专利名称：氨基葡糖和从微生物质中制备氨基葡糖的方法
技术领域：
本发明涉及氨基葡糖組合物和制造氨基葡糖组合物的方法。
背景技术：
氨基葡糖是已被证明可明显治疗性减轻关节炎和关节痛的营养补 剂(nutraceutical supplement)。尽管机制尚不完全清楚，但相信 氨基葡糖的功能是帮助恢复软骨以减轻关节的炎症，因此对病人有明 显的益处。
目前，氨基葡糖基本来源于获取的天然原料，例如甲壳类动物和 其它水生生物。用不同的生产技术把这些生物的壳和外骨骼组分转化 成氨基葡糖。对一些应用来说可以用这些天然原料生产氨基葡糖，但 是它们是有些限制的。这些限制包括野生甲壳类由于天然生长在不受 控制的环境中使得它们在组分上有明显变异。甲壳类动物根据生长条 件及其品种在其大小和组分上有差异。同样，在没有控制的生长条件
下，甲壳类动物暴露在环境污染中，包括重金属，它将滞留在氨基葡 糖或其它从甲壳类动物生产的产品中。曱壳类动物的收获经常是季节 性的，因此甲壳类动物的供应和价格会因时间明显变化。
对来源于甲壳类动物的氨基葡糖的进一步忧虑是很大一部分人群 对甲壳类动物过敏并且不能使用包含来自甲壳类动物成分的产品。经 过高度处理的材料，例如氨基葡糖，如果适当制备就不会产生任何过 敏的危险；但依然忧虑是高度过敏的个体甚至对来源于天然曱壳类动 物的微小痕量过敏原仍会过敏。即使如果不存在这种过敏原，来源于
甲壳类动物的氨基葡糖也会引起某些对甲壳类动物过敏个体的忧虑， 因为这些个体消费者不一定知道是否所有的过敏原均被去除。
跟甲壳类动物来源的氨基葡糖现有来源相关的另一个问题是一些 甲壳类动物的供应是从世界上的大海或大洋中收获的。过度捕捞甲壳 类动物对环境会有很大的负面影响。因此，相信某些消费者更喜欢使 用那些不是捕撈自海洋生命的氨基葡糖。即使如果捕捞甲壳类动物对 环境的影响不是负面的，仍担心年年野生甲壳类动物供应数量上的限 制和数量不一致的限制。
因此，就要建立安全的、 一致的和高质量的氨基葡糖来源，它是 经济的并且对环境的影响是最小的。
发明内容
本发明涉及氨基葡糖，包括适合于人或动物用(consumption) 的含有氨基葡糖的材料。本发明的氨基葡糖来源于包含几丁质的发酵 的真菌生物质。适合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如 来源于曲霉属(J^7erg///i^ s/7.)、 青霉属(尸e/7/c/77/"/7 M.)、毛霉属(M/cor ".)的真菌源和它们的组合。真菌生物质的 使用产生高质量的产品，其通常产生仅有低水平的杂质的相同的氨基 葡糖。本发明的氨基葡糖通常有相对低的灰分含量，和低的重金属含 量。除此之外，做为真菌生物质产品，所述的氨基葡糖不会对那些对 甲壳类动物过敏的人产生危险。
本发明也涉及通过发酵的真菌生物质的酸水解来产生氨基葡糖的 方法。从微生物质得到氨基葡糖的方法包括在酸性溶液中反应包含几 丁质的生物质，特别是在升高温度下，在酸中反应包含几丁质的生物 质。
从本发明详述和权利要求书中可明显看出本发明别的其它特征和 优点。上面公开内容的原则概述不是描述本公开内容的每一个说明的 实施方案或每一个实施例。下面的详述部分利用这里公开的原则对某 些实施方案进行更具体地举例说明。
参照下面的附图更全面地解释本发明，其中
图1中的表显示按照本发明制备氨基葡糖的示例方法的随时间变 化的氨基葡糖的产量百分比。
图2是按照本发明制备的氨基葡糖的层析图谱。
图3是按照本发明制备的氨基葡糖的层析图谱。
同时，本发明的原则可以有不同的修改和不同的形式，通过实施 例详述其细节。然而应该理解本发明不限于描述的特定实施方案。相 反，在公开内容的精神和范围内，意图是包括所有的修改、等价物 (equivalents)和改变。
