防止蛋白质葡糖酰化的方法

专利名称：防止蛋白质葡糖酰化的方法
技术领域：
本发明涉及生物化学工程领域。更具体地，本发明涉及用于产生多肽的发酵工艺。
背景技术：
大肠杆菌(“E.coli”)是常用的蛋白质表达宿主，用于研究、诊断、治疗和 工业目的。现代表达系统能够获得高水平的多种蛋白质(Baneyx，CurrentOpinion in Biotechnology 10:411-421(1999))。然而，表达的蛋白质的质量常常是与数 量一样重要或比数量更加重要。在大肠杆菌中表达的蛋白质可形成不可溶的聚集 体，或者它们可具有错误掺入的氨基酸(Bogosian，et al.，Journal ofBiological Chemistry 264:531-539(1989))或保持 N-末端甲硫氨酸(Chaudhuri，etal, Journal of Molecular Biology 285 1179-1194 (1999) ；Vassileva-Atanassova, etal., Journal of Biotechnology 69:63-67(1999) ；Yamashita, et al. , ProteinExpression & Purification 16:47-52(1999))。此外，会发生所不希望的翻译后修饰，诸如氧化 (Berti,et al. ,Protein Expression & Purification 11 :111_118(1997) ；Konz,et al., Biotechnology Progress 14:393-409(1998))或 α-N-6-磷酸葡糖酰化(Geoghegan, et al. , Anal.Biochem. 267 169-184 (1999) ；Kim et al. , ActaCrystalIographica Section D-Biological CrystalIography 57:759-762(2001) ；Yan,et al. Biochemical & Biophysical Research Communications 262:793-800(1999) "Yan et al.I ； "Yan, et al. , Biochemical &Biophysical Research Communications259 :271_282 (1999) "Yan et al.II”)等。这些修饰会不利于实现所表达的蛋白质的活性、稳定性、结构或免疫原性，极 大地缩减了大肠杆菌作为多肽表达的宿主的效用。已经描述了融合于六组氨酸亲和标记(“hexa His-Tag”)的数种重组蛋白的 Alpha( α )-N-6-磷酸葡糖酰化(phosphogluconoylation) (Geoghegan 等；Kim 等；Yan 等 I ；Yan等II)。在这些研究中，发现葡萄糖酸衍生物与重组蛋白的末端相连。所有这些蛋白 质在大肠杆菌的B菌株中应用基于pET的载体(Novagen)进行表达。其中的报道中采用了 LB培养基。该加合物作为与258道尔顿(“Da”)的多肽或者178Da的多肽相连接的附加 质量而被检测到，其中前一种多肽代表加入6-磷酸葡糖酸内酯(6-PGL)，后一种多肽代表 存在葡糖酸内酯而无磷酸。公知磷酸葡糖酰化通过与磷酸戊糖支路的中间体即内源6-PGL 反应，发生在α氨基N-末端。认为+178Da加合物是作用于+258Da加合物以除去磷酸 (phosphate)的酶活性的结果。加合物的形成显示对于邻近His-标记的N末端氨基酸序列 是特异性的。GXXHHHH的多肽序列，其中XX为SS、SA、AS或AA，最易于发生α -Ν-6-磷酸葡 糖酰化，然而SHHHHHH则较不容易，而ΡΗΗΗΗΗΗ和PFHHHHHH则完全不被修饰(Geoghegan，et al.)。在蛋白其它位置的其它氨基上的修饰未在应用高水平添加的葡糖酸内酯的体内 或体外实验中检测到(Geoghegan，et al.)。已经显示N-末端磷酸葡糖酰化抑制蛋白质的结晶(Kim，et al.)，但关于其对蛋 白功能、稳定性和免疫原性的影响的了解相对较少。可以预期，6-PGL作为强的亲电子试剂， 可参与体内的糖化反应(Rakitzis and Papandreou, Chemico-BiologicalInteractions 113:205-216(1998))。蛋白质的糖化已被广泛地研究并已知在老化过程及与糖尿病并 发症有关的疾病状态中起主要的作用(B aynes and Monnier，The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition. Alan R. Liss, New York(1989))。已经显示夕卜源添 加的delta-葡糖酸内酯引起血红蛋白的糖化，其可为糖尿病的血管并发症中的一个因素 (Lindsay, et al.，Clinica Chimica Acta 263 :239_247 (1997))。此外，丙氨酸氨基转移 酶在Lys313印silon-氨基的糖化显著地降低其催化活性(Beranek, et al.，Molecular &Cellular Biochemistry 218:35—39(2001))。已经显示6-磷酸葡糖酸内酯酶(“pgl”)为戊糖-磷酸途径，具体在6-PGL到6_磷 酸葡糖酸的水解中的重要酶(Miclet, et al.，J. Biol. Chem. 276 =34840-34846 (2001)) 编码此酶的基因已经在人(Collard，et al.，FEBS Letters 459 :223_226 (1999))、铜绿 Iix Ifi lif (Pseudomonas aeruginosa) (Hager, et al.，Journal ofBacteriology 182 3934-3941(2000))和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)以及镰状疟原虫中(Plasmodium falciparum) (Miclet, et al.)中得到鉴定。虽然已经长期地在大肠杆菌中观察到pgl活 性(Kupor and Fraenkel，Journal of BacteriologylOO 1296-1301 (1969) "Kupor I"and Kupor and Fraenke1, Journal of BiologicalChemistry 247 1904-1910(1972) "Kupor II”)，但是没有鉴定出负责编码具有此活性的酶的基因序列(Cordwell，S. J. Arch. Microbiol. 172 :269_279 (1999))。已经表明，除了能够使代谢流通过磷酸戊糖支路外，细胞 内的Pgl活性防止6-PGL的积累以及随之发生的与胞内亲核试剂的破坏性反应(Miclet， et al.)。已报道的对蛋白质在N末端的磷酸葡糖酰化的观察支持了在所述的途径中产生 &6-PGL能够修饰蛋白质的假说，但没有报道调控pgl活性能够影响修饰的蛋白水平的证 据。此外，大肠杆菌BL21(DE3)是常用的蛋白质表达宿主，其用于研究、诊断、治疗和 工业目的(Studier，F. W.，and Moffatt，B. A.，J. Mol. Biol. 1986 May 5 ；189(1) 113-130)。 