瘟病毒株的核苷酸序列,由这些序列编码的多肽及其在诊断和预防瘟病毒感染中的应用的制作方法

专利名称：：瘟病毒株的核苷酸序列,由这些序列编码的多肽及其在诊断和预防瘟病毒感染中的应用的制作方法瘟病毒株的核苷酸序列，由这些序列编码的多肽及其在诊断和预防瘟病毒感染中的应用本申请是申请日为1995年6月16日、申请号为95193665.4、发明名称为"瘟病毒株的核苷酸序列，由这些序列编码的多肽及其在诊断和预防瘟病毒感染中的应用"的中国专利申请的分案申请。发明领域本发明公开了构建c病毒株(一种典型猪瘟病毒疫苗株)基因组的全长DNA拷贝，并转录其RNA的方法，所述RNA在转染于细胞后导致合成感染性C病毒株的病毒。本发明还包括衍生自C株(瘟病毒)的疫苗，和抗瘟病毒的亚单位疫苗，以及有关瘟病毒感染的诊断手段和方法。本发明进一步提供了用竞争试验检测样品中免疫活性物质的方法。发明背景典型猪瘟(CSF)或猪瘟有较高传染性，常常是猪的致死病，该病特点是发热和出血，而且能形成急性或慢性病程(Vanorrschot，1986，猪瘟，P.289—300.《猪疾病》，衣阿华州立大学出版社，Ames)。在好几个欧洲国家及其他国家周期性地发生该病的流行，能导致很大的经济损失。用典型猪瘟病毒(CSFV)的减毒活疫苗株，即"中国"株(C-銜接种猪，可以保护猪以抗CSF(TerpstraandWensvoort，1988，Vet.Microbiol16:123-128)。用常规疫苗(C株是其中之一)接种猪的主要弊端是，这些被接种过的猪不能与被CSFV野生株感染的猪从血清学上区分开来。然而C株仍被认为是最有效且安全的活疫苗之一。给C株附加一个(血清学)标记物将带来极大好处并将改进疫苗。CSFV是黄病毒科瘟病毒属的一个成员(Francki，丄Betal.，1991，黄病毒科p.223-233，病毒分类国际会议第5次报告ArchivVirolSuppl.2，SpringerVeriag，维也纳).瘟病毒属中与CSFV在结构上，抗原性和遗传上均非常相关的另两个成员是，主要感染牛的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和主要感染羊的边界病毒毒(BDV)(MoennigandPlagemann，1992，高级病毒研究41:53-98;Moormanneta1.，1990，病毒学177:184-198;Bechereta1.,1994，病毒学198:^24-551)瘟病毒属的基因组由一个约l2.5kb的正链RNA分子组成(Renard等，1985，DNA4:429-438;Moormann和Hu1st1988，病毒研究11:281-291'Bechereta1.，1994，病毒学198-524-551)。而几种非致细胞病变性BVDV病毒株的正链RNA基因组可能大得多(Meyerseta1.,1991,病毒学180:602-616;Meyersetal.,1992，病毒学l91:368國386;Ol等，1992，病毒学189:285-292)带有正链RNA基因组的病毒的一个固有特点是它们的基因组RNA有传染性，即将这种RN八转染人能支躺毒复制的细胞就能产生感染性病毒。正如我们所预料的，瘟病毒属的基因组(病毒性)RNA也有传染性(Moenn.igandPIagemann,1992,Adv.高级病毒研究41:53-98)0近几年来重组DNA技术已能在体外转录克隆的DNA。这种可能性为在体外从正链RNA病毒基因组的DNA拷贝合成感染性RNA开辟了一条道路。众所周知在分子工程领域内，DNA比RNA更易通过定点突变来进行操作。因此，这种技术产生合成的感染性RNA的应用能大大促进对正链RNA病毒的诸如复制、毒力、致病性、RNA重组、载体开发，以及抗病毒策略的研究。然而，该技术的应用可能带来严重问题，这些问题的特性已由Boyer和Haenni在l994年的一篇综述中作了描述(Virology198:415-426)。实际上，并不能可靠预见构建一个正链RNA病毒基因组的全长DNA拷贝并从这个全长DNA拷贝产生出合成的感染性RNA是否能成功。发明概述本发明提供了对应于CSFV基因组的核苷酸序列，它包括示于SEQIDNo.l的CSFVC株的核苷酸序列的至少一部分，或该核苷酸序列的互补序列或相应RNA序列；或其突变体。本发明还提供了有不同核苷酸但编码相同氨基酸的简并核苷酸序列。本发明还涉及这些核苷酸序列编码的多肽，并涉及其基因组含有这种核苷酸序列的疫苗汰尤其是基于CSFVC毒株基因组的全长DNA拷贝转录本的重组病毒株。如上所指的部分核苷酸序列也同样有用，特别是那些在病毒基因组的结构区,亦即编码示于SEQIDNo.1的序列的l-1063位氨基酸的核苷酸序列中有一突变的序列。突变可能是被其他瘟病毒毒株基因组的对应部分取代，可以是取代了一个或多个氨基酸，也可以是缺失。突变还可以是一段插人或取代的异源核苷酸序列，所述序列改变了CSFV核苷酸序列的翻译策略，或是改变了由CSFV核苷酸序列编码的多肽的加工。而且，突变还可能是这样一段插人的或取代的异源核苷酸序列，它编码一段能诱导抗另一种病原体的免疫力的多肽;这时CSFV序列被用来当作异源免疫原的载体。本发明亦涉及瘟病毒基因组的全部或一部分的核苷酸序列或其突变体，该序列在E1蛋白的某一亚区，即在编码SEQIDNo.1.的序列的691-750位氨基酸或785-870位氨基酸的核苷酸序列中有一个突变，本发明同样还涉及这些核苷酸序列编码的多肽。这些多肽特别有用于用此方式保护动物抵抗瘟病毒属的感染，以便能作出诊断来区分被瘟病毒属的野生型病毒株感染的动物和已经预防接种的动物。本发明还涉及带有如上所指的核苷酸序列，多肽，或疫苗化病毒纟朱的疫苗，也涉及含有上文提到的核苷酸序列或多肽，或抗所述多肽的抗体的诊断组合物。本发明还涉及诊断瘟病毒感染的方法和手段，特别是能区分被感染的动物和接种过的动物的手段和方法。本发明亦提供了通过特异性结合试验测定诸如免疫测定法中的抗体或抗原这样的受验物质的方法，特异性结合试验中用到了固定化形式的特异性结合的参照物质和标记形式的相同特异性结合的参照物质。本发明的详细描述本发明提供了CSFV的"中国"株(C株EP-A-351901)的RNA基因组的完整cDNA序列。这样就能构建该序列的全长DNA拷贝，它能转录出合成RNA,该RNA在转染了合适的细胞，如SK6-M细胞(asza,L.etal.,1972.Res.Vet.Sci.，13:46-51;EP-A-351901)后引起感染性C株病毒的合成。本发明描述了这一发现在开发修饰的C株疫苗，如含有一个(血清学)标记的疫苗中的用途。尽管本发明只举例i兑明了一种CSFV病毒株，但通过在其他瘟病毒和CSFVc株之间交换如下所述的特异性基因组片段，或通过构建其他瘟病毒的"感染性"DNA拷贝，它同样适用于并有用于其他瘟病毒属病毒株。C株的基因组RNA的DNA拷贝的核苷酸序列描述在SEQIDNo.1中。本文提到的数字均与该序列有关，且在其他瘟病毒的序列中可能稍有区别。此核苷酸序列总长l2,311个核苷酸，并含有一个编码3，898个氨基酸长的多聚蛋白的l1,694个核苷酸长的大开放阅读框架(ORF)。此ORF的大小相同于CSFVBrescia病毒株(Moormanneta1.,1990，病毒学177:184-198),和CSFVAlf0rt病毒株(Meyersetal.,1989，病毒学177:555-567)的基因组。ORF始于第374位至376位核苷酸的ATG并止于在l2,068位至l2,070位核苷酸的TGT密码子。ORF之前的5'端非编码区长373个核苷酸，其序列在病毒株Brescia,Alfort和C之间是高度保守的(图2),且该区段预测的二级结构类似于丙型肝炎病毒(Browneta1.,1992,核酸研究20:5041-5045)(黄病毒科的另一成员)的5'端非编码区的二级结构。丙型肝炎病毒的5'非编码区显示含有—个内部核糖体进人位点(Tsukiyama-Koharaetal，1992,病毒学杂志66:1476-1483)。此位点有重要的调节功能(Ago1,1991.高级病毒研究40:103-180)。与丙型肝炎病毒的相似性i兑明CSFV的5'非编码区也含有一个内部核糖体进入位点，它大致位于SeQIDNo.1的序列的l24和374位核苷酸之间，可作为重要的调节因子。内部核糖体进人位点可用作为使病毒减毒而突变的位点，也可作为改变ORF的翻译策略的位点。调节瘟病毒复制的第二个重要区域是3'端非编码区。将C株序列与Brescia株和Alfort株的序列进行对比，就可发现在这个3,端非编码区有一段l3个核苷酸的序列对C株而言是独有的(图2B)。此独有序列Trrrc'm'丄，丄'm'位于seqidNo.i序列中的i2128位至i2140位核苷酸。相对于Brescia株的Alfort株的序列，这是C株序列中发现的唯一一处一排内多于两个核苷酸的插入。三种CSFV病毒株的3'非编码区中的剩余序列具有高度同源性。当比较CSFV病毒株和BVDV病毒株时,该区序列间的总同源性较低，不过，很明显的是c株的TnrcTnTmr序列在bVDV株的3'非编码区序列中也不存在。因而TnTCTTmTTT序列似乎是C株的基因组独有的，而且它将为c株特异性序列提供一个极好的标i己。此序列能用来作为核苷酸探针和序列测定的基础，以鉴定c株特异性的瘟病毒。因此，所有在其3'非编码区有此序列(不必非在C株中的相同位置上)的瘟病毒毒株都被认为与C株有关，并且也是本发明的一部分。瘟病毒基因组的DNA拷贝转录本的感染性的一个决定性参数是氨基酸序列。在这一点上，关于总的RNA病毒，以及特别对于瘟病毒的克隆和测序，有两方面必须考虑到。第一，正链RNA病毒基因组的突变频率高(复制期间约l/104核苷酸)，因此，对于它所包含的病毒RNA没有哪种病毒或病毒RNA制品的C液是可克隆化的。这些RNA分子中也可能有非感染性的分子。如果这是由大开放阅读框中超前终止密码子所致，就能很容易地被识别。影响病毒酶类的活性位点或蛋白质的已知结构的突变也是可识别的。然而，对大多数瘟病毒蛋白质来说不知道氨基酸序列与蛋白质的功能和结构的关系，故无法预见哪一个氨基酸是有效的而哪一个是无效的。第二，cDNA合成期间可导入突^因此，需独立进行两次C株基因组的克隆和测序。对序列间有差异的区域至少要克隆并测序三次(参照图l)。在某一特殊位置遇到两次的序列被认为是该位置上的正确序列。以下发现证实了此方法用于产生C株基因组的DNA拷贝感染性转录本的必要性。经第二轮克隆和测序后组成的全长DNA拷贝pPARKf1c-113(图3)似乎并无感染性。对第一轮和第二轮的cDNA克隆序列之间有差异的区域再进行克隆和测序后，看起来在第二轮cDNA克隆的全长拷贝中有5个氨基酸与被认为是正确的C株序列中的不同。更正了pPARKf1c-113中的这5个氨基酸后得到的克隆PPRKf1c-133可产生感染性转录本(图4)。这5个差异位于l414位(缬氨酸变成了丙氨酸)；2718位(甘氨酸变成天冬氨酸)；2877位(纈氨酸变成甲硫氨酸)；3228位(亮氨酸变成甲硫氨酸)；3278位(酪氨酸变成谷氨酸)。由非感染性cDNA序列在这些位置编码的氨基酸表示在箭头前，感染性拷贝中这些位置的氨基酸表示在箭头之后(SEQIDNo.l.)。是不是每个这样的氨基酸单独改变将消除C株DNA拷贝的感染性，还需通过用这5个氨基酸中每一个的单一突变来分析转录本的感染性才能确定。然而，这一发现显示氨基酸序列中小的不同可能对C株基因组的DNA拷贝转录本的感染性起决定性作用。它还说明在实践中,制备瘟病毒序列的拷贝的感染性转录本似乎会因为序列中未能觉察的微小变化(甚至是l个氨基酸水平上的变化)而变得不可能。C株衍生的适合于(标记)疫苗开发的突变体均是本发明的部分。它们可能在SEQIDNo.1所示的核苷酸序列中包含了这样一些突变，如缺失、插入、(多个)核苷酸突变，以及来源于其他瘟病毒株的基因组片段的插入和/或交换oC株序列可被分成4个适于突变和/或交换的区^U区域l是从核苷酸l至373的5'非编码序列。区域2从374位至3563位核苷酸，它编码结构蛋白NP'。-C-E2-E3-E1。区域3编码非结构蛋白，是从核苷酸3564至l2068位。区域4是3'非编码序列，从l2069至l2311位核苷既特别适于制备C株标记疫苗的一个区域含有编码结构蛋白NP'o-C-E2-E3-E1的基因组区亂该区位于SEQIDNo1序列中的和l063位氨基酸l之间。此部分的基因组的优选亚区由以下氨基酸序列l-168(N"。)，169至267(C),268至494(E2)，495至689(E3),690至l063(E1),或其部分来确^举例来说，编码C株E1的区域的N末端抗原性部分，即690至877位氨基酸与Brescia株的E1的相应区域交换(图4，pPRKf1c-h6)。新产生的C株衍生物具有感染性，而且能通过与抗E1和E2的C株和Brescia株特异性单克隆抗体反应而区别于野生型病毒株和Brescia株，例如所得的C株与特异于Brescia株的E1的单克隆抗体反应凍l)。因此，该新突变体的抗原特性与其亲代病毒相比已经改变，证实用另一种CSFV毒細1的N端部分来替换C株的E1的N端部分，是开发C株*斜己疫苗的一种方法。然而,本发明并不局限于在C株和其他CSFV株之间交换E1的N末端部分。来自任—其他瘟病毒毒株的E1的N端部分可用C細1的相应部分交换。就这一点而言，从猪体内分离到的但不属于C株抗原组的瘟病毒毒株的E1序列就特别合适。在交叉中和作用基础上选择出的这些病毒株的例子包括病毒株"VanEE",tam","SFUK87","Wisman，，和"5250(Wensvoortetal.,1989，V,Microbiol20:291-306;Wensvoort,1992,欧共体国家猪类实验室会i义报告16-17June1992.VI/4059/92-EN(PVET/EN/1479)1992p59_62)。El的N末端部分显示出包含有3个不同的抗原区，A,B和C，它们位于E1蛋白的不同部位，每个均与其中和性单克隆抗体强烈反应(Wensvoort1989,普通病毒学杂志70:2865-2876;VanRijnetal.1992VetMicrobiol33:221—230;VanRijnetal.，1993.普通病毒学杂志Viro174:2053-2060)。在受试的94株CSFV病毒的A区图谱中表位是保守的，而B区和C区的表位是非保守的(WenSvoort1989，普通病毒学杂志70:2865-2876)。用Brescia株和C株的E1基因的杂合子(VanRijnetal，1992VetMicrobiol33:221-230),和用Brescia株的E1的缺失突变体对表位作图，暗示A区和B十C区在E1区的N端部分形成两种不同的抗原单位(VanRijnetal.,1993普通病毒学杂志74:2056-2060)。在E1的N端部分中位于693,737,792，818，828和856位的6个半胱氨酸是E1正确折叠的决定性因素，这一发现更进一步支持了上面的暗示。然而，至少792位的半胱氨酸对Brescia株的感染性不是决定性因素，因为用该位置的半胱氨酸变为精氨酸的突变分离到了该病毒的单克隆抗体抗性突变株(VanRijneta1.1993第九界国际病毒学大会论文及摘要8-13AugustGlasgowScotland)e尽管氨基酸序列中的小改变可导致C株RNA的感染性丧失(见实施例2),但792位半胱氨基酸改变则显示，在不太可能预见到适于修饰而又不失去功能的某一位置上一个氨基酸的改变仍有可能导SC^生有活性的病毒突变体。因此，对C株序列中的每个氨基酸而言，某一特定氨基酸的改变对该病毒特性的影响将不得不凭经验确定。这又一次显示，对修饰c株，如对^ia疫苗的开发没有明显的靶序列可在以前出版的资料的基础上作出鉴定。C株^ifi疫苗的开发所必须的是将接种的猪和被CSFV野生株感染的猪进《亍血清学区分的可能性。以前曾显示由猪a疱疹病毒i型病毒的减毒活载体表达的E1，或由杆状病毒载体在昆虫细胞中表达的免疫亲和纯化的E1，在猪体内诱导了对抗猪瘟的保护性免疫反应(WO91/00352;VanZij1eta11991病毒学杂志65:2761-27.615;Hulstetal.,1992病毒学杂志67:5435-5442)。我们很吃惊地发现带有缺失的A区或带有缺失的B+(:区的61突变体個5),也在猪体内诱导了抗猪瘟的保护性免疫反应(表2)。这说明由疫苗病毒株诱导的保护性免疫并不依赖于同时抗A区和B+(:区的中和抗体。因而，只在A区，或只在B+(:区，或在这些区的某一部分用另一种瘟病毒的相应区交换或突变的瘟病毒株突变体，优选不限于是从猪中分离出的属于除C株外的其他抗原组的一种瘟病毒(例见上文)，均是本发明的部分。覆盖了A区并适合于交换或突变的E1区定位于7.85和870位氨基酸之间。该区的一些部分也适于交换或突变，如位于785和830位氨基酸之间和位于829和870位氨基酸之间的亚区域。覆盖B+C区并适于交换或突变的E1区定位于691和750位氨基酸之间。该区的某些部分也可能适于交换或突变，如位于691和718位氨基酸之间及717和750位氨基酸之间的亚区域。受瘟病毒感染的动物产生抗E2抗体(Kwangeta1.，1992.Vet.Microbiol32:281-292;Wensvoort未公开的意见)。因此，适于经突变(缺失，插人点突变)或经与抗原性不同的瘟病毒交换相应遗传物质，或用属于不同抗原组的瘟病毒交换相应遗传物质以进行(标记)疫苗开发的第二个区就是编码E2的区域。C株还可被用来作为插人和表达异源性遗传物质(序列)的载体。为了载体的开发，被插入C株中的异源遗传物赓可用来改变大ORF的翻译策略及对由该ORF编码的多聚蛋白的加工。适于改变大ORF的翻译策略的序列的一个例子是带有内部核糖体进入位点(IRES)的序列(Dukeeta1，1992病毒学杂志66:1602-1609及其参考文献)。适于改变多聚蛋白的加工的序列的一个例子是，负责从细胞中排出蛋白或是将蛋白穿过内质网膜而插入膜中的信号序列(B1obe11980美国国家科学进展77:1496-1500;Kreil1981AnnuRevBiochem50:317-348)。信号序列可被细胞信号肽酶切断。