本发明涉及氨基葡糖，包括适合于人或动物用的含有氨基葡糖的 材料。氨基葡糖来源于存在于多种真菌生物质的几丁质。几丁质是天 然的多糖，结构是2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(N-乙酰基-D-氨基 葡 糖 ) ( 2-acetoamido-2-deoxy—D—glucose (N-acetyl-D-glucosamine))的无支链的多聚体。通过通用的重复结构描绘这一分 子式
几丁质是典型的无定形固体，几乎不溶于水，稀酸和碱。尽管几 丁质有多种商业应用，但是更大的商业应用是通过把多聚体结构转化 成单个的2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖组分，这就是已知的氨基葡 糖。在结构上，氨基葡糖是用氨基取代第二位碳(C-2)上的OH基的 修饰的葡萄糖。通用的结构是HQH2、 ^
发明详述
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如上所述，本发明的氨基葡糖来源于包含几丁质的发酵的真菌生 物质。适合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如来自于曲
霉属(y4s/ ejr^.77ws早)、青霉属(户e/7i"7hw 印，),毛霉属 (M/cor s/7.)和它们的组合的真菌源。真菌生物质的使用产生高质 量的产品，其产生仅有低水平的杂质的基本相同的氨基葡糖。本发明 的氨基葡糖通常有相对低的灰分含量，和低的重金属含量。除此之 外，做为真菌生物质产品，氨基葡糖不会对那些对甲壳类动物过敏的 人产生危险。
现在更详细地描述氨基葡糖组成、原材料和生产方法。 A. 氨基葡糖
本发明的氨基葡糖来源于相对相同的真菌生物质源，因此一般有 基本相同的组成。根据纯化氨基葡糖或所希望的氨基葡糖盐的方法； 产生的包含氨基葡糖的组合物有不同水平的纯度，包括超过95%的纯 度、98%的纯度和甚至99.8%的纯度的组合物。氨基葡糖组合物也包 含另外的成分，例如另外的盐。在此情形下，希望组分的总纯度相对 于不希望的杂质能够维持在超过95%、 98%甚至99. 8%的纯度水平。
本发明的氨基葡糖有如下通式<formula>formula see original document page 7</formula>
这个通式依氨基葡糖不同盐的存在而不同，包括柠檬酸盐、醋酸 盐、磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐、乳酸盐和葡糖酸盐等。同样，在不脱 离本发明范围的情况下氨基葡糖可以被取代或修饰。因此，这里使用 的术语氨基葡糖是指不同形式的氨基葡糖，包括盐复合物和取代的氨
这个通式依氨基葡糖不同盐的存在而不同，包括柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐、乳酸盐和葡糖酸盐等。同样，在不脱 离本发明范围的情况下氨基葡糖可以被取代或修饰。因此，这里使用 的术语氨基葡糖是指不同形式的氨基葡糖，包括盐复合物和取代的氨
基葡糖。
通常氨基葡糖是高纯度的，但可能包含别的成分，包括葡萄糖，
未反应的几丁质和其它材料。优选地氨基葡糖包含少于10%的葡萄 糖，更优选的少于5%的葡萄糖，甚至更优选的少于2%的葡萄糖。氨 基葡糖可能也包含其它的有机杂质。例如氨基葡糖可能包含有机酸。 但是，如果存在有机酸，通常发现其只有非常有限的数量，例如象上 述的葡萄糖的水平或甚至更小的数量。本发明的氨基葡糖有相对低的 灰分含量。灰分含量通常少于5%,更典型的是少于2%，在一些实施 例中甚至少于1%。在本发明的氨基葡糖中钙的水平通常也是低的。 通常重金属含量同样低，典型的低于百万分之100份，更典型的低于 百万分之50份，甚至更典型的低于百万分之20份。在某些实施方案 中该水平低于百万分之10份。氨基葡糖有正比旋光，例如氨基葡糖 的盐酸盐是正69到74度的比旋光。