此菌株在商业上是有吸引力的，因为它通过偶联T7RNA聚合酶染色体拷贝的表达与目的重 组蛋白上基于质粒的T7RNA聚合酶启动子的使用，实现非常高的重组蛋白表达水平。因此， 由于T7RNA聚合酶是极具选择性和活性的RNA聚合酶，重组蛋白的转录积累到非常高的水 平，甚至常常达到宿主细胞转录物被减少的程度。不利地，菌株BL21 (DE3)释放非常少但可检出的感染性lambda噬菌体颗粒，所 述lambda噬菌体颗粒的量级为10-20个噬斑形成单位/ml (PFU)，Stewart Shuman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989;89:3489-3493。明显地，通过用携有被插入 lambda int 基因之 T7RNA聚合酶基因的缺陷型lambda噬菌体DE3进行转导，将T7 RNA聚合酶基因导入BL21宿 主细胞染色体(Studier, F. W.，and Moffatt, B. Α.，J. Mol. Biol. 1986 ；189(1) 113-130)。 得到的缺陷型原噬菌体由于int基因中断而不能正常复制。DE3原噬菌体的染色体切除， 是包装及释放感染性的噬菌体颗粒之前原噬菌体复制所需的，并且依赖于由int基因产物指导的同源切除重组。如本文所述，非常低水平的释出的噬菌体颗粒是由于异常的、依赖于 int的、随机的原噬菌体切除事件。尽管感染性噬菌体颗粒的低水平释放在一些研究实验室 中是可以接受的，但在生物药剂的制造工厂设备中，任何感染性噬菌体的释放则是完全不 能接受的，既因为为了患者安全考虑，还因为感染性试剂的释放能使其它基于大肠杆菌的 生产工艺处于危险状态中。在微生物诸如大肠杆菌中表达或过量表达多肽、同时使得发酵过程中的磷酸葡糖 酰化发生率降低的方法是非常需要的。此外，构造完全无噬菌体的BL21(DE3)宿主细胞，对 于在大肠杆菌形式中制备治疗性重组蛋白质是非常需要的。

发明内容
本发明提供了通过使微生物在丰富培养基生长，从而防止由微生物表达的多肽发 生葡糖酰化的方法。本发明也提供了防止由微生物所表达多肽的葡糖酰化的方法，其包括将编码显示 Pgl活性的多肽的DNA导入(例如，转化、感染或转染)到微生物中。此多肽可为磷酸葡糖 酸内酯酶。在本发明的另一方面，该磷酸葡糖酸内酯酶与假单胞菌包括但不限于铜绿假单 胞菌所产生的磷酸葡糖酸内酯酶具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。本发明也提供了能够防止蛋白质的葡糖酰化的微生物。在一个实施方案中，微生 物可含有编码显示pgl活性的多肽的DNA。本发明也提供了分离的多核苷酸，其与SEQ ID NO :7中的多核苷酸具有至少90% 的同源性。本发明也提供了微生物，其没有可检出的感染性lambda噬菌体表达。更具体地，本发明涉及1.防止微生物中所表达的多肽的葡糖酰化的方法，包括使所述的微生物在丰富培 养基中生长。2.项1的方法，其中所述的微生物在基本培养基中生长时，不显示明显的6-磷酸 葡糖酸内酯酶活性。3.项1的方法，其中所述的微生物是大肠杆菌。4.项3的方法，其中所述的大肠杆菌是B菌株。5.项1的方法，其中所述的丰富培养基包括复合氮源。6.项5的方法，其中所述的丰富培养基能够保持细胞在复合氮源浓度与细胞密度 的比率为1 1的条件下生长。7.项5的方法，其中所述的复合氮源包含胰蛋白胨。8.项5的方法，其中所述的复合氮源包含蛋白胨。9.项5的方法，其中所述的复合氮源包含酵母提取物。10.项1的方法，其中所述的培养基是Superbroth。11.项10的方法，其中所述的Superbroth培养基是双倍浓缩的。12.项1的方法，其中所述的微生物由编码异源多肽的重组DNA分子转染。13.防止在大肠杆菌中所表达的多肽的葡糖酰化的方法，包括将大肠杆菌的K菌 株品种发酵以表达所述的多肽。
14.项13的方法，其中所述的K菌株显示的磷酸葡糖酸内酯酶活性比在同样条件 下生长的B菌株高100倍。15.项14的方法，其中所述的K菌株为K-12。16.防止在微生物中所表达的多肽的葡糖酰化的方法，包括将DNA导入该微生物， 其中所述的DNA编码显示6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的多肽。17.项16的方法，其中所述的微生物是大肠杆菌。18.项16的方法，其中所述的DNA包括编码6_磷酸葡糖酸内酯酶的DNA。19.项18的方法，其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与来自假单胞菌的、编码 6_磷酸葡糖酸内酯酶的DNA具有至少70%的序列同一性。20.项19的方法，其中所述的假单胞菌是铜绿假单胞菌。21.项18的方法，其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与SEQID NO 7具有至少 90%的序列同一性。22.项18的方法，其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与SEQID NO 7具有至少 95%的序列同一性。23.项18的方法，其中所述的6-磷酸葡糖酸内酯酶具有与SEQ ID NO 8具有至 少90%序列同一性的氨基酸序列。24.项18的方法，其中所述的6-磷酸葡糖酸内酯酶具有与SEQ ID NO 8具有至 少95%序列同一性的氨基酸序列。25.项18的方法，其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA包括SEQ IDNO 7中列出 的序列。26.项16的方法，其中所述的DNA是重组DNA。27.项16的方法，其中所述的DNA被转化入所述微生物的基因组DNA。28.微生物，其能够防止多肽的葡糖酰化。29.项28的微生物，其中所述的微生物包括DNA，所述DNA编码显示6_磷酸葡糖 酸内酯酶活性的多肽。30.项28的微生物，其中所述的微生物包括DNA，所述DNA编码6_磷酸葡糖酸内酯酶。31.项28的微生物，其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与来自假单胞菌的、编 码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA具有至少90 %的序列同一性，并且其中所述的微生物不是假 单胞菌。32.项28的微生物，其中编码6_磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与来自假单胞菌的、编 码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA具有至少95 %的序列同一性，并且其中所述的微生物不是假 单胞菌。33.项31的微生物，其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA来自铜绿假单胞菌。34.项28的微生物，其中所述的微生物是大肠杆菌的菌株。35.项31的微生物，其中所述的微生物是大肠杆菌的菌株，并且其中编码6-磷酸 葡糖酸内酯酶的DNA被掺入该微生物的基因组。36.分离的多核苷酸，包括与SEQ ID NO 7中列出的多核苷酸具有至少90%的序 列同一性的多核苷酸。