然而，编码病毒蛋白酶的切割位点的序列也可用于改变多聚蛋白的加工。经一种C病毒株载体插入并表达的序列可用作鉴别受接种的猪的标记，或用作保护猪对抗由异源性插入序列产生的病原体。优选标记序列有强抗原性并属于在猪体内不复制的微生物。它们可编码已知的全基因产物(如衣壳或包膜蛋白)，或这些基因产物的抗原性部分(如表位)。优选标记序列来自以下病毒家族腺病毒科，沙粒病毒科，Arteriviridae,布尼病毒科，嵌杯状病毒科，Circoviridae,冠状病毒科，黄病毒科，嗜肝DNA病毒科，疱疹病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科，乳多空病毒科，弹状病毒科，细小病毒科，痘病毒科，小RNA病毒科、呼肠病毒科、逆转录病毒科、及披膜病毒科。然而标记序列也可编码天然状态下不常见的人工抗原，或编码组织化学标记如大肠杆菌(3-半乳糖苷酶，果蝇乙醇脱氢酶，人胎盘碱性磷酸酶，萤火虫萤光腺及氯霉素乙酰转移酶。编码一种或多种蛋白的异源遗传物质，该蛋白能诱导保护性免疫以对抗由异源遗传物质相应的病原菌所致疾病，可来自其他包括上述毒株之序列的瘟病毒株,也可来自猪细小病毒，猪呼吸道冠状病毒，传染性肠胃炎病毒，猪生殖和呼吸综合症病毒(Le1ystad病毒，EP92200781.0),猪tt疱疹病毒l型，猪地方性腹泻病毒，以及猪流感病毒，这些遗传物质还可来自细菌，诸如出血败血性巴斯德菌，支气管败血性博德特氏杆菌，胸膜肺炎放线芽孢杆菌，Streptoccocussuis,舌骨痢疾密螺旋体，大肠杆菌，钩端螺旋体，以及象猪J!市炎枝原体和猪鼻炎枝原体这样的枝原体。在C株中异源序列插人的合适位点位于l70和l71位氨基酸残基之间，690和691位氨基酸残基之间，及691和692位氨基酸残基之间。它们均示于SEQIDNo.1中，但这些并不是仅有的位点。本发明也包括一些诊断试验，它们可用于区分用标记疫苗或用含(突变的)E1和/或(突变的)E2的亚单位疫苗接种过的猪，以及用瘟病毒野生型毒株感染的猪。这类鉴别诊断试验的适当形式描述在实施例4和5中。在常规非区分性CSFVELISA试验中，E1在由Wensvoort等人l988年描述的复合物捕获封闭(CTB)ELISA试验中被用作抗原(Vet.Microbiol17:129-140)。现有技术中的CTB—ELISA:也称为液相封闭ELISA,或称为双抗体夹心ELISA,用到两种抗CSFVBrescia株的E1的单克隆抗体(Mabs)。定位于A区内的Mabb3的表位在CSFV各株之间是保守的，而定位于C区内的Mabb8的表位是非保守的(Wensvoortetal.1989,普通病毒学70:2865-2876)。上述CTB-ELISA是灵敏可靠的，并能专一地检测受瘟病毒感染的猪体内CSFV特异性抗体。故该试验可区分受CSFV病毒株感染的猪和受诸如BVDV病毒株感染的猪。但该试验不能区分受CSFV野生型毒株感染的猪和经C株疫苗接种的猪。而且该试验不适于与活的或死的E1亚单位疫苗联合使用。本发明的一个试验是修改过的CTB-ELISA,它只以一种MAb如MAbb3为基础。这种仅仅基于一种Mab的CTB-ELISA以前未有人描述过，所述Mab即可用于结合ELISA试验板表面上的抗原也可用于与野生型血清竞争，这种CTB-ELISA是本发明的一个重要部分。既然已描述了该试验的原理，它就可用于诊断试剂盒的幵发，以检测其他抗体，包括抗其它病毒或其它疾病的抗体，或能指示人或动物体的其他疾病的抗体。这一发现因而有用于所有CTB-ELISA,或是基于与CTB-ELISA相同原理的ELISA,它们均是在单一的Mab以及二聚体化或多聚体化抗原的基础上发展起来的。这里要求的试验方法也适用于测定其他特异性结合配对分子对的成员，如激活物/受体，酶/抑制物等，其中配对分子之一应有至少两个相同的结合位点。因而本发明也包括了这样一种方法，它通过将上述试验物质与可测剂量的能特异性结合上述结合配对物之同一结合位点的参照物质(抗体)竞争能测定样品中能特异性结合结合配对物(如抗原)的结合位点的试验物质(如抗体)，所述方法包括(1)用以下物质与上述样品接触，(a)结合于固相载体上的上述参照物质(抗体)；(b)上述参照物质的结合配对物傲原)，该结合配对物分子含有至少两个与上述参照物质一样的结合位点，(c)带*承记的上述参照物质(抗体)；(2)测出上述标记物从上述载体上分离的程度。作为一个例子，针对上述参照物质航体)的带有至少两个相同结合位点的上述结合配对物傲原)是针对上述参照物质的结合配对物(抗原)的二聚体。应用同样的原理，本发明还包括在样品中测定试验物质(抗原)的存在的方法，该试验物质的每个分子上有至少两个相同的能特异性结合其结合配对物航体)的结合位点。此方法包括(1)用以下物质与上述样品接触(a)结合于固相载体上的上述结合配对物航体)，及(b)带+斜己的上述结合配对物(抗体)；(2)测定上述标记物与上述载体的结合程度。这些方法中，抗体和抗原仅作为例子而提及；它们可以被其他特异性结合的配对分子替代。本发明进一步提供了一个诊断试剂盒，它包括(a)结合在固相载体上的参照单克隆抗体；(b)带标记的上述参照单克隆抗体；还可任选地包括(c)上述参照抗体的有至少两个与所i兑参照抗体相同之结合位点的抗原；试剂盒也可是上述成分(a)和/或(b)和(c)之间的混合；还可包括能进行竞争免疫学试验的其他成分。此方法适于与在E1的一个或多个表位(如A区)有缺失的E1亚单位疫苗联合应用来作为鉴别诊断试验。该试验亦适合于与A区突变了的E1亚单位联合使用，该突变使产生的抗该突变的A区的抗体并不与Mabb3竞争Mabb3的表位。而且，这个试验适于与修饰后的C株或其他CSFV病毒株疫苗协同使用，所述CSFV疫苗株或是在A区有缺失，或是A区被不同于CSFV的其他抗原组的瘟病毒(见上)的A区所交换，或是A区发生了突变使针对该区的抗体不与Mabb3竞争Mabb3的表位。这里描述并举例说明了有关E1的A区的试验，而只以Mabb8为基础的相似试验也能用于与下面所说的疫苗协同使用，这类疫苗在B+0或(区有缺失，或是其B+0或0区被不同于CSFV的其它抗原组的瘟病毒(见上)的B+C区或C区所交换，或是其B+C区或C区突变后产生的针对这些区的抗体不与Mabb8竞争Mabb8的表位。本发明也举例说明了该试验与Brescia株的Mabb3或Mabb8的联合作用。但是，本试验也能用其他Mabs来建立，这些Mabs不仅是针对Brescia株的E1的A区或B+C区，或者是针对任何其他CSFV株的A区或B+C区，还可以是针对任何其他瘟病毒的E1中的类似区。这样的试验也可以以E2的表位为基础(见实施例5)。根据本发明在(修改过的)CTB-ELISAs中较合适的抗原应优选那些能与Mabb3或Mabb8或针对E2表位的类似MAbs反应的CSFV株的E1二聚体或多聚体(加或减一个3'-TMR)或E2的二聚体或多聚体(见实施例5)。就带有突变的A区的疫苗而言，用于诊断试验的抗原二聚体或多聚体由缺失B+(:的构建体合成(见实施例5)，而就带B+C区突变的疫苗而言，用于诊断试验的抗原二聚体或多聚体由缺失A的构建体合成(见图5的构建体；见实施例4和5)。我们确信E1抗原的二聚体化(或多聚体化)形式是以E1C末端部分中半胱氨酸残基形成的二硫键为基础。它容许极其灵敏的免疫试验，因为二聚体化的抗原分子对l个Mab而言含有两拷贝表位。因此，这一个Mab就可用于通过一个表位固定二聚体化抗原，并用于通过其他表位标i己二聚体化的抗原。由野生型病毒株感染产生的样品血清中的抗体的竞争作用可抑制标记抗体与抗原的结合，并因此可导致能测出该抗体的敏感试验。本发明还涉及基于此方法的诊断试剂盒,该盒中包括基于E1或E2的抗原，及(酶)标记并固定的针对E1或E2表位的同型单克隆抗体，以及其他常规成分(试验板，稀释液，酶的底物，染色剂等)，这样就能进行竞争型的免疫试验。根据本发明的疫苗包含如上所述的核苷酸序列，它既可以是核苷酸序列，也可以是疫苗株，还可以是存在于载体或宿主有机体内的核苷酸序列，或者也可以是如上所述的多肽，其含量足以产生针对瘟病毒感染的保护作用。该疫苗还可以是多用途疫苗，它包括其他免疫原或编码它们的核苷酸。该疫苗还能进一步包含常规载体、佐剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂等。根据本发明的疫苗可用常规方法制备。本发明用于产生CSFV的C株基因组全长DNA拷贝的感染性转录本的方法对任何其他C株衍生物或瘟病毒属其他株均适用。这里所描述的产生减毒活CSFV疫苗株的方法亦极适用于为了制成疫苗而在体外减缓(修饰)C株或任何其它CSFV或其他瘟病毒株的毒性。根据本发明的C株疫苗允许在接种过的猪和被CSFV野生型病毒株感染的猪之间进行血清学区分。用本发明的方法同样能很好地得到其他任一种CSFV病毒株或瘟病毒株的*斜己疫苗。这类标记疫苗可以通过如下的突变来开发，即突变(缺失，点突变，插入)编码E1的区域，或E1的N端部分，或E1的A区或B十C区，或编码C株的E2的区域，或衍生于C株或其他瘟病毒株基因组中的类似区，或用抗原性不同的瘟病毒的相应区域或是属于不同抗原组的瘟病毒的相应区域交换这些区域。另一种开发C株标记疫苗的方法是向其基因组加人能表达在猪体内不复制的微生物的强抗原性蛋白质或表位(多个表位)的异源性遗传物质，或是能表达具有人为的特点并且在猪体内只有在不正常情况下才能发生的蛋白质或表位的遗传物质o此外这种异源遗传物质能编码这样一类抗原，它们能在猪中诱导抗由其致病菌导致的疾病的保护性免疫。因此，应用c株，或c株衍生的病毒株，或任何其他瘟病毒株，来作为能诱导抗宿主体内特定疾病的保护作用的外源抗原的表达载体(该宿主是哺乳动物)，这也是本发明的一部分。上文中已描述了对表达外源序列的重组c株病毒及适于这些外源序列插人的位点的构建。同样可构建c株衍生的病毒，或任一种其他瘟病毒的类似的重组病毒。这些病毒因此也是本发明的—部分。本发明的一个重要部分涉及在A区或B+0区有缺失的￡1亚单位的免疫原性的潜力。正如表2中概括的，这两种E1突变体均能在猪体内诱导抗致死剂量的强毒性Brescia株的攻击的保护性免疫。应用在A区和B+0区内有缺失或其他突变的E1突变体作为死亚单位疫苗或作为由接种后的动物体内的载体系统所表达的抗CSF的活亚单位疫苗，这也是本发明的一部分。突变的E1加上其他抗原性CSFV蛋白，如E2或E2的突变形式，也适于作为死或活的亚单位疫苗(见上)。本发明还包括能用于区分用CSFV标记疫苗或含(突变的)E1和/或(突变的)E2的亚单位疫苗接种的猪和被瘟病毒的野生型病毒株感染的猪的i參断试验。这样的诊断试验可以血清学、抗原检测或核苷酸检测为基础。到底哪种试验适合于当时的情况，这种选择取决于所用标记物的专一性。血清学诊断试验的合适形式之一是描述在实施例4中的经修改的CTB-ELISA。根据本发明,这种基于使用单一抗体的CTB-ELISA的方法并不限于只用在CSFV或其他瘟病毒上，而是也适用于为诊断而测定人或动物界的其他抗体，还适用于测定其他特异性结合的物质。联合c株标记疫苗的恰当的抗原检测试验的一个例子就是测定猪血中的csFV野生株E1而不是疫苗株E1的试验。如果C株的A区，通过例如被属于不同于CSFV的抗原组的瘟病毒株的A区交换而被修饰，这样的试验就可以以识别CSFV的A区保守的表位的单克隆抗体为基础。可是，若为了开发标记疫苗对C株的E2作了修饰，那么与这样的疫苗相伴的血清学或抗原性诊断试验就能检测出接种的动物和感染的动物之间有关修饰的E2区的差别。这种诊断试验因此要用E2特有的序列作为抗原。这些E2特有的序列可能来源于亲代C株(见实施例5),也可来源于抗原性不同于C株的CSFV株，或来源于不同于CSFV的其他抗原组的瘟病毒。但是，这些E2特有的序列也可以通过对任一种瘟病毒的天然E2进行突变傲失、插人或点突变—处或多处)而获得，或是由任一种瘟病毒的E2的(突变)部分组成。二聚体的E2和多聚体的E2可在诊断试验中用作抗原(见实施例5)。E2与一种单克隆抗体联合(比较实施例4和5)也可用于CTB-ELISA试验，该试验的原理已在上文描述过。基于E2的诊断试验描述在实施例5中，其中抗原检测试剂盒是为了检测瘟病毒的E2,而且是建立在一种Mab的基础上，这样的试验试剂盒优选包含能识别E2的保守表位的抗体。这样的试验也是本发明的一部分。最后，诊断试验有可能以对CSFV野生株的区域的特异性检测为基础，而在C株中这些区域已经过修饰。适合于该试验的技术包括核酸杂交(例如用特异异性探针杂交)和/或扩增(例如用聚合酶链式反应)。另外，通过对3'非编码区(或其一部分)进行PCR扩增就能将C株序列与CSFV野生株序列区别开，所述3，非编码区内有一段TTTTCTTTTTTTT序列是C株基因组特有的。如果C株通过插人了外源标记序列而被修饰，那么，根据此序列的任何形式的诊断试验，如根据抗原，表位或由该序列编码的组织化学产物，或根据通过核酸杂交技术(如特异性探针杂交)和/或扩增技术(如聚合酶链式反应)对外源遗传信息的检测，也是本发明的一部分。实施例lC株基因组的分子克隆和测序细胞和病毒猪肾细胞(SK6-M,EP-A-351901)在含5%胎牛血清(FBS)和抗生素的Eag1e，s基本培养基上培养。如文献所述(Moormannetal.1990，Virology177:184-198)测试FBS看是否有BVDV以及BVDV扰体。只有不含BVDV和BVDV抗体的血清可以使用。典型猪瘟病毒(CSFV)的"中国"疫苗株(C株)如EP-A-351901中所述适应于SK6-M细胞。被称作"Cedipest"的病毒株是非致细胞病变的并且用三倍终点稀释法进行生物学克隆。经三步扩增产生了滴度为3、5、106TCID5O/ml的克隆化病毒原种。感染了C株的SK-6细胞的胞质RNA的分离感染了C株的细胞中的胞内RNA如文献所述(Moormannetal.l990.Virolgy177:198)作必要的分离。简短地i見在162cm2瓶(Costar)中的SK6-M单层细胞用Cedipest以每个细胞5TCID5o的感染复数(m.o.i)感染。然后，细胞于37'C培育1.5小时，并加入新鲜培养基使终体积为40m1。7小时后加放线菌素D至终浓度l〃g/ml。24小时后将细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗两次，在冰冷的裂解缓冲液(50mMTris-HC1p82,0.14MNaCl,2mMMgCl:z,5mMDTT，0.5%[v/v]NP-40,0.5%[W/V]脱氧胆酸钠，及l0mM氧钒核糖核苷复合物(NewEnglandBiolabs))中裂解。裂解产物离心(4'C,4000g5分钟)后上清用蛋白酶K(终浓度250#g/m1)37T处理30分钟。用酚、氯仿和异戊醇(49:49:2)抽提两次，再用氯仿和异戊醇(24:1)抽提l次。RNAjC存于乙醇中。cDNA的合成和扩增1至2〃g感染了C株的细胞的胞质RNA及20pmo1反义引物与lP110mM氢氧化甲基汞在室温保温l0分钟。变性的RNA再与1J"l286mM3-巯基乙醇室温保温5分钟。RNA用无RNA酶H的200-400单位M-MLV逆转录酶(Promega)在lXM-MLV逆转录酶缓冲液(50mMTris—HClpH8.3,75mMKCl,3mMMgCl2和10mMDTT),40UrRNasin(Promega),及80PM的dATP，dGTP，dCTP和dTTP中于42。C逆转录45分钟。最终反应体积为25〃1，样品用30Al矿物油(Sigma)铺盖。经逆转录(RT)后样品于94'C变性i0分钟。每种RT反应物的2.5AH小份在含l^M有义引物和1PM反义引物，各200PM的四种dNTPs,及2.5UTaqDNA聚合酶(BoehringerMannheim)的l00;"lTaq聚合酶缓冲液(由Taq多聚酶的生产厂家提供)中进行39个循环的聚合酶链式反应(PCR)(循环94°C60秋55。C60秒和72'C1-2分钟)而扩增。样品用75Pl矿物油(Sigma)覆盖。覆盖了C株全部基因组的cDNA克隆C株基因组进行两次各自独立的克隆。第一轮克隆期间(图lA),用于第—链cDNA合成和PCR的引物是根据CSFV的Brescia株(Moormannetal.1990,Virology177:184-l98)和A1fort株(Meyerstetal.1989.Virobgyl71:555—567)之间，以及BVDV的Os1oss株(Renardetal.EP0208672)和NADL株(CoL1ettetal.1988.Virology,165:191-199)之间的序列同源性来选择的。cDNA片段的大小选择为O.5-2.5kb之间以便得到最佳扩增。凝胶纯化的扩增产物用T4DNA聚合酶和K1enowDNA聚合酶I处理，并用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。然后，cDNA片段用T4连接酶连接到PGEM4Z-b1ue的SmaI位点。在第二轮克隆中(图lB),引物从第一轮克隆所得的cDNA克隆的序列中选择。引物要在可能的地方含有适合于对扩增的cDNA片段进行克隆的限制性位点。经RT和PCR扩增(见上)后，cDNA片段可用两种不同的限制性酶切割，也可在其一端钝化和磷酸化(如上所述)，并在另一端用适当的限制性酶消化。若不能使用PCR产生的位于弓I物中的限制位点，就选择扩增的cDNA片段中的位点来克隆。凝胶纯化后，PCR产物被连接到经凝胶纯化的，并已用限制性酶消化产生了与PCR产物相容的末端的pGEM4z-b1ue(Promega)或pGEM5zf(+)(Promega)。为获得含有C株基因组的最终5'和3'末端的cDNA克隆，应用3，-5，连接法(Mand1eta1.1991.病毒学杂志65:4070-4077)。如上述从感染了C株的细胞中分离出胞质RNA,并通过5.7氯化铯垫层进一步纯化(MoormannandHulst.1988.病毒研究l1:281-291)。有暗示i兑BVDV基因组5，端无帽结构(Brocketal.1992.病毒学方法杂志38:39-46)，根据这一结果，将C株的基因组RNA未经焦磷酸酶处理就直接连接。