本发明的氨基葡糖在纯净干燥形式下通常是相对白色的。但当溶 解在水溶液中是无色的。在一个实施例中，20%重量比氨基葡糖溶液 的美国公共卫生协会(American public Health Association) (APHA)的颜色少于50。通常氨基葡糖也有很小的气味，并且通过 气味就可以区别于来源于甲壳类动物的氨基葡糖。
B. 微生物真菌生物质原材料
适合的原材料包括基本上相同的微生物质源，典型的是真菌生物 质，例如含有全部细胞干重10%以上的几丁质的丝状真菌，例如来源 于曲霉属(y4spez^!77tfs印.)、青霉属(尸朋J'C!'L iW3)、 毛
霉属(#WC02" )的真菌源。适合的真菌生物质包括黑色曲霉
(y4邵ei^i7Jtfs /7i^er) 、 土曲霉(y4砂ejr《i77tfs tejrrews)、 米曲 霉(v4s/ e2^ii7〃s OJT/zae)、 鲁克氏毛霉(脸cor 2wu'jf)、 产黄 青霉(尸e/ j.c^h'咖 c力2^o^"e/7咖)、点青霉(尸e/ ic!'77jf咖
/7otat咖)、酿酒酵母(5"acc力aro迈yces cererisiae); 葡萄汁糖酵 母(5"acc力aro显yces肝ar咖)；尤其是季也蒙氏假丝酵母(Ca/ Wa 卵/77e2"显o/zfl(/ )、 黑色曲霉 (J印ez^i77tfs /7/^r ) 和土曲霉 (爿s/，er^7^/s terreus)。生物质通常从商业的发酵反应中回收， 例如有机酸的商业产品，包括柠檬酸。同样，可以专门为这个过程生 产适合生产氨基葡糖的生物质而不是用其它过程的副产品。这里使用 的术语微生物不包括浮游植物和甲壳动物或软体动物。
本发明尤其适合使用几丁质水平超过生物质干重5%的生物质。此 类生物质中通常含占生物质干重5-25%和可占生物质干重10%-20%的 几丁质。同样，为了制备高质量的氨基葡糖，有时希望在生物质的生 长过程中，在相对相同的温度和营养水平的基本上可控制的方式下生 产微生物质。
C. 氨基葡糖的生产方法
技术领域：
本发明也涉及形成氨基葡糖的方法。包括从发酵的真菌生物质的 酸水解形成。酸水解破坏了酸鍵和使几丁质分子脱去乙跣基产生游离 的氨基葡糖。酸水解足以破坏几丁质成为氨基葡糖，但是使氨基葡糖 分子基本上完整。水解反应条件有破坏一些存在于真菌生物质中其它
成分(如葡聚糖，蛋白和脂类)的额外优势。通常通过在强酸溶液中 处理真菌生物质超过4小时而进行此类酸水解。
生产氨基葡糖通常包括以下步骤提供含几丁质的生物质，在酸 性溶液中反应含几丁质的生物质形成氨基葡糖和从酸性溶液中分离氨 基葡糖。该反应通常具有真菌生物质原材料中全部几丁质含量50% 以上的氨基葡糖产量。
强酸可用于水解真菌生物质，包括浓度小于50%的酸，更常用的 是5-25%浓度的酸。适合的强酸包括适当水平的盐酸、硫酸、磷酸和 拧檬酸。
通常氨基葡糖的形成反应使用5-20%的酸、2-50%预处理的生物质 (依据干重，尽管通常生物质在有水存在下处理)和35-93%的水。 在某些实施例中反应混合物包含8-12%的盐酸、4-8%的生物质(依据
干重)和80-90%的水。
包含生物质、酸和水的混合物，加热并维持在升高的温度。混合 物通常加热到或接近它的沸点并维持在回流条件超过5小时，更典型 的是超过8小时，通常少于16小时。希望使反应持续足够长以完全 地破坏几丁质，但不持续长到低效率或过多的分解氨基葡糖。
在酸溶液中反应产生氨基葡糖，但要产生满意的产品通常需要随 后的纯化步骒。第一个纯化步骤通常包括过滤去除颗粒杂质，产生基 本上澄清的滤液。通常此滤液中包含氨基葡糖，也包含少量的葡萄糖 和其它糖。随后用蒸发步骤来浓缩氨基葡糖和可能去除一些酸，这可 以再循环和再利用。通过蒸发浓缩混合物，通过往浓缩混合物中加入 乙醇或继续蒸发到其溶解度的极限，氨基葡糖能以纯化的固体沉淀出 来。