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37.项36的分离的多核苷酸，包括与编码多肽的多核苷酸具有至少90%同一性的 多核苷酸，所述的多肽包含与SEQ ID NO :8具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。38.项36的分离的多核苷酸，其中所述的DNA编码显示6-磷酸葡糖酸内酯酶活性 的蛋白。39.项36的分离的多核苷酸，其中所述的DNA序列在SEQ ID NO 7中列出。40.项36的分离的多核苷酸，其中所述的DNA序列与来自铜绿假单胞菌的、编码 6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA具有至少90%的序列同一性。41.项35的分离的多核苷酸，进一步包括编码人白细胞介素-18的多核苷酸。42.分离的多核苷酸，包括与SEQ ID NO 7中列出的多核苷酸具有至少95%的序 列同一性的多核苷酸。43.改善多肽晶体形成的方法，包括根据项1的方法表达所述的多肽。44.改善多肽晶体形成的方法，包括根据项16的方法表达所述的多肽。45.项1的方法，进一步包括提高生长效率，其中所述的多肽与葡糖酰化的多肽相 比，在发酵阶段显示出增加的效价收率。46.项16的方法，进一步包括提高生长效率，其中所述的多肽与葡糖酰化的多肽 相比，在发酵阶段显示出增加的效价收率。47.生产人白细胞介素的方法，包括使所述的人白细胞介素在微生物中与具有 6-磷酸葡糖酸内酯酶(“pgl”)活性的酶共表达。48.项47的方法，其中所述的人白细胞介素是IL-18。49.项47的方法，其中所述的微生物是大肠杆菌。50.项49的方法，其中所述的pgl是由被转化入所述大肠杆菌基因组中的多核苷 酸编码的。51.生产人白细胞介素的方法，包括在生长于丰富培养基中的微生物中表达所述 的人白细胞介素。52.项51的方法，其中所述的人白细胞介素是IL-18。53.项51的方法，其中所述的微生物是大肠杆菌。54.项51的方法，其中所述的丰富培养基包括植物蛋白胨。55.项51的方法，其中所述的丰富培养基包括细菌用酵母提取物。56.微生物，其完全不表达感染性lambda噬菌体。57.项56的微生物，其中lambda噬菌体的衣壳结构蛋白gpE被缺失或被破坏。58.项56的微生物，其中所述的微生物是大肠杆菌。59.项56的微生物，其含有T7RNA聚合酶基因。


图1显示载体pEC0-l-pgl-2-13的限制性酶图谱。图2显示载体pEC0-l-pgl-2-13的多核苷酸序列(SEQ ID NO 9)。图3显示载体pET28ProIL18Casp5的限制性酶图谱。图 4 显示载体 pET28ProIL18Casp5 的多核苷酸序列(SEQ ID NO 13)。图5显示载体pET28proIL18casp5+pgl的限制性酶图谱。
图 6 显示载体 pET28proIL18casp5+pgl 的多核苷酸序列(SEQ ID NO 14)。图7显示多核苷酸序列SEQ ID NO :7。图8显示多肽序列SEQ ID NO :8。术语表“宿主细胞”是细胞，包括但不限于细菌细胞或微生物的细胞，其中已经导入(例 如，转化、感染或转染)或者能够导入(例如，转化、感染或转染)分离的多核苷酸序列。“转化的”如本领域已知，是通过外部DNA或RNA的导入对生物体的基因组或附加 体(印isome)的定向修饰，或者指外部DNA或RNA的任何其它稳定导入。“转染的”如本领域已知，是将外部DNA或RNA包括但不限于重组的DNA或RNA导 入微生物中。“同一性”如本领域已知，是通过序列比较确定的两个或两个以上多肽序列或两 个或两个以上多核苷酸序列之间的具体关系。在本领域中，“同一性”也指通过所述序列 串之间的配对确定的多肽或多核苷酸序列之间的序列具体相关性程度。“同一性”能够通 过已知的方法容易地计算，包括但不限于那些在(Computational Molecular Biology, Lesk, Α. Μ. , ed. , Oxford UniversityPress, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D. W. , ed. , Academic Press, New York, 1993 ；Computer Analysis of SequenceData, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press,1987 ；and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds. ,MStockton Press,New York,1991 ；and Carillo,H. ,and Lipman,D. , SIAM J. Applied Math. ,48:1073(1988))中描述的方法。确定同源性的方法被设计为在受试序列之间给 出最大匹配度。而且，确定同源性的方法汇集在可以公开得到的计算机程序中。确定两 个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序包(Devereux，J.，et al.， Nucleic Acids Research 12(1) :387 (1984))、BLASTP、BLASTN和 FASTA(Altschul，S. F. et al.，J. Molec. Biol.215 :403-410(1990)。公众可以从 NCBI 及其它来源(BLAST Manual, Altschul, S.，etal.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul, S.，et al.，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990))获得 BLAST X 程序。著名的 Smith Waterman 算法也可被用于 确定同一性。多肽序列比较的参数包括以下参数算法Needlemanand Wunsch, J. Mol Biol. 48 443-453 (1970)比较矩阵BL0SSUM62，来自 Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 10915-10919(1992)缺口罚分12缺口长度罚分4利用这些参数的有用程序是可以公开获得的，如来自Genetics Computer Group, Madison WI的“缺口(gap)”程序。前面提及的参数(连同末端缺口无罚分一起)是肽比 较的缺省参数。多核苷酸比较的参数包括以下参数算法Needlemanand Wunsch, J. Mol Biol. 48 443-453 (1970)