8PgRNA用10U的T4RNA连接酶(NewEnglandBiolabs)在反应混合液中连接，该反应混合液是5OmMTris-HClpH8.0，10mMMgCl2,10mMDTT，20UrRNasin(Promega),10Pg/mlBSA(无RNA酶)及lmMATP。将混合物在37。C保温4小时。RNA用苯酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀，结粒，并重新悬浮于不含RNA酶的水中。2Ag每份的RNA按上述进行逆转录和扩增。每次PCR的2〃1的各等份用嵌套弓l物再扩增。对于逆转录过程，用反义引物与5'非编码区杂交。对于两个PCR扩增步骤用有义引物与3'非编码区杂交，并用反义弓l物与5'非编码杂交。经苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，PCR产物用NcoI(掺入嵌套PCR所用的有义引物中)和EagI(SEQIDNO.1序列中的81位核苷酸)消化，然后连接至pUC21的Ncol-Eagl位点(VieiraandMessing，1991，Gene100:189-194)。实施例l中所用到的所有修饰和克隆程序均基本按文献所述的进行(Sambrooketa1.1989.分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。限制性酶和DNA修饰酶均可商购并按厂家说明来使用。质粒转化并维持在大肠ff菌DH5a菌株中(Haiiahan，1985,DNA克隆1:109-135)。cDNA克隆的测序测序要用到的质粒DNA既可用碱裂解和氯化纟里沉淀来抽提和纯化，也可用氯化铯离心来抽提和纯化(Sambrooketa11989.分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。以T7聚合酶为基础的测序试剂盒(Pharmacia)被用于质粒DNA的直接双链测序。除了SP6,T7,和通用的PUC/Ml3正向和反向引物外，还根据CSFVBrescia株的序列用了寡核苷酸引物(Moormann等人，1990.Virology77:184-198)。用CycloneDNA合成仪(NewBrunswickScientific)或用392DNA/RNA合成仪(AppliedBiosystems)合成引物。在含8M尿素的6%丙烯酰胺凝胶上分析测序反应。测序数据在使用Speedreader软件和PCgene软件(IntelligeneticsInc.AppliedImagingCorp,Geneva.Swizerland)的Compaq386计算机及在使用MacMoI1ytetra程序的苹果Macintosh计算机上分析。考虑到Taq聚合酶或C株RNA的异质性可能会导致序列错误或序列差异,可通过对两次独立的PCR反应所获得的两个cDNA克隆中最小的一个进行测序来确定C株cDNA克隆的全基因组序列。如果在特定区的两个克隆的核苷酸序列之间发现有差异，可通过对另一次独立的PCR反应所获得的第三个cDNA克隆进行测序来确定该区的共有核苷酸序列(图lA)。实施例2C株基因组的全长DNA拷贝的感染性转录本的产生构建cDNA克隆pPRKflc-113根据示于图3的模式组成C株基因组RNA的全长DNA拷贝。首先，构建两个亚克隆，其中一个(pPRc64)含有基因组的5'部分的cDNA序列(1-5,560位核苷酸)，而另一个(pPRc111)则含有基因组3，部分的cDNA序列(5,463-12,311位核苷酸)。最初构建全长cDNA克隆是在pGEM4z-b1ue中尝试。但是，该方法因全长序列插入此载体后不稳定而失败。为了增加克隆的稳、定性，5'和3'部分克隆的插入物在低拷贝数载体POK12(VieiraandMessing，1991,Gene100:189-194)的衍生物中再克隆，最终分别产生了pPRcl08和pPRc123。为了达到这种结果，pOK12通过缺失了多克隆位点(MCS)中的绝大多数限制性位点及T7启动子序列而得以修饰。最后得到的用于进一步的全长克隆的载体PPRK仍然在MSC中含有唯一的Spel，NotI,Eagl，BamHI，EcoRV,EcoRI,和XbaI位点。具体地说，全长克隆PPRKf1c-113的构建过程如下(图3):质粒pPRc45和pPRc46的插入片段在位于C株序列(SEQIDNO.1)中l249位核苷酸上的HpaI位点处连接起来，产生质粒pPRc49。pPRc49的插人片段再与pPRc44的插入片段在位于(SEQIDNO.1)3241位核苷酸的Ns1I位点处连接，从而产生pPRc63。通过按下述将pPRc13的插入片段与C株基因组RNA5，终端区扩增的(PCR)cDNA片段连接就构建成5，半部分克隆pPRc64(核苷酸1至5560,SEQIDNO.l),合成一段5，末端有义引物，该引物含有一个EcoRI和一个Sa1I位点，其后连接着T7RNA聚合酶启动子序列和C株基因组RNA的头23个核苷酸。该引物以及一段第二轮克隆的反义引物被用于扩增一个cDNA片段，而该cDNA片段被EcoRI和XhoI消化后克隆进经EcoRI-XhoI(SEQIDNO.l中的216位核苷酸)消化的pPRc63。最^pPRc64的插入片段被再克隆进由EcoRI-XbaI消化的pPRK而产生pPRc108。3'半部分克隆PPRc111(5，463至l2,311位核苷酸，SEQIDNO.1)通过连接4个第二轮克隆(pPRc67,53,58和55)及l个第一轮克隆(pPRc14)而构建成功。pPRc67和pPRc53的插人片段在位于7，778位核苷酸的NheI位点处连接而成pPRc71。pRRc55和pPRc58的插入片段在位于l0,387位核苷酸处的ApaI位点处连接而成pPRc65。pPRc65和pPRcl4的插人片段随后在位于l1,717位核苷酸处的Af1II连接而成pPRc73。pPRC73的插入片段在位于8，675位核苷酸处的PstI位点上与pPRc71的插入片段连接而成pPRc79。然后，包括了C株cDNA的完整3'末端序列的pPRc79的插人片段经过修饰导入了一个SrfI位点，该位点在消化后能精确地产生C株cDNA序列的3'末端(用于在3'末端精确的失控转录)。为达到这一点而合成了一段3'末端反义引物，它含有一个SrfI和一个XbaI位点及互补于C株基因组RNA的3，端序列的l8个核苷酸。该引物和第一轮克隆的一段有义引物被用于扩增cDNA片私该片段用Spel(SEQIDNO.l中的l1,866位核苷酸)和XbaI消化并克隆进经SpeI-XbaI消化过的pPRc79，产生pPRc111。全长cDNA克隆pPRKf1c-113,最终通过将pPRc111的C株特异性NcoI5532-XbaImcs片段插入经NcoI5532-XbaImcs消化的pPRc108中而构建成。构建全长克隆PPRKf1c-133全长cDNA克隆pPRKf1c-113仍具有除了核苷酸沉默突变以外的5个点突变，它们致使氨基酸发生改变，不同于从至少两个第一轮cDNA克隆的序列中确定出的氨基酸序列。pPRkf1c-113中的这五个点突变通过将受影响的DNA片段交换成含有优势序列的相应DNA片段而转变成优势序列。个中转变了2个)。在4,516位核苷酸处有点突变的5，半部分cDNA克隆pPRc108，通过其ScaI3413—NcoI5532片段被pPRc1.24的相应片段交换而被改变。用pPRc32PvUII4485-NheI5065片段交换PPRc44的相应片段就得到了克隆pPRc124(对照图l)。这一新的5，半部分cDNA克隆被命名为pPRc129。为了能进行克隆，构建了一个3'半部分克隆，方法是从载体上的Sa1I位点(参照图3)直至位于5，509位(SEQIDNO.l)核苷酸的HpaI位点之间缺失pPRKf1c-113的C株序列的5，端部分，结果产生了PPRcl23。在pPRcl23中在8526,9002，10055和l0205位核苷酸处的突变不得不作变动。8526位的突变经两个步骤而回复。首先，PPRc53的ApaI8506-PstI8575片段被pPRc90的该片段交换从而产生pPRc125。第二，pPRc123的NheI7379-PstI8675片段，被pPRc125的该片段交换从而产生pPRc127。为了能回复9,002位，10,055位和l0,205位的3个突变，先修饰了PPRc58使载体中的FspI位点缺失。结果pPRc58的EcoRImcs-Ndel片段被缺失(Nde1切割pGEM4z-blue),产生了PPRc126。质粒pPRc126被用于回复l0,055位和l0,205位的突变，这是通过将其SacI9'975-ApaI1。's87片段换成pPRc96的相应片段而实现的，这样做的结果是产生pPRc128。用pPRc90的AatII-FspI9'。16片段(AatII切割pGEM4z-blue)取代pPRc128的AatII—FspI9'016片段就能回复9002位的突变，结果产生pPRc130。最后，pPRc127的PstI8'575-ApaI1°'387片段被pPRc130的相位片段取代而产生质粒PPRc132。所有改'变了单个突变的亚克隆步骤均经测序而被证实。在经Ncol5'532—Xbalmcs消化的pPRc129中插入pPRc132的NcoI5.532-XbaIcs片段就构建成了全长克降隆pPRkflc-133。构建杂交的全长克隆PPRKf1c-h6将pPRKf1c-133的部分E1基因换成CSFVBrescia能形成抗原性不同但能存活的C株突变体。为此，pPRcl29的Nhe12.443-Afllll2'99;片段被PPEh6(VanRijneta1.,1992)的相应片段取代，产生了5，半部分的杂交克隆PPRcl39。将pPRcl32的Ncol5'532-XbaIcs片段插入PPRc139就构建成杂交全长克隆PPRKf1c-h6。该克隆现含有CSFV的Brescia株的E1的抗原区，该区包括一个唯一的Bg1II位点。实施例2中用到的所有修饰和克隆程序基本上按文献所述进行(Sambrooketal.,1989,分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。限制性酶和DNA修饰酶可商购，并按厂家说明来使用。质粒在大肠杆節H株中转化并保存。(Hanahan,1985，inDNACloning1:109-135)。体外RNA转录用于体外RNA转录的质粒DNA用Qiagen层析柱(Westburg)按厂家条件纯化。质粒DNA用XbaI或SrfI线性化后用苯酚和氯仿抽提，乙醇沉淀，真空干燥，并溶解在适当体积的不含RNA酶的水中。1的线性化质粒DNA被用作体外转录的模feRNA在l00反应混合物中37'C下合成1小时，该反应混合物含有40mMTris-HC1pH7.5,6.5mMMgCl2,2mM亚精胺，10mMDTT，100UrRNasin(Promega),ATP，GTP，CTP,UTP各O.5mM,及l70单位的T7RNA聚合酶(Pharmacia)。37'C下用不含RNA酶的DNA酶I(Pharmacia)消化l5分钟就除去了模扳DNA，然后用苯酚和氯仿抽提，再用乙醇沉淀。RNA溶于20A1不含RNA酶的水中，并在260mm测紫外吸收来定量。RNA转染RNA转染混合液通过温和地混合5OAllipotectine(GibcoBRL)稀释液(无RNA酶的水中1OAglipofectin)和50RNA溶液(无RNA酶的水中1RNA)而组成，再在室温下保温该混合物l5分钟。在直径35mm6孔的组织培养板中的亚汇合成片的单层SK6细胞被用于RNA转染。细胞用Du1becco，s改良的Eag1es培养基(DMEM)洗两次。再给细胞加lmlDMEM,然后加RNA反应混合氣37'C温育16小时后，培养基被2ml补加了5%FBS的DMEM更换。再在37'C温育3天。然后用CSFV将异性单克隆抗体(Mabs)按Wensvoort等人(Vet.Microbiol.1986,12:101-108)所述的免疫过氧化酶单层试验(IPMA)对细胞进行免疫染色。鉴定重组C株病毒被转染的细胞的上清被置于直径35mm的孔中的铺满的单层SK6细胞上，37'C温育5天。转染的单层细胞经胰酶消化并用DMEM稀释75倍后在75cm2培养瓶(Costar)中37'C生长7天。从此以后，将细胞冻融两次，4t5000g离心l0分钟澄清细胞悬浮液，再收获上清就制备出了病毒贮存氣病毒通过IPMA,及通过对RT-PCR扩增的病毒片段进行限制性分折而被鉴定。用病毒FLc-h6和FLc-133感染SK6细胞后，单层细胞于37'C培养4天。随后，单层细胞用针对BresciaEl上保守表位的Mab(Mabb3，A区)和非保守表位的Mab(Mabsb5和b6，B+C区)，并用C株特异性而且针对E1的Mab(Mabcc2)或针对E2的Mab(Mabc5)(Wensvoort，G，1989,inThesis,pp99-113,Utrecht,TheNetherlands)进行免疫染色。在这一试验中，用被天然的Brescia病毒或天然的C株病毒感染的SK6细胞单层做对照。结果列于表l,均如所预期。简单说，Mabb3识别E1上的一个表位，它在CSFV的各病毒株之间是保守的，因此Mabb3识别表l中的所有病毒株。Mabb5和b6不能i只别C株的E1,并因此只与Brescia株和FLc-h6反应。与之相反，Mabc2不识别Brescia株的E1,并因此只与C株和FLc-133反应。最后，Mabc5不识别Brescia株的E2，并因此与表l中除Brescia株以外的所有病毒均可反应。病毒FLc-h6基因组RNA应含有一个唯一的BgIII位点，它位于E1基因内(见上)。为了检査该位点的存在，从被重组病毒FLc-h6或FLc-133(如上所述经PCR扩增的)感染的SK6细胞中使用VanRijn等人所述(1993,J.Gen.Virol.74:2053-2080)的引物分离出胞质RNA,并经Bg1II消化。事实上，FLc-h6的l,o9i个碱基对的扩增片段被Bgin切割，产生了590个碱基对和501个碱基对的片段，而FLc-133的扩增片段仍完整无损。实施例3用E1的缺失突变体来免疫猪构建并表达CSFVBrescia株E1的缺失突变体已有文献显示表达在昆虫细胞中的CSFVBrescia株缺少TMR的E1在猪体内可诱导对抗CSF的保护性免疫反应(HuIsteta1.,1993，J.Virol.67:5435-5442)。在E1的N末端的半部分中能诱导抗CSFV的中和抗体的两种相互区别的抗原性单位，A和B+C,也已确定(Wensvoort,1989,普通病毒学.70:2865-2876;VanRijnetal.1992.VetMicrobiol.33:221-230;VanRijnetal.1993普通病毒学74:2053-2060)。而且针对A区和B+C区的中和抗体在中和CSFV吋表现出协同作用(Wensvoort1989.普通病毒学70:2865-2876)。为了评价带有B+C区缺失或带有A区缺失的E1突变体的免疫原性，可在杆状病毒载体上制备出有关的构建体，并在猪体中检测所表达的突变体蛋白。表达E1突变体的杆状病毒的构建通过对野生型AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)的DNA,以及带有能表达某特定E1突变体的序列的转移载体pAcMo8的DNA进行重叠重组而完成。转移载体pAcMo8通过在pAcAs3上唯一的Bamill位点的第一个碱基(G)的5，直接插入一个T(胸腺嘧啶)而衍生自PAcAs3(Vlaketal.l990,Virology,179:312-230)，这样就产生了重叠在BamHI位点的第一个G上的ATG起始密码子。信使RNA由AcNPVplO启动子从插人Baml-Il位点的外源序列幵始被转录。编码E1突变体的序列是通过PCR扩增从插入pPRb2(VanRijnetal.1992,VetMicrobiol.33:221-230)的E1而衍生来的。为此构建了两个其序列中包含一个BamHI位点的引物。5，末端(有义)弓l物序列是5，-AGATTGGATCCTAAAGTATTAAGAGGACAGGT-3，(SEQIDNO.2)。引物中下划物序列与Brescia株序列中的2362-2381位核苷酸相同(Moormannetal.l990，Virology,177:184-198)，粗体字母指BamHI位点。3，末端(反义)引物在BamHI位点的邻位有一个终止密码子。该3'端引物序列是5'-TAGTCGGATCClTAGAATTCTGCGAAGTAATCTGA-3'(SEQIDNo■3)。此引物中下划线序列互补于Brescia株序列中的3433-3453位核苷酸(Moormannetal.，1990Virology177:184-198);粗体字母指BamHI位点，而斜体字母指终止密码子。扩增的序列被克隆进PAcMo8的BamHI位点，并用限制性酶分析来检査载体中的正确定向。正确的转移载体命名为PPAb11。在AcNPVDNA和pPAb11的DNA之间重叠重组，以及对表达E1的杆状病毒载体的选择和纯化均按文献所述进行(Hu1steta1.1993J.Virol67:5435-5442)。进一步在放射免疫沉淀试验中鉴定E1，以及用E1特异性Mabs鉴定E1也按Hu1st等人所述(J.Virol199367:5435-5442)进行。所得的重组杆状病毒表达无TMR的野生型BresciaEl(比较图3中从上往下数第二条杠)。这种缺TMR的E1可以从细胞中分泌出来(Hu1steta1.,1993J.Virol67:5435-5442)。从pPAb11的E1基因中缺失编码B+C区的区域可通过将pPAb11的NheI-Bg1II片段换成pPEh14的相应片段(VanRijnetal,1993J.GenViiol74:2053-2060)而完成，所得的转移载体命名为PPAb16。它含有在E1基因中从693位密码子至746位密码子的缺失。与此相类似，编码A区的区域也通过将pPAb11的Nhel-Bg1II片段换成pPEh18的相应片段(VanRijnetal.