氨基葡糖可以通过过滤或离心回收，然后干燥。干燥的氨基葡糖 可选择进一步纯化以去除任何残余的糖。去除这些多余糖的一种方法 是通过在水中溶解氨基葡糖或加入乙醇，这样可在更大的纯度沉淀氨 基葡糖。另外，溶液可以通过电渗析、层析、膜滤等来纯化。氨基葡 糖可选择用乙醇、碳或其它适合的材料和方法来脱色。
除了上面描述的步骤，可以一开始处理生物质以去除一些杂质或 改进氨基葡糖产量。这些处理包括加热生物质、加入消化酶、与酸或 碱混合、机械搅拌或加压脱水。 一个特别适合的处理是在氢氧化钠存 在时预处理生物质。在某些实施例中把浓度小于10%的氢氧化钠加入 真菌生物质中，加热到升高的温度持续一段时间，足以去除绝大部分 不含几丁质的材料。这个阶段通常小于2小时。该预处理方法的一个 具体的例子需要在2-8%的氢氧化钠溶液中，加热真菌生物质到100 到125"C持续20到60分钟。这个步骤水解了生物质中的一些蛋白和 葡聚糖，其副产品通过过滤可选择性地去除。过滤步骤后去除可溶蛋 白质、氨基酸等。在本发明具体的实施例中，洗过的和预处理的生物 质包含超过50%的水，甚至超过70-80%的水。通常预洗过的真菌生物 质中水的水平为大约80%到95%。
D. 实施例
通过下面非限制性说明性实施例进一 步说明本发明。除非另外指 明，各部分中所有的数量都是重量。 实施例1
用4%的氢氧化钠(NaOH)水溶液120C高压灭菌1小时预处理柠 檬酸生物质，这一步骤去除过量的蛋白质和其它不希望的材料。然后 用去离子水彻底洗生物质直到pH值为大约7.0。该洗过的材料与浓 盐酸(HC1)和水混合形成含10-15%盐酸和5-6%生物质的混合物(按 照生物质的干重)。该混合物加热回流。时常取出样品，用Dionex HPLC高压液相色谱(商标名称DX-500)分析反应。
结果显示在图1中，其为氨基葡糖产量指示图，并且显示在8小 时反应内，氨基葡糖产生不断增加，但是葡萄糖的量在4小时后减 少。8小时后氨基葡糖的产率是14%。该产品的层析图谱如图2所 示。
反应后，过滤混合物，用RotaVap制造的旋转蒸发器使滤液蒸发 以增加溶液中氨基葡糖的浓度。终体积减少到大约10到20毫升。在 此溶液中加入20亳升乙醇并使溶液涡漩以加速氨基葡糖的沉淀并增 加产量。通过过滤得到氨基葡糖沉淀并进一步用酒精洗涤直到颜色变 白。图3显示了该产品的层析图谱，显示超过9796的氨基葡糖。
实施例2
重复实施例1，但是要使预处理生物质维持在回流条件下13小 时。产生的氨基葡糖的纯度超过98%。
前述的详述和实施例仅是为了清楚理解。不应将说明书和实施例 理解为对本发明的限制。本发明不限于显示的和描述的确切细节，因 为权利要求书所限定的本发明里包括各种变化。
权利要求
1.适合人或动物用的包含氨基葡糖的材料，氨基葡糖来源于发酵的微生物质。
2. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖的 灰分含量小于2%。
3. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中氨基葡糖的重金属 含量小于每百万20份。
4. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中通过发酵的微生物 质的酸水解形成氨基葡糖。
5. 权利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通过用酸处理微生 物质超过4小时的微生物质的酸水解形成氨基葡糖。
6. 权利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通过用酸处理生物 质超过8小时的微生物质的酸水解形成氨基葡糖。
7. 权利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通过用5-25%的强 酸溶液处理生物质的微生物质的酸水解形成氨基葡糖。