比较矩阵配对=+10，错配=0缺口罚分50缺口长度罚分3可用的如来自Genetics Computer Group, Madison WI 的“缺口，，程序。这些是 核酸比较的缺省参数。多核苷酸和多肽的“同一性”的优选含意，根据具体情况，在下面的(1)和(2)中提供。(1)多核苷酸实施方案进一步包括分离的多核苷酸，其包含与参比序列SEQ ID NO :7具有至少70、80、85、90、95、97或100%同源性的多核苷酸序列，其中所述的多核苷酸 序列可与参比序列SEQ ID NO :7相同或者与参比序列相比可包含达某一整数个的核苷酸改 变，其中所述的改变选自由至少一个核苷酸缺失、取代，包括转换或颠换，或插入所组成的 组。而且其中所述的改变可发生在参比核酸序列的5’或3’末端位置或所述末端位置之间 的任何地方，单个地分散在参比序列的核苷酸中，或者在参比序列内的一或多个相邻基团 中，而且其中所述核苷酸改变的数目通过以下方法确定用定义同一性百分比的整数除以 100所得的结果乘以SEQ ID NO :7中核苷酸的总数，然后从所述的SEQ ID NO :7中核苷酸 的总数中减去上述乘积，或xn_(xn · y)，其中~为核苷酸改变的数目，xn为SEQ ID NO 7中核苷酸的总数，y对于95%为 0. 95，对于97%为0. 97或对于100%为1.00，而·为乘法算符的记号，而在从Xn中减去Xn 与y的任何非整数乘积之前，将所述乘积向下舍入到最接近的整数。编码多肽的多核苷酸 序列的改变会在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，并从而改变由发生这些改变的 多核苷酸编码的多肽。(2)多肽实施方案进一步包括分离的多肽，其包含与多肽参比序列具有至少70、 80、85、90、95、97或100%同一性的多肽，其中所述的多肽序列可与参比序列相同或者与参 比序列相比可包含达某一整数个的氨基酸改变，其中所述的改变选自由至少一个氨基酸缺 失、取代(包含保守的和非保守的取代)，或插入所组成的组，而且其中所述的改变可发生 在参比多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或所述的末端位置之间的任何地方，单独地分 散在参比序列的氨基酸中，或者在参比序列内的一或多个相邻基团中，而且其中所述的氨 基酸改变的数目可通过以下方法确定用定义同源性百分数的整数除以100的所得结果乘 以氨基酸的总数，然后从所述的氨基酸的总数中减去上述方法所得乘积，或na ^xa-(xa-y),其中na为氨基酸改变的数目，Xa为序列中氨基酸的总数，y对于95%为0. 95，对于 97%为0. 97或对于100%为1. 00，而·为乘法算符的记号，而在从Xa中减去Xa和y的任何 非整数的乘积之前，将所述乘积向下舍入到最接近的整数。“分离的”意思是从其自然状态“通过人工”改变的，S卩，如果它存在于自然中，那么 它已被改变或从其原始环境中去除，或两者都有。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸 或多肽不是“分离的”，而从其天然状态的共存物质中分离的同样的多核苷酸或多肽是“分 离的”，包括但不限于当所述的多核苷酸或多肽被导回进入细胞的情况。“多核苷酸”通常指任何聚核糖核苷酸或聚脱氧核糖核苷酸，其可为未经修饰的
9RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”非限制性地包括，单-和双-链DNA，作为 单_和双_链区域或单_、双-和三_链区域的混合物的DNA，单-和双-链RNA，及作为 单-和双-链区域混合物的RNA，杂合分子，其含有作为单链或更通常地双链或三链区域、 或作为单_和双_链区域的混合物的DNA与RNA。此外，如本文应用的“多核苷酸”指含有 RNA或DNA或RNA和DNA的三-链区域。此区域中的链可来自同一分子或来自不同分子。 此区域可包括一个或多个分子的全部，但是更通常地只涉及这些分子中的区域。三-螺旋 区域的分子之一常常为寡核苷酸。如在这里应用的，术语“多核苷酸”也包括如上所述含有 一个或多个经修饰的碱基的DNA或RNA。因此，具有为了稳定性或为了其它原因而被修饰的 骨架的DNA和RNA为本文的“多核苷酸”。而且，含有不常见碱基如次黄嘌呤核苷，或经修饰 的碱基如三苯甲基化的碱基的DNA或RNA，仅举两例，为如在这里应用的多核苷酸。认识到 已经对DNA和RNA进行多种修饰，所述修饰可用于本领域已知的多种有用目的。术语“多核 苷酸”，如其在这里使用的，包含多核苷酸的所述化学性、酶性或代谢性修饰形式，以及病毒 和细胞的特征性DNA和RNA的化学形式，包括，例如，简单和复杂细胞。“多核苷酸”也包括 常常作为寡核苷酸提及的短多核苷酸。“多肽，，指包含两个或两个以上通过肽键或修饰的肽键互相连接的氨基酸的任何 多肽或蛋白。“多肽”既指通常称为肽、寡肽和寡聚物的短链，又指通常称为蛋白质的较长 的链。多肽可包含除20基因编码的氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包含那些通过天然方 法诸如加工和其它翻译后修饰来修饰的多肽，也包括经化学修饰技术来修饰的多肽。这些 修饰在基础文本和更详细的专论中，以及在大量的研究文献中充分地描述，并且它们为本 领域的技术人员所熟知。应理解同样类型的修饰以同样的或变化的程度存在于给定的多 肽中的数个位点。而且，给定的多肽可含有许多类型的修饰。修饰可发生在多肽中的任 何地方，包括多肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括，例如，乙酰化、酰化、 ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物 的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、形成二硫 键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、gamma-羧化、形成 GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化(myristoylation)、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、 异戊烯化(prenylation)、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的gamma-羧 化、羟基化和ADP核糖基化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨 酰化(arginylation),以及泛素化(ubiquitination)。参见，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND M0LECULARPR0PERTIES,2nd Ed. , Τ. Ε. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York(1993)and Wold, F. , Posttranslational Protein Modifications !Perspectives andProspects, pgs. 1-12 in P0STTRANSLATI0NAL C0VALENT MODIFICAT10N0F PROTEINS, B. C. Johnson,Ed. ,Academic Press,New York(1983) ；Seifter etal. ,Meth. Enzymo1. 182 626-646 (1990)and Rattan et al. , Protein Synthesis :Posttranslational Modifications and Aging,Ann. N. Y Acad. Sci. 663 :48_62(1992)。多肽可为分枝的或带有 或不带有分支的环。环状的、支化的和支化环状的多肽可由翻译后的天然过程产生，并且也 可通过完全合成的方法制备。“重组表达系统”指本发明的表达系统或其部分、或多核苷酸，其被导入或转化进 入宿主细胞和宿主细胞裂解物，用于产生本发明的多核苷酸和多肽。