，1993，J.GenVirol74:2053-2060)而从pPAb11中缺失，从而产生转移载体PP.Ab12,pPAb12包括E1基因中从800位至864位密码子的一段缺失。按上述构建选择能表达缺失的E1的重组杆状病毒并对其表达产物进行了鉴定。4组(或2组)无特定病原体(SPF)的6至8周龄的猪，在第0天先用1ml含4AgEl(突变体)的水-油双乳剂进行肌内接种，第28天再用1ml含l5AgEl(突变体)的水-油双乳剂再接种(表2)。如上述构建含A区缺失或B/C区缺失的E1突变沐以及野生型E1,并用示于图5的构建体来详细说明。关于第0天的第一次接种，用的是被适当的重组杆状病毒感染的昆虫细胞的上清。上清中E1的含量按以前所述来校准(Hu1steta1.1993病毒学杂志67:5435-5442)。对第28天的再接种，我们从被感染的昆虫细胞上清中用免疫亲和层析纯化出E1((Hulsteta1.1993同上)。所有接种全且的猪，以及一组未接种的对照组猪(含两个SPF动物)用IOOLDs。的CSFVBrescia456610株经鼻内攻击(TerpstraandWensvoort1988Vet.Microbiol16:123-128)。该攻击剂量在无保护的猪体内引起急性病，该病的特点是从第3_5天开始发生高热和血小板减少，到第7天至l1天死亡。接种后第40,42,45,47,49,51，53和56天采集肝素化(EDTA)血样，并按文献所述(Hu1steta1.1993同上)分析血小扳和CSFV病毒。在第0，21，28,42和56天采集血清血样，并在CTB-ELISA(Wensvoortetal.，1988，VetMicrobiol17:129-140)和过氧化物酶联中和试验(NPLA,Terpstraetal.，1984VetMicrobiol9:113—120)中检验，以测定抗CSFV的(中和)抗体。CTB-ELISA检验的结果表示为标准信号的抑制百分比抑制<30%为阴性，抑制在30-50%为可疑，抑制>50%为阳性。NPLA滴度表示为在50%影印培养物中中和100TCIDs。的Brescia株的相应血清稀释度的倒数。逐日观察所有动物，着是否出现疾病的征兆，并测量体温。疾病的临床表现是发烧，厌食、白细胞减少，血小板减少和麻痹。实施例4在一种单克隆抗体基础上开发对CSFV的CTB-ELISA(CTB-DIF)对诊断试验的描述本实施例描述了一种CTB-ELISA(CTB-DIF),它是现有用2于检测CSFV特异性抗体的CTB-ELISA(Wensvoortetal，1955VetMicrobiol17:129-140)的修改方案。此CTB-DIF建立在以下发现的基础上，即被能表达E1-TMR的重组杆状病毒感染的SF21细胞能有效地分泌二聚体化的E1到培养基中。当被上述杆状病毒感染的细胞的培养基在非还原条件下经SDS-PAGE电泳后在Westernblot上进行分析就能检测这种二聚体化分引泌的E1。对E1特异性Mabs而言，在E1二聚体上存在两个拷贝的表位(每个单体上一个)。故与二聚体化抗原一起)E1特异性单克隆抗体能被用作捕获抗体而包被在微滴板小孔壁上，也可以用作与辣根过氧化酶(HRPO)偶联的检测抗体。CTB-DIF与在A区有缺失(见图5的构建体)的E1亚单位疫苗联合时是有效的，它还显示能区别两类CSFV特异性抗体，其一在经缺失A区的E1接种的猪体内产生，另一类在低毒力CSFV病毒株Heiiken,Zoe1en，SeTgen,331和Cedipest(EP-A-351901)感染的猪体内产生。4只SPF猪，编号为766,786,789和770,用含A区中一个缺失的E1突变体按实施例3所述方法(亦见于表2)进行接种，并在接种后第44天用有毒的CSFVBrescia株攻击。在接种后第28,42和56天采集血清并进行检验。在有4只SPF猪的小组中亦制备出了抗低毒力CSFV病毒株的血清。用病毒株Henken,Zoelen，Bergen,331感染的猪，在感染后第0，21，28和42天时采集血清并检验。用Cedipest接种的猪，在接种后第0,44,72和l70天时采集血清进行检验。用上述血清进行了三种不同的血清学试验。试验l是由Terpstra等人1984年(VetMicrobiol9:113-120)所述的过氧化物酶酶联中和试验(NPLA)，用来检测抗CSFV的中和抗体。试验2是CTB-ELISA(Wensvoortetal.，1988VetMicrobiol17:129-140),用来常规检测抗CSFV抗体。CTB—DIF用到了Mabb3(亦称为CVI-HCV—39.5)(Wensvoort1989J.GenVirol70;2865-2876)，它能识别位于CSFV的E1的A1区内一个表位。ELISA扳的孔均用Mabb3(1:2000稀释)(捕获抗体)来包fe经洗te，孔中加入偶联(HRPO)的Mabb3(1:4000稀释)(检测抗体)。感染了能产生E1-TMR并含有浓度为20Pg/ml的二聚体化E1的杆状病毒的sf21细胞培养基被稀释至l:500，并与待检血清(1:2.5稀释)一起预温。这种血清-抗原棍合物再被加人到包被好的ELISA扳小孔中的偶联物么温育后再次洗板上小L然后加色原-底物溶氣如果捕获Mab和偶联Mab均结合上了抗原，HRPO就会产生显色反应，说明受检血清CSFV抗体为阴性。如果抗原上的表位被受检血清中的抗体封闭，贝IJ偶联的HRPO就会被洗去，而小孔中仍清亮，说明受检血清中含有抗CSFVAl区的抗体。三种不同的血清学检验其结果见彭。用A区内有一缺失的E1接种的猪，其接种后第42天的血清确实在NPLA和CTB-ELISA中发生了反应，而不在CTB-DIF中反应。对同一只猪用有毒的CSFVBrescia株攻击，则接种后第56天(也就是攻击后第l2天)其血清在所有3种检验中均为阳性反应，说明攻击后出现了增强反仏用病毒株Henken,Zoelen,Bergen和331接种的猪其血清从感染后第21天开始在NPLA，CTB-ELISA和CTP-DIF中均为阳性反应。用Cedipest疫苗株接种的猪从接种后第44天幵始出现了同样的反应。因此，CTB-DIF应严格按所要求的进行，并适于伴有一种带突变的E1A区的CSFV标记疫苗，致使抗这个突变的A区的抗体不与Mabb3竞争属于Mabbb3的表位。CTB-DIF中用到的抗原是示于图5的二聚体化缺少TMR的野生型BresciaEl。不过由图5的"B+(:区缺失"构建体合成的二聚体化E1亦适于作为本试验中的一种抗原。实施例5以E1和E2为基础的用于CSFV的CTB-ELISA的比较本实施例描述了实施例4的CTB-DIF的一种修改试验，还描述了以CSFV的E2为基础的CTB-ELISA,并比较了这些ELISA与另三种检测针对E1的抗体的CTB—ELISA及NPLA(Terpstraetal.1984.Vet.Microbiol.9:113-120)的敏感性。实施例4的CTB-DIF，在表4至8中被称为E1-Bac-DIF,它用昆虫细胞(SF21细胞)中合成的完整的无TMR的E1作为抗原。修改后的E1-Bac-DIF，称为E1-Bac-dBC-DIF,用的是昆虫细胞(SF21细胞)中合成的缺失B+C区(对照图5)的无TMR的E1作抗原。正如Westernblot上所确立的，带有B+C区缺失的无TMR的E1是从细胞中以二聚体形式分泌出的(结果未显示)。El-bac-dBC-DIF试验如下进行37'C下，ELISA板的小子L用Mabb3(1:4000稀释)(捕获抗体)包被l6小B寸，然后洗涤。含20/ml二聚体化抗原El-dBC的培养基按l:50稀释，再与受检血清(1:2.5稀释)一起预温(37'C0.5小时)。该血清抗原复合物然后被加入到经包被的ELISA板上。37'C温育1小进后，各孔经洗涤，再加入偶联了HRPO(1:1000稀释)的Mabb3(检测抗体)。37'C温育1小时，各孔再洗涤,然后加色原--底物溶液。室温下显色反应l0分钟。对显色反应的解释与实施例4中的一样。表4至表8中所述的其他检测针对CSFVEl的抗体的CTB-ELISA分别是El-CSFVELISA,它用来自CSFV感染的细胞的天然El作为抗原(Wensvoortetal.1988.Vet,Microbiol,17:129-140);El-Bac和El-Bac-DIFELISA,用昆虫细胞中合成的无TMR的E1作为抗原；E1-CSFV和E1-BacELISA,用CSFVMabb3和b8(Wensvoort1989.J.Gen.Viol.70:2865-2876)分另'J作为捕获及检测用抗体；而E1-Bac-DIFELISA只用Mabb3,既作为捕获抗体又作为检测抗体；El-CSFVELISA严格按Wensvoort等人l988年所述执行(Vet.Microbiol.17:129-140)。E1-Bac及E1-Bac—DIFELISA则按上述E1—Bac-dBC—DIF的程序作如下修改后进行，在E1-BacELISA中所用的抗原是l:400稀释了的存在于SF21细胞培养基中的二聚体化E1,浓度为20/ml,而该SF21细胞是被相应的E1杆状病毒构建体(比较图5)感染了的细胞。在此ELISA中，偶联HRPO的Mabb8是检测抗体，用的是1:1000的稀释度。El—Bac-DIFELISA用与E1-BacELISA—样的抗原，但稀释度为l:200。该ELISA用HRPO偶联的Mabb3作为检测抗体，稀释度l:1000。E2-BacELISA使用SF21细胞中合成的CSFVE2抗原,此SF21细胞已被BacCE2构建体(Hulstetal.,1994.Virology200:558-565)感染。由于E2并不从受感染的昆虫细胞中分泌出来，故用的是这些细胞的裂解物。与E1相似，我们发现当在SDS-PAGE凝胶中以非变性条件分析感染细胞的裂解物时，大多数E2是二聚体化的(结果未显示)。以此E2抗原为基础开发的CTB-ELISA最好是联合应用Mabc5和c12(WensvooG.1989,InThesis,pp99-113,Utrecht)来进行。但也可以用只与Mabc5或只与Mabc12联合的E2。在竞争试验中Mabc5和Mabc12在结合E2这一点上相互抑制，这说明这些Mabs识别E2上的相同或重叠的表位(结果未显示)。E2-BacELISA按下述执行Mabc12稀释成l:1000并包被在ELISA扳的孔中(37'Cl6小时)，然后洗板，被BacCE2感染的SF21细胞的裂解物(1:1250稀释)与受检血清(1:1)—起在37'C预温半小时，该血清抗原复合物然后被加人包被板的孔中，37'C温育1小时，随后洗fe再与偶联HRPO的Mabc5(1:2000稀释)一起温育。37'O小时后再次洗板，再加人色原-底物溶液。显色反应室温下进行l0分钟。对显色反应的解释与实施例4中的一样。所有上述稀释均在NPLA缓冲液+4%PS(Terpstraetal,Vet.Miorobiol.9:113-120)中进行。表4中显示了3只用Cedipest疫苗接种的SPF猪的血清用上述各种CTB-ELISAS及NPLA分析所得的结果。血清是在接种后第O，16,23，30,37,44,50,72，113，141和170天收集后分析的。表5至表8显示了分别用低毒力CSFV病毒株331，Bergen,Henken和Zoelen感染的各含5只SPF猪的组中其血清经上述各种CTB-ELISA和NPLA分析的结果。血清是在感染后第O,10，14,17,24，28，35和42天时收集来分析的。从经Cedipest株接种的猪采集的血清从接种后第16天开始既在5种CTB-ELISA中反应又在NPLA中反应。在这个时间点上E2—BacELISA和E1—Bac—dBC-DIF的灵敏f生比其他3种CTB-ELISAS的若不是更高，也是一样高。从接种后第37天直至第l70天，所有血清在5种CTB-ELISA中和在NPLA中均有一致的反应(阳性)。被低毒力CSFV病毒株感染的猪的血清也在5种CTB-ELISA及在NPLA中有反应。从感染后第21天直至第42天，在5种CTB-ELISA和在NPLA中观察到的血清反应均一致，只有偶尔例外。需要对更多的低毒力病毒株感染动物的血清进行分析，看它们能否总结出在感染后的早期(直至第l7天)，5种CTB-ELISA的灵敏性之间是否存在显著性差异。我们可以得出结论E2-BacELISA和El—Bac—CTB-DIFELISA均按所希望的进行。因此E2-BacELISA适合于伴随一种CSFV^i己疫苗(如突变的或非突变的E1亚单位，在E2区内修饰了的C株銜己疫苗)，该疫苗不会诱导与本ELISA中的Mabs竞争的抗体。El-Bac-dBC—DIFELISA也象El-Bac-DIFELISA(实施例4中的CTB-DIFELISA)—样适于伴随一种带有E1的突变的A区的CSFV标记疫苗，从而使针对该突变的A区的抗体不会与Mabb3竞争Mabb3的表位。附图描述图l用于测定C株的核苷酸序列的cDNA克隆的图示。图lA表示第一轮cDNA克隆(见正文)。编号32，90和96的cDNA克隆被用于将pPRKf1c-113(见图3)的唯一的第一轮cDNA克隆。图lB表示第二轮的cDNA克隆(见正文)。编了号的第二轮克隆被用来构建pPRKf1c-l13(见SEQIDNo.1)。与C株基因组的核苷酸序列有关的cDNA位置均在图底部用比例尺线(千碱基对，Kb)表示。有关当前鉴定的CSFV基因，及它们在CSFV基因组中的组织形式的图示表示在图的顶部。在本领域的工作人员中有关瘟病毒蛋白的命名尚未统一。本文所述的E2蛋白亦被j^、为gp42(Tamuraetal.1993,病毒学，193:1-10)，gp44/48(Thieletal.,1991,病毒学杂志65:4705-4712)或EO(Rumenapfeta1.1993.病毒学杂志67:3288-3294).E3蛋白亦被称为gp25(Tamuraetal,1993,病毒学,193:1-10)gp33(Thieletal,,1991.病毒学杂志65:4705-4712),或E1(Rumenapfetal.1993.病毒学杂志67:3288-3294)。本发明的E1蛋白亦被称为gp53(Tamuraetal,,1993,病毒学193:1-10),gp55(Thieletal,1991,病毒学杂志65:4705-4712),gp51-54(Moormanneta1,,1990,病毒学177:184-198)和E2(Rumenapfetal.1993.病毒学杂志67:3288-3294)。CSFV的N末端自身蛋白酶lpr。(BVDV的p20,Wiskevchenetal,1991.病毒学杂志64:4508-4514)亦被称为P23，它由Thieletal在1981年(病毒学杂志65:4705-4712)所鉴定。对该蛋白酶中的在各瘟病毒之是保守的识别序列的切割导致产生C淋)的N末端(Starketa1.1993.J.Virol.67:7088-7095)。图2CSFV的病毒株Brescia,Alfort和C的5'(A)和3'(B)非编码区核苷酸序列的对比。除了最初l2个核苷酸外，Brescia株的5'非编码序列已由Moormanneta1.1990,Virology177:184-198描述。在此之前，Brescia株的5'非编码区的最初l2个核苷酸未见有人报mo象C株基因组的最终5'和3'序列一样，它们也用本专利申请的实施例l中所述的3'-5'RNA连接法来确定。Alfort^5'非编码序列除了开始9个核苷酸外，已由Meyerseta11989Virology171:555-567描述。Alfort株基因组的开始9个核苷酸由Meyers在题为"VirusderKlassischenSchweinepest:GenomanalyseundVergleichmitd柳VirusderBovinanViralenDiarrhoe"1990.Tubingen.Germany的论文中公布。Brescia株及Alfort株的3'非编码区序列分别由Moormanetal.1990.virology177:184-198和Meyers等，1989,Virology171:155-567描述。大ORF的起始密码子ATG和终止密码子TGA(参照SEQIDNo.1)均被下划线示出。图3全长cDNA克隆pPRKf1c-113的构建图示。在图l的i兑明中已解释了克隆的编号。克隆插人片段的融合位点用垂直线表示，相应于这些线的位点在图的底部示出。pOKI2。下划线的克隆数字表示具有pOKI2VieiraandMessing.1991.Gene100:189—194)衍生的载体序列(见图4)的cDNA克隆。pPRKf1c_113的5，和3，末端通过对cDNA片段的PCR扩增而特制成。(见实施例2)。扩增的片段均用PCR来表明。图底部的比例尺寸，及对CSFV的基因组成方式的图示，均被描述在图l的说明中。图4克隆pPRKflc-113,pPRKflc-133和pPRKflc-h6的载体序列和全长cDNA插入序列的图示。对载体pPRK,—种pPOKI2的衍生物(VieiraandMessing,1991,Gene,100:189-194)的夠建已在实施例2中描述。KanR，卡那霉素抗性基因；ORi复制起始点；'i,编码0-半乳糖苷酶基因的阻遏物的基因；PO,P-半乳糖苷酶基因的启动子/操纵子区；LacZ,能编码P-半孰糖苷酶的0!亚单位的3-半乳糖苷酶基因。对载体中的几个限制性位点，以及载体中直接位于全长插人序列侧面的序列，均已指明。相应位点已描述在实施例2中。pPRKf1c-113中的棒和数字对应于五个密码子的核苷酸。这五个密码子在此构建体中被更换，从而产生pPRKf1c-113。后一个构建体具有如SEQIDNO.1中所指示的序列。PPRKf1c-h6中的黑盒子表明PPRKflc-133的El区，它被Brescia株的对应区交换。衍生自特定的全长构建体的转录本是有感染性还是无感染性，这一点在构建体右侧作了说明。T7,T7启动子序列，全长构建体的插人序列均参照比例尺(千碱基对为单位)作了i兑明，它们代表示于SEQIDNo1中的C株核苷酸序列。