。一种新型抗生素的制备方法是指将权利要求9所述的重组质粒转入表达系统中表达，分离纯化表达的多肽而获得新型抗生素。所述表达系统指大肠杆菌工程菌菌株￡工0//81^21。本发明为预防临床使用中大肠菌素氨基端的某些肽链片段可能引起宿主的超敏反应，事先选择性的突变了这些肽链片段中的氨基酸残基G11A、H22R、A26G、V31L和H40K，降低可能的致敏原性，从而获得了编码大肠菌素变构多肽的核苷酸序列和该变构多肽的氨基酸序列，变构多肽仍然保留了大肠菌素离子通道活性，能够将同种异株的大肠杆菌杀死。这些野生型大肠菌素可以选自能形成离子通道结构域的大肠菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道结构域。本发明优选突变大肠菌素Ia，将Ia的变构多肽Ia'与其他致病菌信息素的肽链可操作地连接，如图7所示，连接肽可以改变Ia'的靶向性，使该连接肽链攻击其能够识别的其他致病菌菌株，从而获得各种新型的抗生素，其机理是可与靶致病菌胞膜受体结合的信息素作为诱导物诱导变构多肽到达靶致病菌胞膜附近，然后变构多肽在靶致病菌胞膜上形成致死性离子通道，使靶致病菌胞内容物泄漏而致靶致病菌死亡，从而达到杀菌的目的。本发明优选将Ia'与金黄色葡萄球菌信息素AgrDI、AgrDII、AgrD、AgrDIV以及表皮葡萄球菌信息素的肽链线性连接，当金黄色葡萄球菌信息素AgrDI、AgrDII、AgrD、AgrDIV以及表皮葡萄球菌信息素的肽链连接在大肠菌素变构多肽Ia'的羧基端，如图15所示，获得5种新型抗生素，由实施例4、5、6、7及表1、表2的数据可以看出，本发明获得的这5种新型抗生素的杀菌效果；当葡萄球菌信息素连接在大肠菌素变构多肽Ia'的第1号氨基酸位置即其实密码子编码的甲硫氨酸之后获得的5种连接肽链中，经实验发现仅AgrDI与Ia'的连接肽链如图6所示，对绿脓杆菌有抗菌作用，其核苷酸序列如SeqIDNO23所示。所述编码本发明获得的新型抗生素的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码本发明获得的大肠菌素变构多肽、葡萄球菌新型抗生素、绿脓杆菌新型抗生素的氨基酸序列的核苷酸序列是可以调整的，即只要是编码本发明新型抗生素的核苷酸序列都属于本发明的保护范围。将编码本发明的新型抗生素的核苷酸序列载入骨架质粒中可获得能在宿主中表达本发明新型抗生素的重组质粒。本发明中，构建重组质粒的原始质粒为Promega公司的pSELECTTM-l质粒，向其中装载大肠菌素变构多肽基因和immunity蛋白基因；按照Strategene公司药箱操作将编码葡萄球菌信息素的核苷酸序列经双链寡聚核苷酸点突变技术(QdCkChangTMKit，Strategene公司)插入到变构多肽基因的氨基端或羧基端得到本发明的重组质粒；本发明优选将5种葡萄球菌信息素基因序列插入到Ia'基因的626号氨基酸(即羧基端)位置之后或第1号氨基酸位置即起始密码子之后而获得本发明如图16所示的六种能表达抗生素的重组质粒。本发明所指的新型抗生素的制备方法是指将上述重组质粒转染入大肠杆菌工程菌而获得可产生新型抗生素的转基因大肠杆菌，分离纯化转基因大肠杆菌表达的目的蛋白即可得到本发明的新型抗生素。本发明优选大肠杆菌工程菌菌株BL-21。本发明获得的新型抗生素可在制备治疗或者预防大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌感染的药中应用。可以通过将本发明中获得的新型抗生素的多肽添加到药学上可接受的载体或者赋形剂或可选的其它成分而制成临床上适用的药物组合物。本发明的新型抗生素相较于现用抗生素的优点在于，其不会诱导细菌产生传统的耐药性而且克服了以大肠菌素为抗生素有效结构的重组抗生素会引起超敏反应的缺点，如实施例10的实验结果显示，与野生型大肠菌素采用野生型大肠菌素构建的重组抗生素相比，本发明的大肠菌素变构多肽及新型抗生素免疫小鼠的血清效价要比前者低两个数量级；由于细菌可通过突变产生B—内酰胺酶、减少摄入、改变药物作用位点等方式改变其细胞壁结构、蛋白质和核酸代谢等来对传统抗生素产生耐药性，但是细菌却较难以通过突变来修复被本发明新型抗生素所造成的胞膜完整性的缺损，因为这种缺损往往在数分钟内即可导致细菌死亡，本发明的新型抗生素对于耐药性菌具有其它抗生素难以企及的杀灭作用；实验数据显示，本发明获得的新型抗生素不仅具有极好的杀菌效果，且PMC-SA1，PMC-SA两种抗生素对于实验鼠表现出良好的体内保护作用。图l.重组质粒pBHC-SAl的结构；含有金黄色葡萄球菌信息素AgrDI的基因和大肠菌素变构多肽Ia'基因。图2.重组质粒pBHC-SA2的结构；含有金黄色葡萄球菌信息素AgrDII的基因和大肠菌素变构多肽Ia'的基因。图3.重组质粒pBHC-SA3的结构；含有金黄色葡萄球菌信息素AgrDIII的基因和大肠菌素变构多肽Ia'的基因。图4.重组质粒pBHC-SA4的结构；含有金黄色葡萄球菌信息素AgrDIV的基因和大肠菌素变构多肽Ia'的基因。图5重组质粒pBHC-SE的结构；含有表皮葡萄球菌信息素的基因和大肠菌素变构多肽Ia'的基因。图6重组质粒pBHC-PA的结构含有金黄色葡萄球菌信息素AgrDI的基因和大肠菌素变构多肽Ia'的基因，其中AgrDI基因连接在大肠菌素变构多肽Ia'的第1位氨基酸的密码子位置；图7新型抗生素的结构；T，R，分别是大肠菌素变构多肽Ia'位于氨基端的两个信号识别结构域，其中T结构域的部分氨基酸残基已被突变；channel-forming,是大肠菌素变构多肽Ia'位于羧基端的能成离子通道的结构域，信息素连接在大肠菌素变构多肽Ia，的羧基端。图8为本发明新型抗生素PMC-SA1对青霉素敏感金葡菌的抑制实验结果。图中Com对照；PEN:青霉素；COL:野生型大肠菌素；BL21:无质粒的BL-21工程菌所产蛋白；FP:大肠菌素Ia羧基端连接其它8肽的重组蛋白；PMC:PMC-SA1。各实验组的药物用量均为100ng/ml。图9为PMC-SA1对耐甲氧西林金葡菌(ATCCBAA-42)杀菌效果的透射电镜观察(放大25，000倍)。Con,对照组，菌形态正常；Oxa,苯唑西林500ug/ml处理一个半小时，菌形态有变化，但菌体仍完整；PMC:PMC-SAl10ug/ml处理半小时，菌破裂，内容物泄漏。图10为本发明新型抗生素PMC-SAl和PMC-SE对表皮葡萄球菌的抑制作用。表皮葡萄球菌的生长仅被PMC-SA1部分抑制，却被PMC-SE完全抑制。