8. 权利要求4的包含氨基葡糖的材料，其中通过用5-25%的强 酸溶液处理生物质超过4小时的微生物质的酸水解形成氨基葡糖。
9. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中当氨基葡糖为盐酸 盐形式时，氨基葡糖有正69-74度的比旋光。
10. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的微生物质的 产率为生物质原材料的全部几丁质含量的50%以上。
11. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的包含氨基葡 糖的材料包含少于5%的葡萄糖。
12. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中包含氨基葡糖的材 料根据干重大于98%的纯度。
13. 权利要求12的包含氨基葡糖的材料，其中所述的包含氨基 葡糖的材料仅包含氨基葡糖，或者氨基葡糖中混合有其他成分。
14. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖 20%重量比的水溶液具有小于50的美国公共健康协会的颜色。
15. 权利要求1的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖来 源于基本相同的微生物真菌源。
16. 权利要求15的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖 来源于曲霉属、青霉属、毛霉属和它们的组合。
17. 权利要求15的包含氨基葡糖的材料，其中所述的氨基葡糖 来源于丝状真菌的品种，其具有全部细胞重量的10%以上的几丁质。
18. 从微生物质得到氨基葡糖的方法，本方法包括以下步骤(a) 提供含几丁质的生物质；(b) 在酸浓度大于5%的酸溶液中，反应温度高于80t:，使含 几丁质的生物质反应，反应时间至少4小时，将生物质中的几丁质转 化成氨基葡糖；并且(c) 从酸性溶液中分离氨基葡糖。
19. 权利要求18的方法，其中分离氨基葡糖的步骤包含从酸性 溶液中结晶氨基葡糖。
20. 权利要求18的方法，其中酸溶液的酸浓度是5-25%。
21. 权利要求18的方法，其中酸溶液的酸浓度是5-50%。
22. 权利要求18的方法，其中反应温度高于80X:。
23. 权利要求18的方法，其中反应时间为4-25小时。
24. 权利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料具有 含几丁质的生物质的全部几丁质含量的50%以上的产率并且含有小 于5%的葡萄糖。
25. 权利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料含有 小于5%的可溶性糖。
26. 权利要求18的方法，其中所述的包含氨基葡糖的材料根据 干重为大于98%的氨基葡糖。
27. 权利要求18的方法，其中所述的氨基葡糖来源于曲霉属、 青霉属、毛霉属和它们的组合。
全文摘要
本发明公开了适合人和动物用的氨基葡糖。所述的氨基葡糖来源于含有几丁质的微生物质。适合的原材料包括基本上相同的微生物真菌源，例如来源于曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicilliun sp.)、毛霉属(Mucor sp.)或它们的组合的真菌源。本发明也公开了通过酸水解发酵的真菌生物质生产氨基葡糖的方法。
文档编号A61P19/02GK101186626SQ20071016980
公开日2008年5月28日 申请日期2002年2月15日 优先权日2001年2月16日
发明者J·A·鲍尔曼, J·D·斯坦科, J·P·海宁, J·R·特林科勒, 范炜宇, 黄基五 申请人:卡吉尔公司