本文术语“变体”，是分别与参比多核苷酸或多肽不同，但保持基本性质的多核苷 酸或多肽。通常的多核苷酸变体的核苷酸序列不同于另一种，参比多核苷酸。在变体的核 苷酸序列中的变化，可改变或不改变由参比多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变 化可导致由参比序列编码的多肽中的氨基酸的取代、添加、缺失、融合蛋白和截短，如在下 面讨论的。通常的多肽的变体在氨基酸序列上不同于另一个，参比多肽。一般地，差异是有 限的，以致参比多肽和变体的序列大体上十分相似并在很多区域相同。变体和参比多肽通 过一个或一个以上任意组合的取代、添加、缺失而在氨基酸序列上有所差异。取代的或插入 的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的。本发明也包括本发明的每种多肽的变体，即 与参比物的差异在于保守的氨基酸取代的多肽，其中残基被具有相似特性的另一残基所取 代。通常这样的取代在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu 之间；在Asn和Gln之间；也在碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe和Tyr。具体 优选的是其中数个，如5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸以任意组合的方式被取代、缺失或 添加的变体。多核苷酸或多肽的变体可为天然存在的，诸如等位基因的变体，或者可为未知 其为天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非_天然存在的变体可通过诱变(mutagenesis) 技术、通过直接合成和通过技术人员已知的其它重组方法来制备。“微生物”指⑴原核生物，包括但不限于，以下属的成员链球菌属 (Str印tococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特菌属(Bordetella)、棒状杆菌 属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、嗜血 杆菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌(Streptomycetes)、诺卡氏 菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耳口尔森氏菌属(Yersinia)、Fancisella、 Pasturella、摩拉克氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、毒丝菌属 (Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链 杆菌属(Streptobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、荚膜菌属(Calymmatobacterium) > 布氏杆菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、密螺旋体 属(Tr印onema)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克氏杆菌 属(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、文氏菌属(Erwinia)、包 柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(L印tospira)、螺旋菌属(Spirillum)、弯曲 杆菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团杆菌属(Legionella)、假单 胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体(Rickettsia)、衣原体 属(Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和支原体(Mycoplasma)，并且进一步包 括，但不限于，以下种或组的成员A组链球菌(Group A Streptococcus)、B组链球菌、 C组链球菌、D组链球菌、G组链球菌、肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)、化脓 性链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、獎 链球菌(Streptococcus faecal is)、屎链球菌(Streptococcus faecium)、坚忍链球 菌(Streptococcus durans)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheae)、脑膜炎奈瑟氏菌 (Neisseria meningitidis)、金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diptheriae)、阴道力口 德菌(Gardnerella vaginalis)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支 杆菌(Mycobacterium bovis)、馈荡分支杆菌(Mycobacterium ulcerans)、麻风分支杆菌(Mycobacterium 1印rae)、衣氏放线菌(Actinomyctes israelii)、单核细胞增多性李斯特 胃(Listeria monocytogenes)、15 日 専H牛寺 (Bordetellapertusis) H ^ff 胃(Bordatella parapertusis) >iWJ^ifil(Bordetella bronchiseptica) > 大肠杆菌(Escherichia coli)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、流感嗜血杆 胃(Haemophilus influenzae) ,i^R^ikiffM (Haemophilus aegyptius) > gijM1 ^Bf ifil 杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、博德 特菌(Bordetella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌 (Citrobacter freundii)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、鼠疫耶尔森(氏)菌(Yersinia pestis)、肺炎克氏杆菌(Kleibsiella pneumoniae)、Serratia marcessens、Serratia liquefaciens、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenterii)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、铜 绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、Franscisella tularensis、Brucella abortis、 炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、产气荚膜梭菌 (Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、苍白密螺旋体(TMponema pallidum)、立克次(氏)立克次(氏)体 (Rickettsiarickettsii)禾口 Chlamydia trachomitis, (ii)古细菌(archaeon),包括 但不限于ArchaebacterdP (iii)单细胞的或丝状的真核生物，包括但不限于酿酒酵母 (Saccharomyces cereviseae)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)或白色念珠菌 (Candida albicans)“细菌(I) ”指(i)原核生物，包括但不限于以下属的成员链球菌属、葡萄球菌属、 博德特菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、奈瑟氏菌属、嗜血杆菌属、放线菌、链霉菌属、诺卡氏 菌属、肠杆菌属、耶尔森氏菌属、Fancisella、Pasturella、摩拉克(氏)菌属、不动杆菌属、 毒丝菌属、布兰汉球菌属、放线杆菌属、链杆菌属、李斯特菌属、荚膜菌属、布氏杆菌属、芽孢 杆菌属、梭菌属、密螺旋体属、埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、克氏杆菌属、弧菌属、变形杆菌 属、文氏菌属、包柔氏螺旋体属、钩端螺旋体属、螺旋菌属、弯曲杆菌属、志贺氏菌属、军团杆 菌属、假单胞菌属、气单胞菌属、立克次氏体属、衣原体属、包柔氏螺旋体属和支原体，并进 一步包括，但不限于以下种或组的成员A组链球菌、B组链球菌、C组链球菌、D组链球菌、G 组链球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、无乳链球菌、粪链球菌、链球菌素、坚忍链球菌、淋病 奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、金黄色葡萄球、表皮葡萄球菌、白喉棒杆菌、阴道加德菌、结核分支 杆菌、牛分支杆菌、溃疡分支杆菌、麻风分支杆菌、衣氏放线菌、单核细胞增多性李斯特菌、 百日咳博德特菌、副百日咳博德特菌、支气管败血性博德特菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、流 感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌、博德特菌、伤寒沙门氏菌、 弗罗因德(氏)枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、鼠疫耶尔森(氏)菌、肺炎克氏 If |if> Serratia marcessens、Serratia liquefaciens、·舌氏胃、·氏；ifelSI 氏菌、铜绿假单胞菌、Franscisella tularensis、Brucellaabortis、炭疽芽孢杆菌、赌样芽 孢杆菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、苍白密螺旋体、立克次(氏)立克次(氏) 体禾口 Chlamydia trachomitis, (ii)古细菌，包括但不限于 Archaebacter。如在这里应用的，“异源多肽”指不能通过经转化的目标宿主细胞或微生物天然地 合成、并通过重组DNA导入该宿主细胞或微生物的多肽。例如，大肠杆菌可作为白细胞介素表达的宿主微生物，而白介素表达在非-转化的大肠杆菌中不会发生。异源多肽可包括已 经过修饰以促进分离的多肽。如在这里应用的“亲和标记”指任何与分子相连的部分，其可给予所述的分子对于 另一种物质或分子的选择性亲和力。例如，亲和标记可用于通过给分子提供对于纯化柱填 充材料的选择性亲和力而促进分子的纯化。亲和标记的非_限制性的实例为his-标记。如在这里应用的，“His-标记”指组氨酸的重复，并可包含通过改造技术而被编码 进多肽的其它氨基酸。通常地，一个His-标记包含至少六个(“hexa”)组氨酸重复，且其 位于多肽的N-末端附近。His-标记能 够用于促进异源多肽在Ni-柱上的纯化。如在这里应用的，“基本培养基”指含有化学限定成分的细胞生长培养基，包括但 不限于，缓冲液，如磷酸盐缓冲液；盐，如硫酸镁、氯化钙、氯化钠、或硫酸锰；矿物质，如铁、 锌、铜、钴或钼；碳源，如葡萄糖或甘油；和氮源，如硫酸铵或硝酸铵。一个实例为M9培养基 (Kim,YS, JH Seo and HYCha, Enzyme and Microbial Technology 33(2003) :460_465.)。如在这里应用的，“丰富培养基(rich culture medium) ”指含有非限定成分的细 胞生长培养基，包括但不限于，添加的成分，如缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)、盐(例如硫酸 镁、氯化钙、氯化钠或硫酸锰)、碳源，例如其可为葡萄糖或甘油。氮源可包含蛋白水解物，如 酵母提取物、肉类水解物或大豆水解物。氮源可以能够支持细胞生长的浓度提供，其中复合 氮源(克每升)与最大细胞密度(0D单位)的比率为1 1或更高。丰富培养基的实例包括， 但不限于，Superbroth (Atlas RM, Handbook of Microbiological Mesdia ；Parks LC Ed.； CRCPress :Boca Raton FL, pp. 281, 523, 529,859) > Teriffic Broth (Alpha Biosciences, Baltimore, MD USA)、Turbo Broth (Athena Enzyme Systems, Baltimore, MDUSA)或 Hyper Broth(Athena Enzyme Systems, Baltimore, MD USA)。如在这里应用的，“葡糖酰化”指葡糖酸衍生物与蛋白的连接。葡糖酰化可包括，但 不限于，6-磷酸葡糖酸内酯(6-PGL)加合物形成、乙酰化、甲酰化、去甲酰化、葡糖酸内酯化 (gluconolactonation)或葡糖酸衍生化(derivatization)。