Con:对照组；PEN:青霉素；PMC:PMC-SAl;PMC-SE:PMC-SE新型抗生素，药物浓度2ug/ml。图ll为本发明各种新型抗生素对耐甲氧西林金葡菌(ATCCBAA-42)的生长抑制作用。表明耐甲氧西林金葡菌的生长几乎不能被苯唑西林所抑制，PMC-PA的抑菌效果最差，抑制效果最好的是PMC-SAl,其次是PMC-SE和PMC-SA4，PMC-SA2和PMC-SA3再次之；图中Con:对照；Oxa:苯唑西林；SA1:PMC陽SA1;SA2:PMC-SA2;SA3:PMC-SA3;SA4:PMC-SA4;SE:PMC-SE和PA:PMC-PA，药物浓度5ug/ml;图12为本发明新型抗生素PMC-SAl和PMC-PA对绿脓杆菌的抑制作用。绿脓杆菌的生长仅被PMC-PA完全抑制。Con:对照组；COL:野生型大肠菌素；PMC1:PMC-SAl新型抗生素；PMC2:PMC-PA，药物浓度5ug/ml。图13为新型抗生素的多重耐药绿脓杆菌感染动物体内保护试验结果之小鼠生存曲线。1)对照组，2)哌拉西林50mg/kg组，3)阿米卡星15mg/kg组，4)头孢他啶50mg/kg组，5)左氧氟沙星5mg/kg组，6)PMC-PA5mg/kg组。具体实施例方式结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述具体说明本发明。实施例1表达新型抗生素的质粒的构建和新型抗生素制备原始质粒为装载了大肠菌素变构多肽Ia'和immunity蛋白基因的pSELECTTM-l质粒(8.3kb)(购于Promega公司)。经双链寡聚核苷酸点突变技术(QuickChangeKit，Strategene公司)将编码葡萄球菌信息素基因序列如SEQIDNOl、3、5、7、9所示，分别插入到大肠菌素变构多肽Ia'基因的626号氨基酸位置之后，获得制备新型抗生素的一系列重组质粒，pBHC-SAl、pBHC-SA2、pBHC-SA3pBHC-SA4、pBHC-SE，如图1图5所示，以及金黄7色葡萄球菌信息素AgrDI的基因序列如SEQIDNO1所示连接在变构多肽la'基因的第1号氨基酸位置前而获得重组质粒pBHC-PA如图6所示。重组质粒转染入五.co/ZBL-21工程菌制备新型抗生素。突变程序按StrategeneQuickChangeSiteDirectedMutagenesisKit(catalog#200518)药箱手册进行1.准备点突变反应物5ullOXbuffer2ul(10ng)装载了大肠菌素变构多肽和immunity蛋白基因的原始质粒pSELECTTM-l。1.25ul(125ng)设计的5'—3'寡聚核苷酸引物(见SEQIDN02434偶数序列)1.25ul(125ng)设计的3，一5'寡聚核苷酸引物(见SEQIDN02535奇数序列)1uldNTP双蒸水50ul1ulpfU(除质粒、引物和双蒸水外，均为药箱所备试剂)2.进行PCR扩增，扩增条件变性95。C,35秒，退火53。C，70秒，延伸68。C，17分，共20个循环；3.加入Dpn1内切酶1ul消化母体DNA链后(37°C,1小时)，取1ul反应物与XLl-Blue感受态细胞50ul冰孵30分钟，热冲击42°C，45秒，再置入冰中2分钟；4.加入NZY培基0.5ml,220rpm,37°(:摇菌1小时，取50—100ul反应物铺板(LB培基加1%琼脂，加50ug/ml氨苄青霉素，37"C过夜)；5.18小时后挑菌，提取质粒后测序确定突变成功；6.将突变质粒100ng与制备的BL-21工程菌感受态细胞40ul冰孵5分钟，热冲击42°C,30秒，再置入冰中2分钟，加入SOC培基160ul，220rpm,37°C摇菌1小时后铺板(LB培基加1%琼脂，加50ug/ml氨苄青霉素，37。C过夜)，挑取单克隆菌落大量增菌；7.大量增菌，8—10升FB培基，250rpm，37。C，3—4小时；加入IPTG，250rpm，28°C再生长4小时；4°C，6000g,20分钟离心沉淀菌体，取4°<:，50mM硼酸缓冲液(pH9.0,2mMEDTA)80-100ml悬浮菌体，加入PMSF50ug后超声破碎菌体(4。C，400W，l分钟，重复4一5次，间歇2—3分钟确保菌液温度)，高速离心沉淀破碎的菌体(4°C，75，000g，90分钟)，取上清加入硫酸链霉素500万单位沉淀DNA(4。C搅拌1小时)，10000g,4°C，10分钟离心沉淀后，取上清装入分子量15,000透析袋于4。C，50mM硼8酸缓冲液10升透析过夜后，再次lO,OOOg,4°C，IO分钟离心沉淀，取上清上样于CM离子交换柱，充分冲洗后，0.3MNaCl+50mM硼酸缓冲液洗脱即可得到所制备的新型抗生素。对应于以上6种重组质粒，可分别获得PMC-SA1、PMC-SA2、PMC-SA3、PMC-SA4、PMC-SE以及PMC-PA六种新型抗生素。制备上述6种突变质粒的信息素基因所设计的寡聚核苷酸序列分别如下pBHC-SAl5'—3'(SEQIDN0.24)gcgaataagttctggggtattTATTCCACCTGTGATTTTATAATGtaaataaaatataagacaggc3，—5'(SEQIDN0.25)gcctgtcttatattttatttaCATTATAAAATCACAGGTGGAATAaataccccagaacttattcgcpBHC-SA25，—3，(SEQIDN0.26)gcgaataagttctggggtattGGAGTTAACGCATGTTCTTCCCTGTTTtaaataaaatataagacaggc3，—5，(SEQIDN0.27)gcctgtcttatattttatttaAAACAGGGAAGAACATGCGTTAACTCCaataccccagaacttattcgcpBHC-SA35，—3'(SEQIDN0.28)gcgaataagttctggggtattTATATAAACTGTGATTTTCTTCTGtaaataaaatataagacaggc3,—5，(SEQIDN0.29)gcctgtcttatattttatttaCAGAAGAAAATCACAGTTTATATAaataccccagaacttattcgcpBHC-SA45，_3，(SEQIDNO.30)gcgaataagttctggggtattTATTCCACCTGTTACTTTATAATGtaaataaaatataagacaggc3，一5，(SEQIDN0.31)gcctgtcttatattttatttaCATTATAAAGTAACAGGTGGAATAaataccccagaacttattcgcpBHC-PA5'—3，(SEQIDN0.32)ggatgaaggagataccgaatgTATTCCACCTGTGATTTTATAATGtctgaccctgtacgtattaca3，一5，(SEQIDN0.33)gtgaatacgtacagggtcagaCATTATAAAATCACAGGTGGAATAcatteggtatctcctteatecpBHC-SE5'—3'(SEQIDNO.34)gcgaataagttctggggtattGATTCCGTTTGTGCATCCTATTTTtaaataaaatataagacaggc3，—5，(SEQIDN0.35)gectgtcttatattttatttaAAAATAGGATGCACAAACGGAATCaataccccagaacttattcgc实施例2新型抗生素对青霉素敏感金葡菌的抑制作用细菌为美国标准菌株，ATCC25923青霉素敏感金葡菌，菌液2微升(105CFU/ml)加入1%胰蛋白胨，l%NaCl,0.5%酵母，0.5%葡萄糖，0.1%K2HP04的培养液IO毫升中，共准备6组，第一组加入0.3MNaCl+50mM硼酸缓冲液(即新型抗生素、野生型大肠菌素Ia和无质粒的BL-21工程菌所产蛋白的空白保存液，量与实验组中加入的新型抗生素液体量相同)作为对照，第二组加入100ng/ml青霉素G钠，第三组加入100ng/ml野生型大肠菌素la,第四组加入100ng/ml无质粒的BL-21工程菌所产蛋白，第五组加入100ng/ml大肠菌素Ia羧基端连接其它8肽的重组蛋白，第六组加入100ng/mlPMC-SA1新型抗生素。上述各组液体分别置于IOO毫升三角烧瓶中，200rpm,37°C生长，每小时采样100微升加入96孔酶表板中经分光光度计(A595nm)比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较新型抗生素的抑菌效力，结果如图8所示，显示青霉素敏感金葡菌只能被青霉素和PMC-SA1所抑制。实施例3新型抗生素PMC-SA1对耐甲氧西林金葡菌(ATCCBAA-42)杀菌效果的透射电镜观察(1%磷钨酸染色，放大25，000倍)。培养液1%胰蛋白胨，l%NaCl,0.5%酵母，0.5%葡萄糖，0.1%K2HPO4.Con:对照组，菌加入前述培养液中和适量0.3MNaCl+50mM硼酸缓冲液中200rpm,37T生长2小时后，菌形态仍然正常；Oxa:菌加入前述培养液和苯唑西林500ug/ml中200rpm，37。C生长1.5小时后，菌的颜色和形态有变化，但菌体仍完整；PMC:菌加入前述培养液中和PMC-SA110ug/ml处理半小时后，菌破裂，内容物泄漏。如图9所示，新型抗生素与青霉素的杀菌机制完全不同，500ug/ml苯唑西林可损伤耐甲氧西林金葡菌，而10ug/mlPMC-SAl可有效杀伤耐甲氧西林金葡菌，苯唑西林分子(分子量450左右)和PMC-SA1分子(分子量70,000左右)的分子量相差160倍，本实施例中苯唑西林和PMC-SA1的使用浓度相差50倍，因此PMC-SA1在本实施例中表现出来的10抗菌效力比苯唑西林强八千倍左右。实施例4新型抗生素PMC-SA1的体外抗菌活性一、实验材料(1)药物*PMC-SA1:规格1.5mg/ml*注射用头孢唑林钠规格0.5g/瓶，华北制药股份有限公司生产。*注射用青霉素钠规格80万单位/瓶，华北制药股份有限公司生产。注射用氨苄西林钠规格lg/瓶，华北制药股份有限公司生产。*注射用苯唑西林钠规格0.5g/瓶，华北制药股份有限生产。*万古霉素规格2.5mg/ml，*以上样品用无菌水溶解稀释，药物终浓度为128mg/L、64mg/L、32mg/L、16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.06mg/L、0.03mg/L、0.015mg/L。(2)细菌临床分离菌株所有菌种在收集分离的单位(华西医科大学检验科细菌室)均经鉴定。金黄色葡萄菌28株(MRSA菌株10株，MSSA菌株18株)、表皮葡萄球菌IO株(MRSA菌株5株，MSSE菌株5株)、肠球菌5株、大肠杆菌10株、鲍曼不动杆菌10株，共63株。标准质控菌株:青霉素敏感金黄色葡萄球菌ATCC25923、耐青霉素金黄色葡萄球菌ATCC29213，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCCBAA-42,耐万古霉素肠球菌ATCC700802。(3)培养基*MH肉汤培养基称取25g加100ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116°C，20分钟。MH固体培养基称取36g，加1000m蒸馏水，高压灭菌，116°C，20分钟，用于革兰氏阳性、阴性需氧菌的药敏试验。*肠球菌用血培养基，即在MH培养基中加5-10%脱纤维兔血配置而成，5%(202中37'C培养24小时。二、试验方法1、最低抑菌浓度MIC的测定采用琼脂二倍稀释法测定PMC-SA1的最低抑菌浓度(MIC)。用多点接种仪(DeneleyA400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点含菌量为105CFU/ml，37'C孵育18-24小时观察结果，以无细菌生长平皿培养基中所含药物的最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。三、结果实验结果见表1表1PMC-SA的体外抗菌活性比较菌株(株数)药物MIC50(mg/L)MIC90(mg/L)M工C范围(mg/L)金黄色葡萄球PMC-SA18—16>16<0.25-64菌头孢唑林>128>1281-128MRSA菌株青霉素128>1281-128氨苄西林16320.06-64苯唑西林>128>1280.5128万古霉素0.2510.0042金黄色葡萄球PMC-SA10.5160.06>32菌MSSA菌株头孢唑林0.1250.25<0.0150.5青霉素8640.125〉128氨苄西林0.251<0.0150.025苯唑西林0.1250.125〈0.0150.25万古霉素0.510.031表皮葡萄球菌PMC-SA1>64>641>128MRSE菌株头孢唑林32〉1280.06~>128青霉素〉128>1288~>128氨苄西林16640.0664苯唑西林64〉1280.5>128万古霉素0.510.252表皮葡萄球菌PMC-SA11320.