图5在带一个杆状病毒载体的昆虫细胞中表达的E1蛋白突变体的图示。所有E1蛋白均由Brescia株的核苷酸序列编码(Moormannetal.，1990Virology177:184—198),而且在该序列的大ORF中668位密码子的赖氨酸上开始它们的N末端。天然E1的C末端是位于大ORF的l063位密码子的亮氨酸，而另三种E1的C末端均位于l031位氨基酸上。带点的框代表从668至689位氨基酸残基的N-末端信号序列，从806至826位氨基酸残基的内部疏水序列，及位于E1区内从l032至l063位氨基酸残基的C末端跨膜区(TMR)。带有缺失的B+<:或八区的￡1突变体中所缺失的氨基酸序列用代表这些蛋白的杆的中断来说明。与E1氨基酸序列有关的这些缺失的定位可从图底部的比较尺上确定。该比例尺说明了E1在由Brescia株的大ORF编码的氨基酸序列中的定位。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表2用E1的缺失突变^^对猪的预防接种<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>含4只(或2只)SPF猪的各小组在第O天以如g经修饰的El蛋白肌肉内，进行接种,在第28天时,种15tig经修饰的El蛋白，在第42天，用100LD50的CSF表3CSFV的区分诊断ELISA试验<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>)DPV:接种后的天数.；DPI:感染后的天数"NPLA滴度以在50^;影印培养物中中和100TCIDS0的HCVBrescia株的相库血清稀释度的倒数表示(Terpstra等人，1984，Vet.Microbiol..9:113-120)。"复^3捕获封闭ELISA即CTB-ELISA，或区分CTB-ELISA即CTB-DIF。试验结^^'i为对标准信号的抑制百分率抑制^OX为阴'性，抑制30-50%为可疑，抑制>50%为阳性。表4用CSFVCedipest株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>c:qTB-ELISA的EICSFV，El-Bac，ElHBac-DIF，El-Bac-dBC-DIF和E2-Bac均解释在实施例5中。试验结果均表示为标准信号的抑制百分争抑制<30%为阴性，抑制30-50%为可疑，抑制〉5(W为阳性。39表5用CSFV331株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表6用CSFVBergen株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>a^，c:见表4的脚注表7用CSFVHenken株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表8用CSFVZoelen株免疫的血清所做的各种CTB-ELISA试验的比较病毒株猪DPI'NPLAb_CTB-ELISAe_E1E1-BacE1-BacE仁BacE2-BacCSFVDIFdBC-DIF10"2.50000020"2.50500030<12.514400040196000050<12.516350190110<12.50168331210<12.50140015310<12.5010282410191280022510<12.50272712241141919601875214《12.543643410314《12.5192614231241425269140923951412.5050164101173761967691642171929946273031712.52341化4544173765978295051737489060750121150789510099842211968891009458213760739977042175759210095465213754NDNDND571282007510010010010022815076100100100893287577971001005642830079.97100100845281006710010010080135400821001001001003515072100100100913352008198100100604351508094100100775351007999100100891424008293100100100242200679910010078342400839410010084442300829910010086542150829410010032a.b.c:见表4的脚注序列表(1)—般信息(i)申请人(A)名称动物保健研究所(B)邮政信箱365(C)城市莱利斯塔德(E)国家荷兰(F)邮政编码8200AJ(G)电话31-3200-76611(ii)发明名称瘟病毒株的核苷酸序列，由这些序列编码的多肽及其在诊断和预防瘟病毒感染中的应用(iii)序列数3(v)本申请数据(A)申请号94201743.5(2)SEQIDNo:1的信息(i)序列特征(A)长度(B)类型(C)链型(D)拓朴(ii)分子型cDNA(v)片段类型完整序列(vi)原始来源(A)生物体典型猪瘟病毒C株(ix)特征(A)关键独有序列HTTCTmTnT对顿32酸链性核单线(B)位置12128-12140碱基(ix)特征(A)关键插人位点(B)位置883-884碱基(170-171氨基酸)(ix)特征(A)关键插入位点(B)位置2443-2444碱基(690-691氨基酸)(ix)特征(A)关键插入位点(B)位置2446-2447碱基(691-692氨基酸)(xi)序列描述SEQIDNo.1GTATACGAGGTCAGGGCCTCAAACGGAGGGCAGTCGTCAGATGCCAAGACGGAGTACGACCTGTACATGGTTAGTTCATTCCTCCAGCGAACTAGCCATATAGTTCGACGACACCTTAACCTGATAGGGCCACCTCG丁ATACACGGCCGAACTGTGGCGAGCTTGAGCAGAAGCCTAGCGGGGGCTGCAGAGGCGATTGGACAGGGCTAGCCACCCTGGGTGGCCCACCTC-GAGTCGCTAGGGCCCACTATTAAATCAAAATTTGCCCATAGTTCTAAGTCCTGATGCTACGTTGAAATCACAGGCTAGTATAATGGAGMetGlu1CCAATGProMetTTGLeuGGAGlyAATAsnGTGVal20CACHisGAGGluTTTPheGAAGluGAAGluCCGProCTTLeuGTGValTTALeuTACTyr25ATAATTTGGTAGGACTAGCAGAGTACAGGAGGACGAGGGCCCACGTGATGAAAATC丁C丁GTACAAATyrLys10GATGCCAspAlaACAAACAAAThrAsnLysACGGGGAGAThrGlyArg30CAAGin巧CCGProAAATTGLeu60120180240300360373421响TTCGGAPheGlyCATGATHisAspAGGAAAArgLys65ATATATlieTyrGACAsp35AGGArgGGCGlyGTAValCCGProGGTGlyGACAspAAALysAGTSerAGAArgTGCCysCCCPro85GAGGluGGCGlyAGGArg70GGCGlyGTAValAACAsnAGCSerCCTProCACHis40ATTlieGGCGlyGTCCCAProAAAAACAsnTTTPheCAATCAGinSerACAACAThrThrCATCTAHisLeu75TACCAGTyrGin90ACACTGAAGThrLeuLysCTGAAGAACLeuLvsAsn60'GGCCCGGTCGlyProValGACTACATGAspTyrMetCTALeuCTALeuAGTSerGGCGly95CCAProCCTProGGGGly80CCGPro517565613661GTCTACValTyrCATHisAGA100GCCAlaCCTProCTGLeuGAGGluTTTPhe105TTTGACPheAspGAAGTGCAGGluValGin110TTCPheTGCCys709GAGGTGGluValTACCATTyrHis13。AAGAGGLysArgACCThrl巧ACAThrAAALysTATTyrGGTGlyGAGGluAGGArgGTGValCCAProATAlieTGCCysAGAArg150GGTGlyATClie135ACCThrAGGArg120GATAspCTGLeuGTGValGGCGlyAAGACAGGTThrGlyTGCATACyslieTGGATTTrplie155AGCGACGGASerAspGly125CTGCTGAAGLeuLeuLys自AGAAATTTCArgAsnPheAAGLysCTGLeuACCThrCTTLeuGCCAl3GACAsp160757805853TGTCCACysProAAAGAGLysGluTTGLeuAAGLysTGGTrpAAGLys180GTT.Val165CCAProACCThrGATAspAGTSerAGGArgTGCCysATClieTCCSerAACAsn185GATGATAspAsp170AAAGGCLysGlyGGCGCAAGTGlyAlaSerAAATTAAAALysLeuLys190GGGGly175ATA工leAGTSerGCCAl3901州46CCAProATClieAAALysGTGVal210GAGGluGTGV3lCATHisGAAGluGAGGluGGAGlyAAGGTAValGACAspAAA2巧AGCSer200TACAGAArgCAGGinACTGTCV'alAGGArgAAALvsCCAPro2—20CCTPro205AAALysGACAspGGTGlyGCTAlaAAAACGThrGTTVal997IO化AAA225CCAProATAlieGGAGlyGAAGluGCAAlaAAGSerATTlieAATAsnAG(JArgATGMet260ACCThrAAG2巧TTGLeuCAAGin230AAALysTAC丁yrGACAspCTALeuCAAGinGGCGlyGAAGluCCAProCTGLeu雄LysGTTVal265TACTyrGCCAla250GAAGluCACHis235CTALeuGCCAlaAACAsnTTGLeuGAAGluAAG匕ysGCAAlaAATAsnAATAsnTGGTrpATAlie270AAAGCGAla255ACTThrCCAPro240GTGValCAAGin1093ll"lll的TGGTrpCTTLeuAACAsnAGAArg290CTGLeu275GGGGlyAGTSerGTTValGACAspAACAsnAACAsnAGAArgGGCGlyAGCSer295ACTThi、280T丁GLeuAATAsnCATHisGGTGlyGGGGlyATClieATClieCAGGinTGGTrp300CATHis285CCGProGCTAlaGGGGlyATGMetGAAGluTAC丁yrATAlie12371285TGCCys305ATAlieAAALysCAGGinGGAGlyGGAGlyGTCValATGMetCCAProATGMet325ACCThr310GA丁AspCACHisGCCAlaCTGLeuAGCSerGCCAl3GAGGluACAThrGGGGlv33bGACAsp3巧ACAThrGTGValAACAsnGAGGluTATCTGLeuACGThrAAA匕ysTGCCys335GAAGlu320TGTCysAAGTTACAGAGACATGAATGGAACAAACATGGATGGTGTAACTGGCACLysLeuGinArgHisGluTrpAsnLysHisGlyTrpCysAsnTrpHis3"0350133313811^)29AATAsnATAlieGACAsp355cccProTGGTrpATAlieCAGGinCTGLeu360ATGMetAATAsnAGAArgACCThrCAAGin365GCAAlaGACAspTTGLeu"77GCAAlaGAAGlu370GGCGlyCCTProCCGProGTCValAAG375GAGGluTGCCysGCTAlaGTGValACTThr380TGCCysAGGArgTAC丁yrGATAsp1525AAALys385GATAspGCTAlaGACAspATClieAACAsn390GTGValGTTValACCThrCAGGinGCTAla395AGA六rgAACAsnAGG六rgCCAProACAThr咖巧73ACCThrCTGLeuACCThrGGCGlyTGCCys405AAGLysAAAGGGGlyAAAAATAsn々10TTTPheTCTSerTTTPheGCGAlaGGTGly"巧ACAThr1621GTTATAGAGAGCCCATGTAATTTCAA.TGTTTCCGTGGAGGATACCTTGl卿V'allieGluSerProCysAsnPlieAsnValSei'ValGluAspThrLeu"20425，TATGGGGATCATGAGTGCGGCAGTTTGCTCCAGGACGCAGCTCTGTACTyrGlyAspHisGluCysGlySerLeuLeuGinAspAlaAlaLeuTyr435咖^5CTAGTAGATGGAATGACCAACACTATAGAGAATGCCAGACAGGGAGCAl怖LeuValAspGlyMetThi、AsnThi、工leGluAsnAlaArgGinGlyAla"0"55咖GCGAGGGT'GACATCCTGGCTCGGGAGGCMCTCAGAACTGCTGGGAAG血3AlaArgValThrSei、Ti'pLeuGlyArgGinLeuAi、gThrAlaGlyLys响"70"75咖AGGTTGGAGGGTAGAAGCAAAACCTGGTTTGGCGCTTATGCCCTATCGl臉ArgLeuGluGlyArgSerLysThi、TrpPheGlyAlaTyrAlaLeuSer485，"95CCTTACTGTAATGTAACAAGCAAAATAGGGTACATATGGTACACTAACl卿ProTyrCysAsnValThrSerLyslieGlyTyrlieTrpTyrThrAsn500505510AACTGCACCCCAGCTTGCCTCCCCAAAAACACAAAGATAATAGGCCCT1^7AsnCysThrProAlaCysLeuProLysAsnThrLyslielieGlyPro5巧520525GGTAAATTTGACACTAATGCAGAAGACGGAAAGATTCTCCATGAGATG2005GlyLysPheAspThrAsnAlaGluAspGlyLyslieLeuHisGluMet5305355"0GGGGGCCACCTATCAGAATTTCTGCTGCTTTCTCTGGTTGTTCTGTCT20^3GlyGlyHisLeuSerGluPheLeuLeuLeuSerLeuValValLeuSer545550555560GACTTCGCCCCTGAAACAGCCAGCGCGTTATACCTCATTTTGCACTAC2101AspPheAlaProGluThrAlaSerAlaLeuTyrLeulieLeuHisTyr565570575GTGATTCCTCAACCCCATGATGAACCTGAAGGCTGCGATACGAACCAG21^VallieProGinProHisAspGluProGluGlyCysAspThrAsnGin580585590CTGAATCTAACAGTAGAACTCAGGACTGAAGACGTAATACCGTCATCA21^了LeuAsnLeuThrValGluLeuArgThrGluAspVallieProSerSer595600605GTCTGGAATGTTGGTAAATATGTGTGTGTTAGACCAGACTGGTGGCCA22"ValTrpAsnValGlyLysTyrValCysValArgProAspTrpTrpPro610615620TATGAAACCGAGGTGGCTCTGTTATTTGAAGAGGTAGGACAGGTCGTATyrGluThrGluValAlaLeuLeuPheGluGluValGlyGinValVal62563063564048AAGLysGCAAlaCAGGinGGCGlyGATAsp705GAAGluTGCCysAGGArgTTALeuTCASerATClieCGGArg690GAGGluTAC丁yrGTGValTATTyrTTCPheGATAsp785AAGLysGTCValCCAProcccProGAGGlu77。