如在这里应用的，“效价收率(titer yield) ”指产物(例如，异源表达的多肽)在 溶液(例如，培养液或细胞-裂解混合物或缓冲液)中的浓度，而其通常表示为mg/L或g/ L。效价收率的增加可指在两个限定的条件组下产生的产物浓度的绝对的或相对的增加。如在这里应用的，“pgl活性”指任何6-磷酸葡糖酸内酯酶(“pgl”)的活性。此 活性可包括将6-PGL水解为6-磷酸葡糖酸。显著的pgl活性可以定义为至少0. 2IU/min/ g的水解活性。如在这里应用的，术语“严谨条件”和“严谨杂交条件”指只有当序列之间的同 一性为至少70%且优选至少80%，而具体优选至少95%时，杂交才会发生。严谨杂交 条件的实例为，在含有50%甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM枸橼酸三钠(trisodium citrate) )、50mM 磷酸盐(pH7. 6)、5 XDenhardt ‘ s 溶液、10 %硫酸葡聚糖和 20 μ g/ml 变 性的、经剪切的鲑精DNA的溶液中、于42°C过夜温育，然后是在0. 1 X SSC中、大约65 V洗 涤滤纸。杂交和洗涤条件是已被熟知的，并在Sambrook，et al.，Molecular Cloning =A LaboratoryManual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y, (1989)，特别是其中第 11 章中举例说明，其公开在此全部并入以供参考。发明详述
由于在基本培养基中的生长、高细胞密度和高水平的异源多肽的表达引起的细胞应激(Cellular stresses)，可有助于于异源多肽的葡糖酰化。减轻一种或一种以上这些 应激物，可由此影响在微生物中表达的蛋白的葡糖酰化的水平，从而影响到所需多肽的纯 度和效价收率。尽管造成此活性的基因还没有在大肠杆菌中鉴定出来，大肠杆菌的一些 菌株可比其它菌株具有更高水平的Pgl活性(Cordwel 1, S. J. 1999. Arch. Microbiol. 172 269-279)。此外，多肽的葡糖酰化可影响这些多肽的结晶和结构测定。本发明提供了防止在微生物中表达的多肽的葡糖酰化的方法，包括使所述的微生 物在丰富培养基中生长。在本发明的又一方面，当微生物在基本培养基中生长时，不显示显 著的6-磷酸葡糖酸内酯酶活性。该微生物可为大肠杆菌的菌株。在本发明的又一方面，大 肠杆菌为B菌株。在本发明的又一方面，丰富培养基包含复合氮源。丰富培养基能够在复合 氮源浓度与细胞密度的比率为1 1的条件下保持细胞生长。复合氮源可包含胰蛋白胨、 蛋白胨或酵母提取物。在本发明的又一方面，培养基为Superbroth。Superbroth培养基可 为双倍浓缩的。在本发明的又一方面，微生物以编码异源多肽的重组DNA分子转染。在本发明的另一实施方案中，提供防止在大肠杆菌中表达的多肽的葡糖酰化的方 法，包括将大肠杆菌的K菌株变体发酵用于表达多肽。在本发明的又一方面，与在基本相同 的条件下生长的B菌株相比，K菌株显示的磷酸葡糖酰化酶活性至少高大约100倍。在本 发明的又一方面，K菌株为K-12。在本发明的另一实施方案中，提供防止在微生物中所表达多肽的葡糖酰化的方 法，包括将DNA导入微生物，其中所述的DNA编码显示6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的多肽。在 本发明的又一方面，微生物是大肠杆菌。DNA包括编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA。在本 发明的又一方面，编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与来自假单胞菌的、编码6-磷酸葡糖酸 内酯酶的DNA具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性，所述的假 单胞菌可为铜绿假单胞菌。在本发明的又一方面，编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与SEQ ID NO :7具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性。在本发明的又 一方面，6-磷酸葡糖酸内酯酶与SEQ ID而8具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97% 或100%的序列同一性的氨基酸序列。编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA包括SEQ ID NO: 7的序列。DNA可为重组的DNA，和/或其可被转化入微生物的基因组DNA。在本发明的另一实施方案中，提供能够防止多肽的葡糖酰化的微生物。微生物包 括编码显示6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的多肽的DNA。微生物包括编码6-磷酸葡糖酸内酯 酶的DNA。在本发明的又一方面，编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA与来自假单胞菌的、编码 6_磷酸葡糖酸内酯酶的DNA具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同 一性，并且其中所述的微生物不是假单胞菌。在本发明的又一方面，编码6-磷酸葡糖酸内 酯酶的DNA来自铜绿假单胞菌。在本发明的又一方面，微生物是大肠杆菌的菌株。在本发 明的又一方面，微生物是大肠杆菌的菌株，并且其中编码6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA被掺 入微生物的基因组。在本发明的另一实施方案中，提供分离的多核苷酸，其包括与SEQ IDNO 7的多核 苷酸具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性的多核苷酸。在本 发明的又一方面，分离的多核苷酸包括与编码下述多肽的多核苷酸具有至少70%、80%、 85%、90%、95%、97%或100%的序列同一性的多核苷酸，所述的多肽包含与SEQ ID NO 8具有至少70%、80%、85%、90%、95%、97%或100%序列同一性的氨基酸序列。在本发明 的又一方面，DNA编码显示6-磷酸葡糖酸内酯酶活性的蛋白。在本发明的又一方面，DNA 序列在SEQ ID NO:7中列出。在本发明的又一方面，DNA序列与来自铜绿假单胞菌的编码 6_磷酸葡糖酸内酯酶的DNA同源。在本发明的又一方面，分离的多核苷酸进一步包括编码 人白细胞介素-18的多核苷酸，或其变体。