2564MSSE菌株头孢唑林0.030.5<0.1250.5青霉素4320.125128氨苄西林0.030.25〈0.1250.25苯唑西林0.030.125〈0.1250.25万古霉素0.50.50,060.5肠球菌PMC-SA1>64>648〉128头孢唑林32〉12832>128青霉素326432〉128氨节西林0.5160.2516苯唑西林16〉1288〉128万古霉素120.550大肠杆菌PMC-SA116〉324〉16头孢唑林>128〉128128>128青霉素>128〉128〉128氨节西林>128〉12816〉128苯唑西林〉128>128〉128万古霉素>128>128〉128鲍曼不动杆菌PMC-SA132〉640.5〉64头孢唑林>128〉128〉128青霉素>128>128〉128氨苄西林>128>12816~〉128苯唑西林>128>128〉128万古霉素>128>128128〉128实施例5新型抗生素的对金葡菌、肠球菌和大肠杆菌感染动物体内保护试验一.实验材料(1).药物使用药物同实施例4。以上样品用无菌水溶解稀释，药物注射浓度为10mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg。(2)细菌耐甲氧西林金葡菌ATCCBAA-42、耐青霉素金葡菌ATCC29213、耐万古霉素肠球菌ATCC700802、大肠杆菌(临床分离氨苄青霉素敏感株，32033)。二.实验方法昆明小鼠340只，雌雄各半，体重1520克，随机分组为腹腔分别注射金黄色葡萄球菌ATCCBAA-42、ATCC29213、肠球菌ATCC700802和大肠杆菌(临床分离氨苄青霉素敏感株，32033)四个大组，其中PMC-SA1、青霉素、氨苄西林、头孢唑林和万古霉素实验组分13别为每组小鼠5只，对照组每组小鼠10只。腹腔注射致死剂量的细菌后，各药物试验组小鼠分别自静脉注射10mg、5mg、2.5mg/kg剂量的药物一次，每24小时观察结果，连续观察7-14天，以小鼠死亡为阳性结果。三.结果5mg、3mg和lmg药物剂量组结果显示，PMC-SA1组小鼠存活率在3个剂量组中与万古霉素组小鼠存活率始终保持了恒定的差距，因此在体内试验中PMC-SA1对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的治疗效果远优于万古霉素。这可能是PMC-SA1既杀菌又抑制细菌毒素分泌的双重效果所致。因而该药在临床应用时可能具有其他抗生素无法比拟的治疗效果，其他各抗生素小鼠死亡率>80%，己不具备可比性；对照组于48小时内全部死亡。试验结果见表2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</table由实施例4和5的表1和表2结果可以看出:1.金葡球菌(MRSA)体外抗菌活性比较苯唑西林MIC90测定值比PMC-SA1测定值大8倍。PMC-SA1分子量(70,0000)是万古霉素分子量(1,400)的49倍，苯唑西林分子量(450)的155倍。按单位体积内相同药物分子数标定，则PMC-SA1对金葡球菌(MRSA)体外抗菌活性相当于万古霉素对MRSA体外抗菌活性的3倍，相当于苯唑西林对MRSA体外抗菌活性的l，240倍。2.PMC-SA1感染小鼠体内保护实验中，最小剂药量(2.5mg/kg)条件下PMC-SA1组的死亡率最低(40%),其他各组死亡率分别为青霉素组60%，氨苄西林组100%，万古霉素60%，对照组100%。该结果显示PMC-SA1的保护率最高(60°/。)；青霉素和万古霉素的保护率次之(鄉)。实施例6新型抗生素对表皮葡萄球菌生长的影响细菌为购自中国菌种保存中心(国家医药管理局生物制品检定所，北京天坛)的表皮葡萄球菌标准菌株，编号26069，菌液3微升(106CFU/ml级菌量)加入1%蛋白胨，l%NaCl，0.5%酵母。0.5%葡萄糖，0.1%K2HPO4的培养液10ml中，共准备4组，第一组加入0.3MNaCI+50mM硼酸缓冲液(量与实验组中抗菌多肽液体量相同)作为对照，第二组加入2ng/ml青霉素G钠，余各实验组加入2ng/mlPMC-SA1和PMC-SE(保存液为0.3MNaCl+50mM硼酸缓沖液)。上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm，37。C生长，每小时采样10(^1加入96孔酶标板中经分光光度计(A595nm)比色测定细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较抗菌多肽的抑菌效力，结果见图IO，由图中可见，表皮葡萄球菌的生长可被抗金葡多肽部分抑制，可被抗表葡多肽有效的抑制。实施例7几种新型抗生素抑菌效果的比较以下试验比较了本发明制备的6种抗菌多肽的抑菌活性，细菌为美国标准菌株，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCCBAA-42，菌液5微升(106CFU/ml级菌量)加入1%蛋白胨，l%NaCl，0,5°/。酵母。0.5%葡萄糖，1%K2HP04的培养液10m中，共准备8组，第一组加入0.3MnaCl+50mM硼酸缓冲液(量与实验组中抗菌多肽液体量相同)作为对照，第二组加入5ng/ml青霉素G钠，余各组加入PMC-SA1、PMC-SA2、PMC-SA3、PMC-SA4、PMC-SE和PMC-PA(保存液为0.3MNaCH50mM硼酸缓冲液)。上述各组液体置于100/nl三角烧瓶中，200rpm，37。C生长，每小时采样10(H4加入96孔酶标板中经分光光度计(A595raO比色测试细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较抗菌多肽的抑菌能力，结果见图11。结果显示，耐甲氧西林金葡菌的生长几乎不能被苯哔西林抑制，PMC-PA的抑菌效果最差，抑制效果最好的是PMC-SA1，其次是PMC-SE和PMC-SA4，PMC-SA2和PMC-SA3再次之。实施例8新型抗生素对绿脓杆菌生长的影响细菌为购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的绿脓杆菌标准菌株(ATCC27853)，菌液5微升(106CFU/ml级菌量)加入MH培养液10ml中，共准备7组，第一组加入0.3MNaCl+50mM硼酸缓冲液(量与实验组中抗菌多肽液体量相同)作为对照，第二组加入5ng/ml野生型大肠菌素Ia,第三组加入5pg/mlPMC-SA1，第四组加入5pg/mlPMC-PA。