GACAspGGAGlyTGCCysACAThrTTTPhe850GCCAlaACCThrGTGVal675CTALeuATAlieAACAsnGCAAlaTTGLeu755CTCLeuTTCPheAAGLysCCAProACTThr835CCGProTTALeuATTlie660CAAGinGCCAlaGGGGlyCACHisGGTGly7"0GCAAlaCTGLeuAGGArgCGGArg6"5GCAAlaGG丁GlyTGCCysCTALeuGATAsp725TCCSerTCASerTTCPheTCCSerTACTyrATAlie820CTGLeuCACHisAATAsn805GGGGlyAGAArgAGAArgGCGAlaTTCPheGTGValAAG匕ysCTTLeu710TTGLeuTTTPheTTGLeuGACAspGGGGly790ACGThrTGGTrpACAThrATGMetCTGLeuCTCLeuGTAValGAAGlu695GGGGlyCAAGinAAALysCATHisGGGGly775CTGLeuACCThrACGThrGAAGluGATAsp855AGGA丁Clie丁GGTrp680GATAspGCCAl3CTGLeuGTCV'alAAG了60ACCThrTGCCysTTGLeuGGTGlyGTG咖TGTCysGATAspTGCCys665CTGLeuTAC丁yrGGAGlyAATAsnACAThr7"5AAGAACAsnCCGProTTGLeuGTCVal825GTAValGTGValTTGLeu6f)0TTGLeuTTALeuAGGGGTGlyGACAsp730GCAAlaGCTAlaCCAProTTTPheAACAsn810ATAlieAAGACCThrACTAGG丁hL'ArgATAAAAlieLysCTAGTALeuValTACGCATyrAla700CTCACCLeuThr7巧GGGACCGlyThrC丁TAATLeuAsnTTACCCLeuProTCAACTSerThr780GATACGAspThr795GGTAGTGlySerGAGTGCGluCysACCTTCThrPheACCACAThrThr860GTCValGTAValACTThr685ATAlieACCThrGTTVslGTGValACTThr765GAGGluAGTSerGCTAlaACAThrAGGArg845GTGValTGGTrpTTALeu670GGGGlyTCGSerACCThrAAGLysGTCVal750TCCSerGAAGluCCTProTTCPheGCAAla830AGAArgGAAGluAATAsn655AGAArgGCAAlaTCASerAGCSerGGAGlyCAAGinACCThrTGGTrpGCCAla735AGTSerGTGValATGMetGTTValTAT丁yr8巧GTGValGACAspAATAsnAAGLys720AGTSerAGGArgACAThrGGAGlyGTTVal800CTTLeuAGCSerAAGLysGAAGlu23"1238924372"852533258126292677272527732821286929172怖GAT丁TAAspLeu865GAGCCAGluProGGCTTCGlyPheAAGTGCLysCysGACTGTAspCys93。TGCTTGCvsLeuTTGGGCLeuGlyCCTGTAProValAACAGGAsnArgAAGGGTLysGly1010TCAGATSerAsp1025GGAGGAGlyGlyGAACAAGluGinTTCPheGTGGACAspATT工le9巧AACAsnATClieCCTProAAGTACTyr995GAGGluTACTyrAGA六rgTATTyrGTCValTTCPhe900TTGLeuAGAGGTGlyATGMetAAALys,TAT丁yrTATTyrTTCPheTGTCysTAC丁yr885GATAspGCAAlaGATAspAACAsnCCAPro怖ACCThrGAGGluCAGGinAAG匕ys870ACAThrGGGGlyAATAsnGGCGlyACGThr950TGCCysTCCSerCCCProTTGLeuGGGGlyCCTProGAGGluGTTVal935AC.TAGAArgTGTCysGGGGlvGGGGlyGACAspACAThr920GTAValG丁CValCCTProACAThrAGGTACTyrGCAAlaGAAGlu1030TGGTrp1015TTTPheGACAsp1000TTTPheTATGTCCTGValLeu10^CTCGCCGCTGGTLeuAlaAlaGly,1060TGGTrpTTALeuG丁TValCTGLeuGGCCTALeuGGAGly905GGTGlyATClieAAGLysAAALysTTCPhe985AGCSerGACAspGTCValAACAsnGTAVal的OCTCLeuTACTyi、AGCSerGTGValGAGGlu970AACAsnTACCTGLeuTGGTrp875AAACCGProAGAArgACAThrCATHis955ATTlieTACACAThrCAAGinCATHisATAlieGAGGlu9"0GCAAlaGTCValACAThrTTCPheTGTCysTGTCysTACTyrGTAVal925GGGGlyTCASerTC丁SerAAACAGGinCAAGin1005GATAspGCGAla1020TTGLeuATAlieCCAProTTGLeuIO65GTGVal1050GGCGlyGTGGTGValVal1035ACCTACThrTyrACTThrGTAValGTAValGTGValAGAArgCCCPro910GATAspAGTSerGATAspAGTSerACTThr990TATTyrGACAspGCAAl3AAA匕ysTGGTrp的5ATAlieTCASerCATHisGAAGluGC丁Ala975TTGLeuATGMetCGCGGCCly880TGTCysGGTGlyACGThrGAGGluAGAArg卿GGAGlyAAGCTTLeuCACHisCTGLeuTTALeu1040GTTValCTAACALeuThr1055CAGGGTGinGlyGAGGTAGTGTTGGluValValLeu10703013306131093巧7320532533301334933973州3^9335413589ATAGGGAACTTAATTACCCATACAGACATTlieGlyAsnLeulieThrHisThrAsplie10751080GAGGTCGTAGTATA丁TTTGluValValValTyrPhe1085363750TTACTACTCTATTTGGTCATGAGGLeuLeuLeuTyrLeuValMetArg'10901095GATGAACCTATAAAGAspGluProlieLys1100AAATGGATALysTrplie3685CTGCTGLeuLeu1105GTGGCAValAlaCTGLeuTTGLeuTTCCATGCTPheHisAla1110CTCATGLeuMetGTTValATGMetAGTSerACTThrGGAGlyAACAATCCAAsnAsnProll巧GTTGCCValAla1130AAGLysGTCValGGTGlyAAGLysGGAGlyACCATAACAThrlieThr1120AAGATALyslie1135GATAsp37333781GGCGGTGlyGlyCTGACALeuThrTGGTrpCAGGinll"OGTTVall巧5ATAlieCGAArgGTAValCTGLeuGTCValCCGProGGGGlyGCTAlaACCThr11"AGCSerGTGVal1160A丁GMetTTGLeuTTTPheCTGLeuGACAspGCAAlaATClieAAGLys1165CAAGinl巧OAGAArgCTCLeuGATAspGCGCCGPro38293877ACTACTThrThr1170GTCValCCCProTTGLeuGTTValATAlie1175ACAThrGTGValGCAAlaCCCProCTGLeu1180AGGArgACAThrGCTAlaAAG3925ATGACTMetThr1185AACAsnGGAGlyCTTLeuAGTSer1190ACGThrGATAspATA工leGCCAlaATAlie1195GCCAlaACAThrGTGValTCASerGCA12003973GCGTTGAlaLeu■CTALeuACCThrTGGTrp1205ACCThrTACTyrATTlieAGTSerGACAsp1210TATTyrTACTyrAGAArgTACTyrAAG12巧ACCThr4021TGGCTATrpLeuCAGGinTACTyr1220CTTLeuATClieAGCSerACAThrGTGVal1225ACAThrGGTGlyATClieTTTPheTTALeu1230ATAlieAGGArg4069GTACTGValLeuAAG1235GGAGlyATAlieGGTGlyGAGGluTTGLeu1240GATAspTTALeuCACHisACTThrCCGPro12"ACCThr丁TGLeuCCAPro4117TCTCATSerHis1250AGAArgCCCProCTCLeuTTTPheTTCPhe1255ATTlieCTCLeuGTGValTACTyrCTTATTLeulie1260TCCSerACTThrGCAAla4165GTGGTAACAAGATGGAATCTGGACATAGCCGGATTGCTGTTGCAGTGTValValThrArgTrpAsnLeuAsplieAlaGlyLeuLeuLeuGinCys12651270127512804213GTCCCAACCCTTTTGATGGTTTTTValProThi、LeuLeuMetValPhe1285ACGATGTGGGCAGACThrMetTrpAlaAsp1290ATTlieCTCACCLeuThr12954261CTGATCCTCATACTGCCCACTTACLeulieLeulieLeuProThrTyr1300GAGT丁AACGAAGCTAGluLeuThrL、'sLeu1305TATTATCTTTyrTyrLeu13104309AAGGAAGTGLysGluVal朋AGGAT丁GGGGCAGAAAAGAi、glieGlyAlaGluLys1320GGCTGGTTATGGAAAACCAACGlyTrpLeuTi、pLvs丁ht、Asn1325'"357TTCAAGPheLys1330G丁ATACValTyrATGTTGMetLeu■TGGCAGTrpGinCTCCACLeuHisAGGCTALeuCCAProTTCPheGTAValTTCPheAACGACATAAsnAsplie1335CCGTCAProSer1350TTGLeuATClie1365ATAlie!380TATTyrAAGLys1395TCAAGASerArg1410CTTLeuAAGGTAValATClieGCCAlaAAACTALeuATAlieGCTAlaAAA匕ysGCCAlaCTGLeuGATAspTACTyrCAAGinATAlieTACTyrGAAGluAAG匕ysGTTGACCAAValAspGin13"0ACAAGTThrSer1355CTTLeuATClie1370TTGLeu14巧GAAGlu自OATClieTTGLeu1385ATAlieGAAGluATAlieGCAAlaGTCAGCSerTTTPheGGAGlyTCASerTGCCysGAAGluAATAsnGGGGlyGCTAl3ATGMetGTCValGTAValGGTGlyACAThrGAAGGGGluGlyGGCACCGlyThr1360AGTSerACCThr1405TCTSer1390AACAsnAATAsn1375TACTyrTGGTrp1420GCCTTTPheTTCPheGACAspAAGTACTyrATClieAACAsn咖5"014597GAAGAAGluGlul化AAAGAAGluGTTValCTGLeuAGGATClieGGTGlyTTGLeu1，ATCliel布AAA匕ysAAGl-ysCACHisAAGLysAAA丁TCPheTTCPheGTGValCTGLeu"35AGGArgAATAsnTTGLeuGAAGluTCTSerGTAValAGTSerATGMetAGGArgGTTVall咖GTCVal1455CGC4693一lTGGTTTGGTGACGAAGAGGTCTATGGGATGCCGAAGTTGGTTGGGCTATrpPheGly.AspGluGluValTyrGlyMetProLysLeuValGlyLeul咖14651"704789GTCAAGValLysGCA"75GCAAlaACAThrTTGLeuAGTSerAAALysl咖AATAsnAAACATHisTGTCysATTliel鄉TTGLeuTGCCysACCThr4837GTCTGTGAAValCysGluCGTTTTGGGArgPheGly1505GAGAAACACGluLysHisGACAspCCAProAGAArgCCAProGAGGluTGGTrp1"95ATGACCMetThr巧IOTATAAGAGGATCTyrLysArglie巧25AGAArg加TCysPheGGAGlyGGCGlyGAAGluACCThrTGCCCACysPro巧OOATGACCCTAGCCMetThrLeuAla15巧TTTAGAGAGGATCAAPheArgGluAspGin巧30AAALysGACAspTCASerTGCCysTTTPheGGGGlyGAAGlu巧20GAAGGGGluGly巧35娜54933柳iCCGGTTAGGGAGGAGTACPro、'alAi、gGluGluTyr巧"OGCAGGGTATCTGCAATATAGAGCCAGAGGGAlaGlyTyrLeuGinTyrArgAlaArgGly巧"5巧505029CAATTG丁TCGinLeuPheC丁GLeuAGGArgAATAsnCTCCCALeuProl讽GTGV'alCTALeuGCAAlaACAAAAThrLys1565GTCValAAGLysATGMet5077CTCCTGLeuLeu巧70GTCValGGCGlyAATAsnCTTLeuGGGGly1575ACGThrGAGGluGTGValGGAGlyGATAsp1580TTGLeuGAAGluCACHisCTTLeu5125GGCTGGGlyTrp柳GTGValCTTLeuAGAArgGGGGly巧90CCTProGCCAl8GTTValTGCCysAAGLys巧、95AAGGTCValACTThrGAAGluCATHis16005173GAGAAAGluLysGTTATGValMetTGTCysCCGProACCThrAGGArg1620ACAThr1605GGCGlyTCCSerACCThrATGMetACAThi、ATGMetCCTProGACAspAGA1625AAALys"10GCCAla丁TGLeuCCTProACTThrGTGV'alGCTAlaAGAArgTTTPheTTCPheTTCPhe16巧CCTProGGTGlyACCThr522152691630TCTCTCSerLeuTTALeu1635AAGATAlieAGAArgAGGArgGGTGlyl6"0TTGLeuGAAGluACTThrGGCGlyTGGTrp16"GCGAlaTAC丁yrACAThr5317C.ACCAAGGTGGCATCAGTTCAGTGGACCATGTCACTTGTGGAAAAGACHisGinGlyGlylieSerSerValAspHisValThrCysGlyLysAspI65O16605365TTACTG■LeuLeu1665GTAValTGTCysGACAspACTThr1670ATGMetGGCGlyCGGArgACAThrAGG1675GTTValGTTValTGCCysCAGGinTCASer16805413AATAATAsnAsnAAG匕ysATGMetACAThr1685GATAspGAGGluTCCSerGAGGluTATTyr1690GGAGlyGTTValAAALysACTThrGACAsp1695TCCSer"61GGATGCGlyCysCCGProGAAGGAGluGly1700GCTAl3AGGArgTGTCysTATTyr1705GTGValTTTPheAACAsnCCAProGAGGlu1710GCGAlaGTT5509AACATAAsnlieTCASer1715GGGACTGlyThrAAALysGGAGlyGCCAI31720ATGMetGTCVslCACHisTTALeuCAAAAAGinLys1725ACTThrGGAGly5557GGAGAATTCACCTGTGTGACAGCATCAGGAACTCCGGCTTTCTTTGATGlyGluPheThrCysValThrAlaSerGlyThrProAlaPhePheAsp1730173517^0CTTAAAAACCTTAAAGGCTGGTCAGGGCTALeuLysAsnLeuLysGlyTrpSerGlyLeu17"1750CCGATATTTGAGGCATCAProliePheGluAlaSer17551760565353AGTGGAAGGGTAGTCGGCSei、GlyArgValValGly1765AGG.GTCAAGGTCGGTArgValLysValGly1770AAGAATGAGGACTCTLysAsnGluAspSer17755701AAACCAACCAAGCTTATGAGTGGAATACAAACAGTTTCCAAAAGTACCLysProThrLysLeuMetSerGlylieGinThrValSei、LysSerThr178017851790AC/\GACTTGThrAspLeu1795ThrGAAGluATGMetGTAAAGValLys1800AAA乙ysATAlieACT丁hrACCATGThrMet1805AGCSerAGGArgGGAGly5797GAAT丁CGluPhe1810AGAArgCAAGinATAlieACCThrCT丁Leu血5GCTAlaACATlu、GGTGlyGCCAlaGGAGly1820AAALysACCThrACGThrGAAGlu，5CTCCCTAGGTCAGTCATAGAAGAGATAGGGAGGCATAAGAGAGTCTTGLeuProArgSerVallieGluGlulieGlyArgHisLysArgValLeu182518301835l咖5893GTCTTGValLeuATTlieCCTProCTGLeu1845AGGGCGAlaGCAAlaGCAAlaGAGGluI85OTCASerGTAValTACTyrCAAGinTAT丁yr1855ATGMet59^*1AGACAAArgGinAAACATHis1860CCAProAGCSerATClieGCAAlaTTTPhe1865AACAsnCTGLeuAGGArgATAlieGGGGly1870GAGGluATGMet5卿AAGGAALysGluGGGGlvGACAspATGMetGCCAlaACAThrGGGGly1