在本发明的另一实施方案中，提供改善多肽晶体形成的方法，包括通过本发明的 方法表达所述的多肽以降低多肽的葡糖酰化。在本发明的另一实施方案中，提供提高生长效率及在微生物中表达多肽的方法。 在一个方面，与葡糖酰化的多肽相比，多肽在发酵阶段显示出增加的效价收率。在本发明的另一实施方案中，提供产生人白细胞介素的方法，包括将所述的人白 细胞介素在微生物中与具有6-磷酸葡糖酸内酯酶(“pgl”)活性的酶共表达。在一个方面， 人白细胞介素是IL-18或其变体。在一个方面，微生物是大肠杆菌。在一个方面，pgl是由 被转化或转染入大肠杆菌中，包括但不限于被转化入基因组或附加体的多核苷酸编码的。在本发明的另一实施方案中，提供产生人白细胞介素的方法，包括在生长于丰富 培养基中的微生物中表达所述的人白细胞介素。在一个方面，人白细胞介素是IL-18蛋 白或其变体。在一个方面，微生物是大肠杆菌。在一个方面，丰富培养基包括植物蛋白 胨(phytone peptone) 0在一个方面，丰富培养基包括细菌用酵母提取物(bacto yeast extract)0在本发明的另一实施方案中，提供没有可检测的感染性lambda噬菌体表达的微 生物。在一个方面，lambda噬菌体的衣壳结构蛋白gpE在微生物内被缺失或被破坏。蛋白 的缺失或破坏能通过数种非_限制性的方法实现。编码蛋白的基因可被或者部分地或者全 部地从微生物中去除。编码蛋白的基因可通过如点突变或随机突变这样的非-限制性技术 在基因上修饰。可用化学方法或酶法切断或修饰蛋白以破坏其结构或功能。可将调控基因 表达的启动子破坏或缺失以消除或降低基因的表达。可以调控溶液条件或温度以影响蛋白 结构或功能。在一个方面，微生物是大肠杆菌。在又一个方面，微生物包括T7RNA聚合酶基 因。下面的实施例说明了本发明的各个方面。这些实施例不限制由附加权利要求所限 定的本发明的范围。
实施例实施例1创建大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的改进菌株，其通过敲除主要的lambda噬菌体的衣 壳结构蛋白gpE，没有可检测的感染性lambda噬菌体表达。此菌株用于在这里显示的实施 例中。对gpE编码区的413个碱基对内部片段进行PCR扩增，应用以下引物5' AGCTGGCCATTGCTCAGGTCGAAG 3‘ (SEQIDN0:1)5' GTACTGTCCGGAATACACGACGATG 3‘ (SEQ ID NO 2)并以BL21(DE3)染色体DNA作为模板。得到的片段为AGCTGGCCAT TGCTCAGGTC GAAGAGATGC AGGCAGTTTC TGCCGTGCTT
AAGGGCAAAT ACACCATGAC CGGTGAAGCC TTCGATCCGG TTGAGGTGGATATGGGCCGC AGTGAGGAGA ATAACATCAC GCAGTCCGGC GGCACGGAGTGGAGCAAGCG TGACAAGTCC ACGTATGACC CGACCGACGA TATCGAAGCCTACGCGCTGA ACGCCAGCGG TGTGGTGAAT ATCATCGTGT TCGATCCGAAAGGCTGGGCG CTGTTCCGTT CCTTCAAAGC CGTCAAGGAG AAGCTGGATACCCGTCGTGG CTCTAATTCC GAGCTGGAGA CAGCGGTGAA AGACCTGGGCAAAGCGGTGT CCTATAAGGG GATGTATGGC GATGTGGCCA TCGTCGTGTATTCCGGACAG TAC(SEQ ID NO 3)应用标准的方法对PCR扩增产物进行TA克隆，并验证其序列。然后，将氯霉素抗性 基因的功能拷贝导入EcoRV位点，该位点位于克隆的gPE序列中间并以粗体显示。然后插入 了氯霉素的gpE片段构建体被用作线性同源重组敲除载体，所述载体用于位于大肠杆菌宿 主菌株BL21(DE3)中的lambda (DE3)gpE基因的基因敲除。除了应用本文所述的载体之外， 如 Kirill A. Datsenko andBarry Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci USA 2000 ；97 6640-6645 所述将此敲除载体导入宿主细胞，通过在存在6 μ g/ml的氯霉素的条件下生长的能力，初 步鉴别出推定的gpE敲除体，并随后通过PCR分析进行确认。保存一个这种BL21 (DE3)的 gpE敲除体，并给出GSK定名ECC-023。在非常敏感的噬菌斑测定中检测ECC-023中感染性噬菌体颗粒的存在。如表1中 所示，在不诱导亲代BL21(DE3)表达噬菌体时，其表达勉强可检出量的噬菌体，大约20pfu， 但是通过对遗传损伤(紫外照射)的SOS应答来诱导时，所述表达大约高三个数量级。然 而，即使被处理以诱导SOS应答时，gpE敲除衍生物ECC-023也不产生感染性噬菌体的任何 证据。数据显示，BL21(DE3)衍生物ECC-023不产生任何可检测的感染性噬菌体颗粒，并因 此它对于生物制药来说是适合的宿主细胞菌株。表1 从大肠杆菌产生感染性噬菌体颗粒。
权利要求
分离的多核苷酸，包括与SEQ ID NO7中列出的多核苷酸具有至少90％的序列同一性的多核苷酸。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，包括与编码多肽的多核苷酸具有至少90%同一性的 多核苷酸，所述的多肽包含与SEQ ID NO :8具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的DNA编码显示6-磷酸葡糖酸内酯酶活性 的蛋白。
4.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的DNA序列在SEQID NO 7中列出。
5.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的DNA序列与来自铜绿假单胞菌的、编码 6-磷酸葡糖酸内酯酶的DNA具有至少90%的序列同一性。
6.权利要求1的分离的多核苷酸，进一步包括编码人白细胞介素-18的多核苷酸。
7.分离的多核苷酸，包括与SEQID NO :7中列出的多核苷酸具有至少95%的序列同一 性的多核苷酸。
8.生产人白细胞介素的方法，包括使所述的人白细胞介素在微生物中与具有6-磷酸 葡糖酸内酯酶(“pgl”)活性的酶共表达。
9.权利要求8的方法，其中所述的人白细胞介素是IL-18。
10.权利要求8的方法，其中所述的微生物是大肠杆菌。
11.权利要求10的方法，其中所述的pgl是由被转化入所述大肠杆菌基因组中的多核 苷酸编码的。
12.生产人白细胞介素的方法，包括在生长于丰富培养基中的微生物中表达所述的人 白细胞介素。
13.权利要求12的方法，其中所述的人白细胞介素是IL-18。
14.权利要求12的方法，其中所述的微生物是大肠杆菌。
15.权利要求12的方法，其中所述的丰富培养基包括植物蛋白胨。
16.权利要求12的方法，其中所述的丰富培养基包括细菌用酵母提取物。
17.微生物，其完全不表达感染性lambda噬菌体。
18.权利要求17的微生物，其中lambda噬菌体的衣壳结构蛋白gpE被缺失或被破坏。
19.权利要求17的微生物，其中所述的微生物是大肠杆菌。
20.权利要求17的微生物，其含有T7RNA聚合酶基因。
全文摘要
本发明涉及防止在微生物中所产生多肽的葡糖酰化的方法。
文档编号H01L27/148GK101942470SQ20091020734
公开日2011年1月12日 申请日期2004年3月4日 优先权日2003年3月4日
发明者亚历山大·H·泰勒, 托马斯·D·斯韦策, 普拉马西什·S·帕特尔, 艾伦·R·加德纳 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司