上述各组液体置于100ml三角烧瓶中，200rpm,37。C生长，每小时采样100nl加入96孔酶标板中经分光光度计(A595nm)比色测定细菌生长浊度，画出细菌生长曲线来比较抗菌多肽的抑菌效力，结果见图12。由图中可见，实验中绿脓杆菌的生长仅被PMC-PA完全抑制，而野生型大肠菌素Ia和PMC-SA1均不能有效抑制绿脓杆菌的生长。实施例9新型抗生素的多重耐药绿脓杆菌感染动物体内保护试验一.实验材料(1)药物PMC-PA、哌拉西林、阿米卡星、头孢他啶、左氧氟沙星。(2)细菌多重耐药绿脓杆菌(临床分离株13280，华西医科大学检验科细菌室)。二.实验方法昆明小鼠60只，雌雄各半，体重1520克，随机分组，腹腔注射多重耐药绿脓杆菌，其中PMC-PA、哌拉西林、阿米卡星、头孢他啶和左氧氟沙星实验组分别为每组小鼠10只，对照组每组小鼠IO只。腹腔注射致死剂量的细菌后，各药物试验组小鼠分别自静脉注射上述药物一次，每24小时观察结果，连续10天，以小鼠死亡为阳性结果。三结果如图13所示小鼠生存曲线，腹腔注射致死剂量多重耐药绿脓杆菌后，(1)，对照组在2天内全部死亡，(2)，哌拉西林50mg/kg组在3天内全部死亡，(3)，阿米卡星15mg/kg组在164天内全部死亡，(4)，头孢他啶50mg/kg组的10天存活率为20%，(5)，左氧氟沙星5mg/kg组的10天存活率为40%，(6)PMC-PA5mg/kg组的10天存活率为100%。结果显示，对多重耐药绿脓杆菌致死性感染，本发明的新型抗生素PMC-PA表现出了所试现用抗生素无法比拟的抗菌活性。实施例10大肠菌素变构多肽的免疫效果观察取大肠菌素Ia变构多肽、实施例1中PMC-SA1及野生型大肠菌素Ia、发明人前期发明的抗金葡菌多肽(ZL01128836.1)各一份免疫小鼠上述各蛋白与佐剂混合后，基础量和追加量为腹腔注射每只50(0.5ml)1次。间隔两周，免疫5针。ELISA间接法检测小鼠血清效价(肖毅等，抗金葡菌多肽单克隆抗体制备及初歩测定，陕西医学杂志，35(1):6—7，32(2006))。野生型大肠菌素la以及抗金葡菌多肽(ZL01128836.1)所免疫小鼠血清效价为10-4至10-s,而大肠菌素Ia变构多肽以及本发明PMC-SA1所免疫小鼠血清效价为l(T2至IO-3。因此大肠菌素Ia变构多肽以及本发明的新型抗生素PMC-SA1造成宿主致敏反应的可能性要比野生型大肠菌素la以及抗金葡菌多肽造成宿主致敏反应的可能性低一至两个数量级。以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。附录序列表SEQIDNO,1编码金黄色葡萄球菌信息素AgrDI的基因片段tattccacctgtgattttataatgSEQIDNO.2金黄色葡萄球菌信息素AgrDI的人工序列TyxSerThrCysAspPhelieMetSEQIDNO.3<213>编码金黄色葡萄球菌信息素AgrDII的基因片段ggagttaacgcatgttcttccctgtttSEQIDNO.4金黄色葡萄球菌信息素AgrDII的人工序列GlyValAsnAlaCysSerSerLeuPheSEQIDNO.5编码金黄色葡萄球菌信息素AgrDIII的基因片段tatataaactgtgattttcttctgSEQIDNO.6金黄色葡萄球菌信息素AgrDIII的人.丁.序列TyrlieAsnCysAspPheLeuLeuSEQIDNO.7编码金黄色葡萄球菌信息素AgrDIV的基因片段tattccGcctgttactttataatgSEQIDNO.8金黄色葡萄球菌信息素AgrDlV的人工序列TyrSerThrCysTyrPhelieMetSEQIDNO9编码表皮葡萄球菌信息素的基因片段gattccgtttgtgcatcctattttSEQIDNO10表皮葡萄球菌信息素的人T序列AspSerValCysAlaSerTyrPheSEQIDNO11大肠菌素Ia变构多肽基因序列atgtctgaccctgtacgtattacaaatcccggca犯gaaaggtaccccgcgttg￡l"tg3"ttaaaascacgccgcctctctggccggaascgctgagagaatgagagccggatcgttaatcggetgatatgcc"tgg犯aa犯gggcagca.gaaeggaategectgcatggagcccc犯cccgtcagcgcgcaeggegattgecagatgccgcaeggattccgtgctgtUgcaacaggctgattgetgaatatC犯C3犯tCacaaccagcgctggeict3t3ggtg3,g3ettgatgecactcagtgccaagaaaacaggaaatcagtttcaggcta朋gcgggctg織gagtctgtgatatgeaggaacacgg组gattaacaeggecgcctgacggattctattgtcagtcatcgaaacgeaatataaatttataag犯caaatgaatataegtaaatgaactgaacagaaaaatagg犯g犯aat11aacaaaaaagctgtctgaaatttacaagtgatatttatUccttcggg犯gtgatatcgc卿3卿gtgc朋gggaatgatattacatactga犯tctgatgetgataaascggcagegagegcagaagcccttgcccagggecattcegtaatgeaca犯3cg3tatgtgagcggttaaccgtgcatctg犯tgactgctgaagttcscctctgctgcaaaagcatCC3gCtttCCggcaacgaaaacgt犯tgttaattaatgeatatategtettcttgctgacgcagcagaatcgctggggtactcaaccctccacgtgtcgaaacaaaaccatctggggcggaatgag犯taagegtactgaaaagatgaaaacacactgaacgacaggagttcagactcctgeeggatatgacgccctccgtetcttegtatatctccccgaaggatgegeagsaegcagaaaaggtattctggacacccggttcttgatgcacaacaggctcagaggcccggaataaactttaaccagagctgasc犯cagtttcccctgaaaaattcccgatccgagat"ttgeeggtaeaacctgaattatcttctgagcgg犯tccggtggtgacagagctgaatggg自agttacggaatctgeggtaaatteggegcaaatgacgetcttaatgeggcatcaatcagaagatagcgaegcaattaatttcac肌cgctgagcagttagecagagagaagaggcattaa犯acgtaaaagatcgtgcagegattgeaatctgaacagattcagtcgtggatcactgagtttggtaatgattcagattgtctttaaaaaacgagtggcacagcgtacagccgg犯犯aacactccgtgcaggcagaggetgeatacaggaggecaggcaagaaggeegttgtcagagccgtctgctccagttcagtggetgaegcaaggggcgttcagataaaaatcccattccggtggatgtggaagcaaagattgcctgttgaagagagttcctg2427242424tgaaaagtaccgcagcccttgggactgggaggctgtccgg601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201380144。150015601620acagagaactggcgtcctctttttgttaaatcatagcaggcaatgccgca1740acggctcttgtggcactggtcttcagtattettaceggaagcgcUtaggcattateggg1800tatggtttactgstggctgtcaccggtgcgctgattgatgaatcgcttgtgg朋aaagcgI860aataagttctgggg城t1878SEQIDNO:12编码新型抗生素PMC-SA1的基因序列atgtctgaccctgtacg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cgggcagcagacacggastgacagggccatttcagag780gcccggaataaactcagttcagtgacgg犯tcgcttaacacggcccgtaatgcattaacc840agagctg犯caacagctgacgcaacagaaaaacacgcctgacggc犯aacgatag"tttcc900cctga冊aattcccggggcgttcatcaacaaatcattctattgttgtgagcggtgatccg960agatttgccggtacgataaaaatc8c朋ccagcgcagtcatcgataaccgtgcaaacctg1020犯ttatcttctgagccattccggtctggactataaacgcaatattctgaatgaccgg肌t鹏ccggtggtgac卿ggatgtggaaggtgacaagaaaatttatastgctgaagttgctgaa1140tgggataagttacggcaaagattgcttgatgccagaaataaaatcacctctgctgaatct，gcggt犯attcggcgagaaat犯CCtC3gtgccagaacaaatgagcaaaagcatgcaaat1260gacgctcttaatgccctgttgtaaccagctttccggcatc，tagcgga柳caggatgaactg犯ggc犯cga犯gacgca，attaatttcacaacagagttcctgaaatcagtttcagaaaaatatggtgcaaaagctgag1440cagttagccagagagatggcCgggC8ggCtaaagggaagaaaatacgtaatgttg肌gag1500cgtatgaaaagtaccgggctaaa犯attaatgcaaaagat1560cgtgcagcgattgccgcagcCCUg3gtCtgtgaagctgtctgatatatcgtctaatctg1620aacagattcsgtcggggactgggatatgcaggaa犯tttacaagtcttgctgactggatc鹏actgagtttggt,gctgtCCgg8C柳gaactggcgtcctctttttgttaa肌cagaa1740accatcatagcaggcaatgccgcaacggctcttgtggcactggtcttcagtattcttacc1800ggaagcgctttsggcattatcgggtatggtttactgatggctgtcsccggtgcgctgatt1860gatgaatcgcttgtgg肌犯agcg犯t犯gttctggggtaU1902SEQIDNO,23新型抗生素PMC-SA的肽链TyrSerThrCysAspPhelieMetSerAspProValArglieThrAsnProAlaAlaGluSerLeuGlyTyrAspSerAspGlyArgGlulieMetGlyValAsplieTyrLeuAsnProProArgValAspValPheLysGlyThrProProAlaTrpSerSerPheGlyAsnLysThrlieTrpGlyGlyAsnGluTrpValAspAspSerProThrArgSerAsplieGlu匕ysArgAspLysGlulieThrAlaTyrLysAsnThrLeuSerAlaGinGinLysGluAsnGluAsnLysArgThrGluAlaGlyLysArgLeuSerAlaAlalieAlaAlaArgGluLysAspGluAsnThrLeuLysThrLeuArgAlaGlyAsnAlaAspAlaAlaAsplieThrArgGinGluPheArgLeuLeuGinAlaGluLeuArgGiuTyrGlyPheArgThrGlulieAlaGlyTyrAspAlaLeuArgLeuHisThrGluSerArgMetAspSerLeuArglieSerProArgGluAlaArgAlaGlu匕ysArgGinLysAspAlaGinAsnAlaAspMetLeuAlaGluTyrGluArgArg匕ysGlyLeuSerGluLeuGluLysAsnGlyGlyAlaAlaAlaGinGinAlaArgLeuLeuGlyGinGinThrlieSerGluAlaArgAsnLysLeuSerSerValThrAlaArgAsnAlaLeuThrArgAlaGluGin匕ysAsnThrProAspGlyLysThrlieValSerGlyArgSerSerThrAsnHisSerlieValValPheAlaGlyThrlieLyslieThrThrSerAlaAlaAsnLeuAsnTyrLeu乙euSerHisSerGlyAsnliel>euAsnAspArgAsnProValValThrAspLysLyslieTyrAsnAlaGluValAlaGluGinArgLeuLeuAspAlaArgAsnLyslieThrValAsnSerAlaArgAsnAsnLeuSerAlaArgHisAlaAsnAspAlaLeuAsnAlaLeuLeuLysArgAsnGinLeuSerGlylieAsnGinLyslieLysGinAspGluLeuLysAlaThr匕ysAspAlaGluPheLeuLysSerValSerGluLys丁yrGlyLeuAlaArgGluMetAlaGlyGinAla匕ysGlyValGluGluAlaLeuLysThrTyrGluLysTyrLysLyslieAsnAlaLysAspArgAlaAlalieSerValLysLeuSerAsplieSerSerAsnLeuGlyLeuGlyTyrAlaGly匕ysPheThrSerLeuGluPheGlyLysAlaValArgThrGluAsnTrpLysThrGluThrlielieAlaGlyAsnAlaAlaLeuValPheSerlieLeuThrGlySerAlaLeuGlyLeuLeuMetAlaValThrGlyAlaLeulieGluLysAlaAsnLysPheTrpGlylieSEQIDNO.24金黄色葡萄球菌信息素AgrDI基因的5'引物gcgaataagttctggggtatUattccacctgtgattttaacaggcSEQIDNO.25金黄色葡萄球茵信息素AgrDI基因的3'引物gcctgtcttatattttatttacattataaaatcacaggtgattcgcSEQIDNO.26金黄色葡萄球菌信息素AgrDII基因的5'引物gcgaataagttctggggtattggagttaacgcatgttcttaagacaggcSEQIDNO.27金黄色葡萄球菌信息素AgrDII基因的3'引物gcctgtcttatattttatttaaaacagggaagaacatgcgcttattcgcSEQIDNO.28金黄色葡萄球菌信息素AgrD11I基因的5'引物gcgaataagttctggggtatttatataaactgtgattttcacaggcSEQIDNO.29金黄色葡萄球菌信息素AgrD11I基因的3'引物gcctgtcttatattttatttacagaag犯aatcacagtttattcgcSEQIDNO.30金黄色葡萄球菌信息素AgrDIV基因5'引物gcg组aagttctggggtatttattccacctgttacttta濃ggc卿IDNO.31金黄色葡萄球菌信息素AgrDIV基因3'引物gcctgtcttatattttatttacattataaagtaacaggtgLeuPheAlaAspAlaSerLeulieGluGinAspLysLysAlaAlalieLeuAspThrArgLeuAlaValLeuAspArgAsnAspArgAlaThrGluSerLeuAsnGinI,euThrGinGinProGluLysPheProSerGlyAspProArgVallieAspAsnArgLeuAsp丁yr匕ysArgGluAspValGluGlyTrpAsp匕ysLeuArgSerAlaGluSerAlaThrAsnGluGinLysGluLysGluAsnlieAlaGluGluLysArglieAsnPheThrThrAlaLysAlaGluGinLysLyslieArgAsnArgAlaAsplieAsnAlaAlaAlaLeuGluAsnArgPheSerArgAlaAspTrplieThrArgProLeuPheValThrAlaLeuValAlaGlylielieGlyTyrAspGluSerLeuValtaatgtaaataaaatataag6066gaataaataccccagaactt6066ccctgtttta犯ta貼atat6069ttaactccaataccccagaa6069ttctgtaaataaaatataag6066atataaataccccagaactt6066taatgtaaataaaatataag6066gaataaataccccagaactt6026attcgc66SEQIDNO.32用于制备绿脓杆菌抗生素的金黄色葡萄球菌信息素AgrDI基因的5'引物ggatgaaggagataccgaatgtattccacctgtgattttataatgtctgaccctgtacgt603ttaca66SEQIDNO.33<2L3>用于制备绿脓杆菌抗生素的金黄色葡萄球菌信息素AgrDI基因的3'引物gtgaatfcicgtacagggtcagacattataaaatcacaggtggaatacattcggtatctcct60tcatcc66SEQIDNO.34表皮葡萄球菌信息素基因的5'引物gcgaataagttctggggtattgattccg"tgtgcatcctatttttaaataaaatataag60acaggcSEQIDNO.35〈表皮葡萄球菌信息素基因的3'引物gcctgtcttatattttatttaaaaataggatgcacaaacgattcgcSEQIDNO.36大肠杆菌Ia变构多肽序列SerAspProValArglieThrAsnProAlaAlaAspSerAspGlyArgGlulieMetGlyValAspProArgValAspValPheLysGlyThrProProGlyAsnLysThrlieTrpGlyGlyAsnGluTrpThrArgSerAsplieGluLysArgAspLysGlugastcsataccccag貼cttGluSerLeuGlyTyrlieTyrLeuAsnProAlaTrpSerSerPheValAspAspSerProlieThrAlaTyrLysAsnThrLeuSerAlaGinGinLysGluAsnGluAsnLysArgThrGluAlaGlyLysArgLeuSerAlaAlalieAlaAlaArgGluLysAspGluAsnThrLeuLysThrl>euArgAlaGlyAsnAlaAspAlaAlaAsplieThrArgGinGluPheArgLeuLeuGinAlaGluLeuArgGluTyrGlyPheArgThrGlulieAlaGlyTyrAspAlaLeuArgLeuHisThrGluSerArgMetLeuPheAlaAspAlaAspSerLeuArglieSerProArgGluAlaArgSerLeulieGluGinAlaGluLysArgGinlysAspAlaGinAsnAlaAspLysLysAlaAlaAspMetLeuAlaGluTyrGluArgArgLysGlylieLeuAspThrArgLeuSerGluLeuGluLysAsnGlyGlyAlaAlaLeuAlaValLeuAspAlaGinGinAlaArgLeuLeuGlyGinGinThrArgAsnAspArgAlalieSerGluAlaArgAsnLysLeuSerSerValThrGluSerLeuAsnThrAlaArgAsnAlaLeuThrArgAlaGluGinGinLeuThrGinGinLysAsnThrProAspGlyLysThrlieValSerProGlu匕ysPheProGlyArgSerSerThrAsnHisSerlieValValSerGlyAspProArgPheAlaGlyThrlieLyslieThrThrSerAlaVallieAspAsnArgAlaAsnLeuAsnTyrLeuleuSerHisSerGlyLeuAspTyrLysArgAsnlieLeuAsnAspArgAsnProValValThrGluAspValGluGlyAspLys匕yslieTyrAsnAlaGluValAlaGluTrpAsp匕ysLeuArgGinArgLeuLeuAspAlaArgAsnLyslieThrSerAlaGluSerAlaValAsnSerAlaArgAsnAsnLeuSerAlaArgThrAsnGluGinLysHisAlaAsnAspAlaLeuAsnAlaLeuleuLysGluLysGluAsnlieArgAsnGinLeuSerGlylieAsnGinLyslieAlaGluGluLysArgLysGinAspGluLeuLysAlaThrLysAspAlalieAsnPheThrThrGluPheLeuLysSerValSerGluLysTyrGlyAlaLysAlaGluGinLeuAlaArgGluMetAlaGlyGinAlaLysGlyLysLyslieArgAsnValGluGluAlaLeuLysThrTyrGluLysTyrArgAlaAsplieAsnLysLyslieAsnAlaLysAspArgAlaAlalieAlaAlaAlaLeuGluSerValLysLeuSerAsplieSerSerAsnLeuAsnArgPheSerArgGlyLeuGlyTyrAlaGly匕ysPheThrSerLeuAlaAspTrplieThrGluPheGlyLysAlaValArgThrGluAsnTrpArgProLeuPheValLysThrGluThrlielieAlaGlyAsnAlaAlaThrAlaLeuValAlaLeuValPheSerlieLeuThrGlySerAlaLeuGlylielieGlyTyrGlyLeuLeuMetAlaValThrGlyAlaLeulieAspGluSerLeuValGluLysAlaAsnLysPheTrpGlylie66606权利要求1.一种大肠菌素变构多肽，由能形成离子通道结构域的野生型大肠菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道结构域的肽链突变了氨基酸残基G11A、H22R、A26G、V31L和H40K而获得。2.根据权利要求1所述的大肠菌素变构多肽，由野生型大肠菌素Ia变构而来，具有SeqIDN0.36所示的氨基酸序列。3.编码权利要求1或2所述的大肠菌素变构多肽的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，如SeqIDNO.U所示。5.权利要求1或2所述的大肠菌素变构多肽在制备抗菌药物中的应用。6.—种新型抗生素，由权利要求1或2所述的大肠菌素变构多肽和金黄色葡萄球菌信息素AgrDI、AgrDII、AgrDIII、AgrDIV或表皮葡萄球菌信息素的肽链线性连接而成。7.根据权利要求6所述的新型抗生素，所述金黄色葡萄球菌信息素AgrDI、AgrDII、AgrDIII、AgrDIV或表皮葡萄球菌信息素的氨基端连接在所述大肠菌素变构多肽的羧基端，连接肽分别具有如SeqlDN0.13、SeqlDN0.15、SeqlDN0.17、SeqIDN0.19、SeqIDNa21所示的氨基酸序列。8.根据权利要求6所述的新型抗生素，所述金黄色葡萄球菌信息素AgrDI的羧基端连接在大肠菌素变构多肽的氨基端，具有如SeqIDNO.23所示的氨基酸序列。9.编码权利要求6至8任一所述的新型抗生素的核苷酸序列。10.根据权利要求9所述的核苷酸序列，如SeqlDN0.12、SeqlDNCU4、SeqlDN0.16、SeqIDN0.18、SeqIDNO.20或SeqIDN0.22所示。11.包含权利要求9或10所述的核苷酸序列的重组质粒。12.权利要求6至8任一所述新型抗生素在制备抗菌药物中的应用。13.—种新型抗生素的制备方法是指将权利要求11所述的重组质粒转入表达系统中表达，分离纯化表达的多肽而获得新型抗生素。14.根据权利要求13所述的制备方法，所述表达系统指大肠杆菌工程菌菌株￡.^81^-21。全文摘要本发明涉及“一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用”，属于生物医药领域，包括大肠菌素变构多肽与葡萄球菌信息素肽链，能特异地杀灭该抗生素特异性结合的致病菌而不会伤害人体正常细胞，大肠菌素变构多肽与葡萄球菌信息素线性联接，产生了抗金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及绿脓杆菌的新型抗生素，抗菌效果是传统抗生素的千倍以上，而且不易产生耐药性，同时该新型抗生素克服了野生型大肠菌素使人体产生超敏反应的缺陷，使用起来更安全。文档编号C07K14/195GK101643501SQ20091015756公开日2010年2月10日申请日期2009年7月14日优先权日2008年11月7日发明者丘小庆申请人:畿晋庆三联(北京)生物技术有限公司