880ATAlieACTThr丁AT丁yrGCTAlaTCASerl卿TACTyrGGTGlyTACTyr6037丁TCTGTPheCysCAGGinA丁GMetCCAProCAAGinCCTPro1895AAG丁TGLeuCGAArgGCCAlaGCAAlal卿ATGMetGTTValGAGGluTAC6O85TCCTTCSerPhel卿ATA工leTTTPheCTTLeuGATAsp1910GAGGluTACCACHisTGTCysGCCAla19巧ACCThrCCTProGAAGluCAAGinTTGLeu19206133GCTATCAla工leATGMetGGAGlyAAGLys1925ATTlieCACHisAGA六rgTTTPheTCASer1930GAGGluAACAsnCTGLeuCGGArgGTGVal1935GTGVal6181GCCATGAlaMetACCThrGCAACAAlaThr1,CCAProGTAValGGCGlyACGThr19"5GTAValACGThrACCThrACAThrGGGGly1950CAGGinAAAtys6229CACCCTATAGAAGAATTCATAGCCCCAGATGTGATGAAAGGGAAAGACHisPro工leGluGluPhelieAlaProAspValMetLysGlyLysAsp1955I96019656277TTAGGTTCAGAGTACTTGGACATTLeuGlySerGluTyt、LeuAsplie197b1975GCTGGATTAAAGATACCAGTAGAGAlaGlyLeuLyslieProValGlul卿6325GAGATGGluMet1985GTGGAGValGluAAGAGCAATATGLysSerAsnMet1，ACAGCAAAGThrAlaLys2005AAACTGLeuTTGLeuG丁TT丁TGTGCCCValPheValPro1995AAAGCTAAGLysAlaLys2010GGTGlyACCThrTATTyt、AGGAACATGGCAArgAsnMetAla2000AACTCAGGCAsnSerGly20巧TACTyr63736421TATTATTyrTyrAGTGGTSerGly2020GAGGluGATAspCCAProTCTAACSerAsn2025CTGLeuAGGArgGTGValGTAACAValThr2030TCGSerCAGGin6,TCCCCGSerProTACTyi、2035G丁GV3IGTGValGTGValGCAAlaACCThr20"0AACAsnGCGAlaATAlieGAAGluTCASer20^5GGTGlyGTTValACTThr6517CTCCCGLeuPro2050AGAATAArglie2065GACAspCGGArgTTGLeuCTGLeuGATAspGTGValGT丁Val2055TCASerCCTPro2070AAGLysGTCValATGMetGATAspCCCProACATTCPheGGGGlyCTTLeu2060ATAlie2075GTGValAAGLysACGThrTGTCysGGCGlyGAAGluCTGLeuAAGLysAAGLys208065656613AGAATGArgMetGCTAlaGTCACGThr2085ATTlieGGGGlyGAAGluCAAGinGCCAla2090CAGGinAGAArgAGGGGGGlyAGAArg2095GTTVal6661GGGAGAGlyArgGTAValAAG2100CC丁ProGGAGlyAGAArgTACTyrTAC丁yr2105AGGArgAGTSerCAAGinGAAGluACTThr2110CCCProGTTVal6709GGTTCTGlySerAAA21巧GATAspTACTyrCATHisTATTyrGATAsp2120TTALeuCTGLeuCAAGinGCAAlaCAGGin2125AGGArgTACTyrGGTGly6757ATTGAAlieGlu2130GATAspGGGGlyATAlieAACAsnATClie2135ACCThrAAATCCSerTTTPheAGA六rg2自GAGGluATGMetAACAsnTATTyr6805GATTGGAspTrp2145AGCSerCTTLeuTATTyrGAGGlu2150GAGGluGACAspAGTSerCTGLeuATGATTMetlie2155ACAThrCAAGinTTGLeuGAAGlu21606853ATTCTTlieLeuAATAsriAATAsnTTGTTGLeuLeu2165ATAlieTCASerGATAspGAAGlu2170CTACCALeuProATGMetGCAAlaGTAAAAValLys21756901AATATAATGGCCAGGACTGACAsn工leMetAlaArgThrAsp2180CACHisCCAGAAProGlu2185CCAATTCAGCTGGCGTACProlieGinLeuAlaTyr21906，AACAGCTACGAAACACAAGTGAsnSerTyrGluThrGinVal2195CCAGTG.CTAProValLeu2200TTCCCAAMATAAAGAATPheProLyslieLysAsn22056997<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>TTTGGGGGTPheGlyGlv2"3bGAATCAATAGCAGAC.CATGluSerlieAlaAspHis2^0GTCAAACAAGCGGCCACAGACValLysGinAlaAlaThrAsp测57717TTGGTCLeuVal2450GAGACAGluThrGCTCTAAlaLeuGTTValCAAGinGCTTACTyrCAAGinTATATCATCTyrlielie2^55GACGGAAspGly2470ACTThrTACTyi、2"85ACAThrAGGArgTACTyrAACAsn'AAAAAAAGAArgTTTPheAGCSerCC丁CAGTTCProGinPhe2460GTGGCCValAla2^75TGGTrp2，AATAsnAGCSerTACTyrCCAProCTALeuAATAsnGGAGlyCTGLeuAACAsnGACACGAspThrGCCTCAAlaSer2咖CTGLeu2495TCCSer776578137861AAGATALyslieGTTGAAGlu2500CCGProGCTAla丁TGLeuGCCAlaACTThr2505CTGLeuCCCPro丁ATTyrGCCGCCAls2510ACAThrGCTAla7909CTCAAALeuLysTTALeu25巧TTCPheGCCAlaCCCProACCThrCGA2520TTGLeuGAGGluAGCSerGTTGTCVal2525ATA工leTTALeuAGTSer7957ACCGCAThrAla2530ATC工leTAC丁yrAAAACCThrTACTyr2535CTALeuTCASerATClieAGGArgCGCArg25^)0GGAGlyAAAAGCSerGATAsp8005GGTTTGGlyLeu2545CTALeuGGCGlyACGThrGGGGly2550GTTValAGTSerGCGAI3GCTAlaATGMet2555GAGGluA丁ClieATGMetTCASerCAAGin256O8053AATCCAAsnProGTAValTCCSerGTGVal2565GGCGlyA丁AlieGCAAlaGTCValATGMet2570CTALeuGGGGlyGTAValGGGGlyGCCAla2575GTG8101GCAGCC■AlaAlaCACHisAATAsn258OGCAAlaATClieGAAGluGCCAlaAGTSer2585GAGGluCAGGinAAALysAGAACAThr2590CTALeuCTC乙eu81"ATGAAAMetLysGTCVal2595TTTPheGTAValAAGAACAsnTTCPhe2600TTGLeuGACAspCAGGinGCAAlaGCCAla2605ACAThrGATAspGAAGlu8197TTAGTCAAGLeuValLys2610GAGGluAGTSerCCTProGAAAAAGluLys26巧ATAlie雄lieATGMetGCTTTGAI3Leu2620TTTPheGAAGluGCAAl382化GTGCAGACAGTCGGCAACCCTCTTAGACTTValGinThrValGlyAsnProLeuAi、gLeu26252630GTATACCACCTTTATGGAValTyt,HisLeuTyrGly263526408293GTTTTTTATValPheTyrAAAGGGTGGGAGGCAAAALysGlyTrpGluAlaLys26巧GAGTTGGCCCAAGluLeuAlaGin2650AGGArgACAGCCThrAla265583"l57GGTAGGAACCTTTTCGlyArgAsnLeuPhe2660ACTTTAATCATGTTCThrLeulieMetPhe2665GAGGCTGTGGAACTGCTGGluAlsValGluLeuLeu26708鄉GGAGTAGACAGTGAAGGAAAGGTCCGCCAGC丁ATCAAGTAATTACATAGlyValAspSerGluGlyLysValArgGinLeuSerSerAsnTyrlie267526802685别37CTAGAGLeuGlu2690GAGATGGluMet2705CCGACGProThrCTTLeuGCAAlaGATAspTTGLeuATClieTATTyrGACAspAAGTTCLysPhe2695AGCSerTGG丁rp2710AGAArg2725ATAlieGCCAlaGGGGlyCGTArgCCTProCTCLeuGACAspGCCAlaCCCProAGTSerCCTProATCAAGlieLys2700TTCPhe27巧CAAGin2730GACAspAGTSerAATAsnTCTSerTGTCysTTCPheAGCSerGATAspCACHisGTGValTGGTrpAGGArgACAThr2720CAAGin2735GTGVal85338581GAGACGGluThrAAALysTGCCys2740CCCProTGTCysGGTGlyTACTyrAAGLys-27"ATGMetAAGLysGCAAlaGTTValAAG2750AATAsnTGTCys8629GCTGGAAlaGlyGAAGlu2755CTGLeuAGAArgCTCLeuTTGLeuGAGGlu276OGAGGluGAGGluGGTGlyTCASerTTTPhe2765CTCLeuTGCCysAGAArg8677AATAAATTCGGGAGAGGTTCACGGAACTACAGAGTGACAAAATATTATAsnLysPheGlyArgGlySerArgAsnTyrArgValThi、LysTyrTyr27702775278O8725GATGACAspAsp2785AACAsnCTALeuTTALeuGAAGlu2790ATAlieAAGCCAProGTGValATAlie2795AGAArgATGMetGAAGluGGGGlyCATHis28008773GTGGAAVslGluCTCLeuTACTAC2805AAGGGGGlyGCCAlaACCThrATC工le2810AAALysCTGLeuGATAspTTCPheAACAsn28巧AACAsn8821AGCAAASerLysCTGGTCLeuValACAThrATAlie2820AGGGTGArgVal2835TTGLeuCTCLeuGCAAlaAAGLysACCThrGATAspAGGCACHis2,AAA2825ACAThrTGGTrpGGGGlyGAGGluGCTAlaGTTValGGAGlyGATAspCACHis2830TATTyr28^CATHisTCCSerGGGGlyACTThrGCA88698917TACCTGGGCGAGAAATyrLeuGlyGluLys285OCCGProAACCACAsnHis2855AAALysCACHisC丁GLeuATAGAGlieGlu2860AGGGACAspTGTCys8965GCAACCATCACCAAAAlaThrlieThrLys2865GATAAGGTCTGTTTTAspLysValCysPhe2870CTCAAAATGAAGAGAGGGLeuLysMetLysArgGly287528809013TGCGCATTTACTTATGACCysAlaPheTlii、TyrAsp2885TTATCCCTTCACAACLeuSerLeuHisAsn2的0CTTACCCGAC丁GATTLeuThrArgLeulie2的59061GAATTGGTACACAAGAATGluLeu、'alHisLysAsn2，AACTTGGAAGACAAAGAGATTCCCGCTGCTAsnLeuGluAspLysGlulieProAlaAla290529109109ACGGTTACAThrValThr29巧ACCThi、TGGTrpCTGLeuGCTTACAlaTyr2920ACAThrTTTPheGTAValAATGAAAshGlu2925GATAspATAlieGGGGly9巧7ACCATAThrlie2930AAALysCCAProGCCAl3TTCPheGGGGly2935GAGGluAAAGTAValACGThrCTGLeu29^40GAGGluATGMetCAGGinGAGGlu9205GAGATAGlulie29"ACCThi、TTGLeuCAGGinCCTPro2950GCTAlaGTTValGTGGTGValGATAsp2955ACA丁hrACAThrGACAspGTAValGCCAla29609253GTGACTValThrGTGValGTAValGGGGly296^5GAAGluGCCAlaCCCProACTThrATGMet2970ACTThrACAThrGGGGlyGAGGluACAThr2975CCGPro9301ACAGTG丁hrValT丁CPheACCThr2卿AGCSerTCASerGGTGlyTCASerGGCGly2985CTGLeuAAAAGCSerCAAGinCAAGin2，GTTValTTGLeuAAACTALysLeuGGGGTAValGGTGlyGAAGluGGCGlyCAAGin，0TATTyrCCAProGGGGlyACTThrAATAsn3005CCAProCAGGinAGGArg9397GCAAGCAlaSer3010CTGLeuCACHisGAAGluGCCAlaATAlie30巧CAAGinGGTGlyGCAAlaGATAspGAGGlu3020AGGArgCCCProTCGSerGTGVal9布CTGATA■Leulie3025丁TGLeuGGGGlyTCTSerGATAAAAspLys3030GCCAlaACCThi、TCTSerAATAGAAsnArg3035GTGValAAGL5'sACTThrGCAAla州3AAGAATLysAsnGTAValAAGLysGTAVal，5TACTyrAGAArgGGCGlyAGGGACAsp3。50CCACTAProLeuGAAGluGTGValAGAArg3055GATAsp柳ATGATGMetMetAGG六rgAGGGGAArgGly3060AAGATClieCTGLeuGTC3065GTAValGCCCTGAlaL-euTCTSerAGGGTTArgVal3070GATAsp9589AATGCTCTATTGAAATTTGTTGACTACAAAGGCACCAsnAlaLeuLeuLysPheValAspTyrLysGlyThi、30753080TTTCTAACTAGGPheLeuThrArg3085顺GAGGCCCTAGAGGCATTAAGTTTGGGCAGGGluAlaLeuGluAlaLeuSerLeuGlyArg30903095CCTAAAAAG.AAAAACATAProLysLysLysAsnlie310059ACCAAGGCAGAAGCG"GTGG丁hrLysAlaGluAlaGinTrp31053110TTGCTGTGCCCC'GAGGACCAAATGGAALeuL>euCysProGluAspGinMetGlu311531209733GAGCTACCCGACTGGTTCGCAGCCGGGGAACCCATT丁TTTTAGAGGCCGluLeuProAspTrpPheAlaAlaGlyGluProliePheLeuGluAla3125313031359781AACAsnLysATT工leGAAGluAAACATLysHis，0AAALys3155GCCAl3GACAspAAALysAGGArgCAGGinTACTyrCATCTGHisLeu3i"5TTGLeuGGGGly3160GCTAlaG丁GValACAThrGGGGlyGACAspGATAspTCCSerATAlieACAThr3165GCTAla3巧0AAGACCThrATAlieATClieTCTSer98299877AAGGAGGlu3170GTTValGGTGlyGCTAlaAAAGTGVal3175TAT丁CTSerA丁GMetAAAC丁GLeu3180AGTSerAATAsnTGGTrpGTGVal9925ATGCAAMetGin3185CTCCTGLeuLeuGTCTCTValSerGAAGluCAAGinGCTAlaGAAGluCAGGinAATAsnAAALys3190TACTyr3220TGTCys3205CAAGinCCAProCTALeuCAGGinCCCProGGCGlyGGGGlyGCTAl3CAAGinAATAsnGGCGlyCTGLeuCAGGin3210ACCThr3195AACAsnGGGGly3225AACAsn丁GGTrpCCCProAAAATGMetTTG1-euACT丁hrCCGProTTTPheGAAGluGCAAlaCACHis3215GAGGlu3200ATGMetACCThr323OAGCSerTGCCys997:1002110069CATGTTHisValTTCPhe3235TACGAATyrGlu3250GCAAlaATGMetTAC丁yrGGGGlyGTTValACCThrAAGGTAValTTALeu3255丁CTSer32"0AGGArgGCCAlsGAGGluAGGArgTTGLeuAGAArgGTAValThrAAG3245GAGGlu3260GAGGluACCThrCACHisCACHisAAGLysCCAProATGMet1011710165AAAACALysThr3265ATTGGAlieGlyCTGLeuAAALysTGTCysATTlieCCCProGGAGly3270AAATACLysTyr3285TCASerCAGGinAGCSerGGAGlyCTGLeuAACAsnGGTGlyCTGLeu3290AGGCACArgHis3275AGGACCArgThrAACAsnAAAGATAspCACHisTGGTrpATGMet3295ATAlie3280TTGLeu1021310261AACCCCGGCAAGGTGGCAGAGCAACTGTGCAGAGAGGGACACAGACACAsnProGlyLysValAlaGluGinLeuCysArgGluGlyHisArgHis33003305331010309AATGTGTATAACAAGACAATAAsnValTyrAsnLysThi、lie33巧AGCTCAGTASerSerVal3320ATGACAGCTACTGGTATCMetThrAlaThrGlylie332510357AGGTTGGAGAAGTTGCCCGTGGTTAGGArgLeuGluLysLeuProValValArg3330'3335TTCCACCAAGCAATAAGGGATAAGATAPheHisGinAlalieArgAspLyslie33^53350GCCCAGACAAlaGinThr，0GACAAGAspLys3355GAAGluGACAspGAGGluCCAACCAACProThrAsnAACCTACAAAsnLeuGin336010一10453ACCCCGThrProCGACCCArgProGGTGlyGAGGluTTACATLeuHis3怖TTALeu3380GAGGluAAGLysTCCSerAAATCCSerTTALeuTACTyrA丁GMetGACAsp3385GAAGlu3370GCCAlaG丁TvaiGTGT丁CPheGluAACAsnTGGTrpGCATTGAlaLeu3375GAGGlu3390GAAGluAAALysCTGLeu10501105^9GAGAGAGluArgGGAATAGlylie3395AACAsnAGGAAGGGTGCTGlyAla■3"GCTAlaGGTGlyTTTPheTTCGAAPheGlu3405CGCArgAAALys10597AATATAAsnlieGGGGly"10GAAGluATA工leTTGLeuGATAsp3"巧TCASerGAGGluAAALysAATAsnAAA^20GTCValGAAGluGAGGluATTlie10645ATTGAClieAsp3"25ATCCCA工leProGATTTCAspPheAATAsnAAGGTGValAAAACALysThrCTGLeuAATAsnAAALysGAGGluAAA3"。AAGGACAsp3"60GAGGluAAGCCAl^sPro3"90AGAArg3"75GTAValCTGLeuG丁TValGCCAlaATAlieAAGATClieCCCProGGTGlyAGGArgAAAAGAGACAspCC丁ProAACAsnGTCValATTlieAAALa'sACCThrAAG匕ys，0AGAArgGTGvaiAACAsn3450GTCValGGGGly州5TATTyrGAAGluATGMetGGGGlyGATAspATAlieTATTyrAAGLysTATTyrGACAspCAAGinAAGLysTATTyrTGGTrpGAAGluACCThrACCThrGCGAla3咖GCCAla3巧5TACTyrCCTPro3"70TCGTrp3"85ACACCTThrPro3500GTGValCTALeuGAAGluAAGLysTTCPheGGTGlyGCAAlaCAGGinCAAGin10693107"IO7891083710885ATTTTTliePhe3505GACAspAAAG丁AValAAGAAGL^'sLys3510GAATGGGATCAATTTCAAAATCCAGTGGluTrp.AspGinPheGinAsnProVal3515352010933GCAGTGAGCTTCGACACTAAGGCGTGGAlaValSerPheAspThrLysAlaTrp3525GACACCCAGGTAACCACAAAAAspThi、GinValThrThrLys35303535IO卿GATTTGGAGCTGATAAGGGACATAAspLeuGluLeulieArgAsplieCAAAAGTATTATTTCGinLysTyrTyrPhe别5AAGAAGAAALysLysLys355011029TGGCACAAATT丁ATTGACACCCTGACC丁rpHisLysPl，elieAspThrLeuThi、35553560ACGCATA丁GTCAGAAG丁ACCCThi、HisMetSerGluValPro356511077GTGATCAGTGCTGATGGGGAAGTATACATAAGGAAAGGGCAAAGAGGCVallieSerAlaAspGlyGluValTyrlieArgLysGlyGinArgGly35703575358011125AGTGGASerGly姚CAAGinCCTProGACACAAspThr3590AGTSerGCGAlaGGCGlyAACAGCAsnSer3595ATGMetLeuAsnGTCTTAValLeu36001U73ACAATGThrMetGTTValTACTyrGCCAla3605TTCPheTGCCysGAGGluGCCAlaACAThr3610.GGAGlyGTAValCCCProTACTyrAAGLys36巧AGCSer11221TTTGACPheAspAGGGTG3620GCAAlaAAAATTlieCATHisGTG、'3l3625TGCCysGGGGlyGATAspGA丁AspGGCGly3630TTCPheCTGLeu11269ATCACAlieThrGAAGlu3635AGAArgGCTAlaCTCLeuGGTGlyGAGGlu，0AAATTTPheGCAAlaAGTSerAAG36々5GGAGlyGTCValCAGGin11317ATCCTTlieLeu3650TAT丁yrGAAGluGCTAlaGGGGlyAAG3655CCCProCAGGinAAGATClieACTThr3660GAAGluGGGGlyGACAspAAAll怖ATGAAAMetLys3665GTGValGCCAlaTACTyrCAAGin3670TT丁PheGATAspGATAspATTlieGAGGlu銜5丁TTPheTGCCysTCCSerCATHisACAThr柳O11413CCAATAProlieCAAGinGTAValAGA3685TGGTrpTCASerGATAspAACAsnACTThr3690TCTSerAGTSerTAC丁yrATGMetCCGPro3695GGGGly11461AGAAATArgAsnACAThrACCThr3700ThrATClieCTGLeuGCAAlaAAG3705ATGMetGCCAlaACGThrAGGTTALeu3710GATAspTCCSerAGCGGTGAAAGGGGTACCATAGCATATGAGAAAGCAGTAGCATTTAGCSerGlyGluArgGlyThrlieAlaTyrGluLysAlaValAlaPheSer37巧372037巧TTCCTGCTGPheLeuLeu3730ATGMetTAC"Tyr丁CCSerTGGAACTrpAsn3735CCAProCTALeuATTlieAGA'AGGArgArg■ATClieTGCCysTTALeu11605CTGGTGCTATCAACTGAACTGCAAGTGAAALeuValLeuSerThrGluLeuGinValLys37^53750CCAGGGAAGTCAACTACTProGlyLysSerThrThr3755376011653TACTATTATTyrTyrTyrGAAGGAGACCCGATATCTGluGlyAspProlieSer3765GCCTACAAGGAAGTCAlaTyrLysGluVal3770ATCGGClie'Gly37751170162CACAACCTTTTTHisAsnLeuPhe3780TTAAATCTTLeuAsnLeu3795AAAAGA3810TGGCTATrpLeu3825TACATATyrlieCTGGTGLeuValCTALeuGTCValCCCProAGCSerC丁ALeuAATAsnGATAspATGMetCAAGinCTTAAGAGAACALeuLysArgThr3785TCTGTACTCSerValLeu3800GAC丁GTAspCys38巧GCAAlaGACAsp奶OAGAArgGGAGlyGAGGlu3,T丁GLeuGCAAGAAlaArg3860TACAACTyrAsnCTAGGCCCALeuGlyPro3875GGTGlyAAALysATAlieCACHisCAGGinGTCV3ICTALeuACCThrGGGGlyAATAsnGTAValAGCSerGCCAlaATAlie丁丁TPheTGGTrpGAGAAGCTGGluLvsLeu'3790ACTAGAThrArg3805GCTGlyGTTVal3820AGTSerCTGLeuCAAGin3850AGCAAGSerLvs3835GGAAGAGlyArgAAALysACCThrCATHisCACHisGAGGluGGGGlyGCCAlaACCThrGGCGlyAAGLysAGTSerAATAsnAATAsnAGGArg，0TATGAAGAAGluGlu3855ATClieAACAACAsnAsn3865TTTCAAPheGinGGGACAGACAGGGlvThrAspArg3870GTCAACATGGTGValAsnMetVal柳OTTAAGGAGGCTGAGAGTCLeuArgArgLeuArgVal3885ATGATGATGACGCTGMetMetMetThrLeu鄉OATAGGGAGAGGGGCAlieGlyArgGlyAla3895'117"911797118化11893il卿1203712067TGAGCGCGGGTAACCCGGGATCTGAACCCGCCAGTAGGACCCTATTGTAGATAACACTAA1212了TTTTCTTTTTTTTCTTTTTTATTTATTTAGATATTATTATTTATTTATTTATTTATTTAT12l8"7TGAATGAGTAAGAACTGGTATAAACTACCTCAAGTTACCACACTACACTCATTTTTAACA1224了GCACTTTAGCTGGMGGAAAATTCCTGACGTCCACAGTTGGGCTAAGGTAATTTCTAACG1230了GCCC1231163(ii)分子型DNA(v)片段类型引物序列(vi)原始来源合成(ix)特征(A)关键与典型猪瘟病毒Brescia株的2362-2381核苷酸相同的序列(B)位置13-32碱基(ix)特征(A)关键BamHI限制性位点(B)位置6-11(xi)序列描述SEQIDNo.2AGATTGGATCCTAAAGTATTMGAGGACAGGT32(i)分子型DNA(3)SEQID(i)序列特征(A)长度(B)类型(C)链型(D)拓朴(4)SEQID(i)序列特征(A)长度(B)类型(C)链型(D)拓朴No:2的信息32碱基对No:3的信息35碱基对酸链性核单线酸链性核单线(v)片段类型引物序列(vi)原始来源合成(ix)特征(A)关键与典型猪瘟病毒Brescia株的3433-3453核苷酸相同的序列(B)位置15-35碱基(ix)特征(A)关键BamHI限制性位点(B)位置6-11碱基(ix)特征(A)关键终止密码子(B)位置12-14碱基(xi)序列描述SEQIDNo.3TAGTCGGATCCTTAGMTTCTGCGAAGTMTCTGA3权利要求1、对应于典型猪瘟病毒(CSFV)基因组或其部分或其突变体的核苷酸序列，其特征在于它包括示于SEQIDNO1的CSFVC株核苷酸序列的至少一部分，或者这种核苷酸序列的互补序列或相应的RNA序列。2、对应于典型猪瘟病毒(CSFV)基因组或其部分或其突变体的核苷酸序列，其特征在于它包括至少编码SEQIDNO:l的268-494位氨基酸序列的核苷酸序列，或者这种核苷酸序列的互补序列或相应的RNA序列<3、根据权利要求l或2的核苷酸序列，在编码SEQIDNO:1的1-1063位氨基酸的核苷酸序列中包含一个突变。4、根据权利要求3的核苷酸序列，在编码690-870位氨基酸的核苷酸序列中包含一个突变。5、根据权利要求l至4中任一项的核苷酸序列，其中所述的突变是由其他瘟病毒株基因组的对应部分的取代。6、根据权利要求l至4中任一项的核苷酸序列，其中所述的突变是缺失，插入或导致一个或多个由该核苷酸序列编码的氨基酸被取代的突变。7、根据权利要求l至4中任一项的核苷酸序列，其中所述的突变是异源核苷酸序列的插人，其改变了CSFV核苷酸序列的翻译策略或改变了对由该CSFV核苷酸序列编码的多肽的加工。8、根据权利要求l至4中任一项的核苷酸序列，其中所述的突变是异源核苷酸序列的插入，该外源序列编码的多肽能诱导对其他病原体的免疫九9、根据权利要求l至4中任一项的核苷酸序列，其中所述的突变是编码一个丰斜己多肽的异源核苷酸序列的插入。10、由权利要求l至9中何一项的核苷酸序列所编码的多肽。11、对应于SEQIDNO:l的690-1063位氨基酸序列的瘟病毒多肽或其部分，其特征在于它在位于691-750位或785-870位氨基酸序列的一个表位中带有一个突变，该突变改变了该表位。12、编码权利要求l1的多肽的核苷酸序列。13、疫苗株，其基因组衍生自权利要求l至8中任一项所述的核苷酸序列的全长DNA拷贝，和/或该拷贝的感染性转录本。14、包含权利要求l至9或l2中任一项所述的序列的多核苷酸，权利要求l0或l1的多肽，或权利要求l3的疫苗株的疫苗。15、诊断组合物，至少含有权利要求l至9中任一项所述的核苷酸序列，权利要求l0或l1的多肽，和/或抗权利要求l0或l1的多肽的抗体。16、核苷酸序列ttttcTTTTTTTT作为csfvc株衍生序列的标记的应用。17、区分经瘟病毒感染的动物与经预防接种的动物的诊断方法，所述的经预防接种的动物被接种在SeqIDNO:l的268-494位或690-1063位氨基酸序列中含一个突变的瘟病毒多肽或瘟病毒株，其中受检样品与对应于268-494位或690-1063位氨基酸序列或其部分的瘟病毒抗原相接触，并与抗该瘟病毒抗原的一个表位的抗体相接触，其中该表位在用于接种的突变的多肽或瘟病毒株中无功能。18、根据权利要求l7的方法，其中所说瘟病毒抗原是二聚体化或多聚体化多肽，而所述抗体的一部分被固定而另外的部分被标记。19、根据权利要求l7或l8的方法，其中所述瘟病毒多肽和所述抗原对应于690-1063位氨基酸序列，而所述表位则位于785和870位氨基酸之间。20、测定样品中能与结合配对物的结合位点特异结合的试验物质存在与否的方法，此方法通过将所说试验物质与可测剂量的能与所述结合配对物的相同结合位点特异结合的参照物质竞争而进行，该方法包括(1)用以下物质与所述样品接触(a)上述参照物质的结合配对物，所述结合配对物分子含有至少两个相同的针对上述参照物质的结合位点，(b)结合在固相载体上的所述参照物质，及(c)带f射己的所述参照物质；(2)测定所述标记物与所述载体的结合程度。21、根据权利要求20的方法，其中所述结合配对物是针对所述参照物质的结合配对物二体或多聚体。22、测定样品中是否有下述试验物质的方法，所述受检物质的每个分子至少具有两个相同的结合位点以与结合配对物特异性结合，此方法包括(1)用以下物质与所述样品接触(a)结合于固相载体的所述结合配对物，及(b)带标记的所述结合配对物物质；(2)测量所述标记物与所述载体结合的程度。23、诊断试剂盒，包括(a)结合于固相载体的一种参照抗体，(b)带标记的所i兑参照抗体，及任选的(c)所述参照抗体的一种抗原，它带有至少两个相同的针对所述参照抗体的结合位点；或包括所述组分(a),(b)和(c)之间的复合物，或进一步包括进行竞争免疫学试验所必需的其他组分。全文摘要本发明提供了对应于典型猪瘟病毒(CSFV)的基因组或其部分，或其突变体的核苷酸序列，它包括示于SEQIDNo.1的CSFVC病毒株的核苷酸序列的至少一部分，或者此核苷酸序列的互补序列或RNA对应序列，或者包括至少编码SEQIDNo.1的268-494位氨基酸序列的核苷酸序列，或者此核苷酸序列的互补序列或RNA对应序列。本发明还提供了对应于SEQIDNo.1的690-1063氨基酸序列的瘟病毒多肽或其一部分，它在位于691-750或785-870位氨基酸序列内的一个表位上有一个突变，该突变改变了该表位。本发明还提供了测定样品中能与结合配对物的结合位点特异结合的试验物质存在与否的方法，此方法是通过将所说试验物质与可测剂量的能特异地结合到上述结合配对物的同一结合位点上的参照物质竞争而实现，此方法包括(1)将所述样品与(a)结合于固相载体的所述参照物质，(b)所述参照物质的结合配对物，该结合配对物分子带有至少两个与上述参照物质相同的结合位点，和(c)有标记的所述参照物质接触；(2)测定所述标记物与所述载体的结合程度。文档编号A61P31/12GK101255433SQ20071016987公开日2008年9月3日申请日期1995年6月16日优先权日1994年6月17日发明者彼德鲁斯·安东尼厄斯·范赖恩,罗伯特斯·雅各布斯·玛丽亚·莫尔曼申请人:动物保健研究所