一种N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶试剂及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶检测技术领域，特别涉及一种N-乙酰-β-D 葡萄糖苷酶检测试剂，还涉及使用此检测试剂的检测方法。
【背景技术】
[0002] Ν-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG)是存在于细胞溶酶体内的一种水解酶， 广泛分布于人体各组织中，但在前列腺和肾脏近端肾小管中含量最高。NAG分子量约为 130-140KD，在正常情况下，血清中NAG不能通过肾小球从尿中排泄。尿中NAG主要来自肾 近曲小管上皮细胞，但健康人尿中含量甚微。尿NAG活性水平的增高，是早期肾损伤和糖尿 病微血管病变的敏感指标。NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合 症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。上述疾病时NAG活性的升 高均早于其他相应指标，有利于疾病的早期发现和及时治疗。NAG活性还可用于重金属等肾 毒性物质环境污染的人群筛查、职业病调查等。
[0003] 目前，NAG的应用广泛的检测方法有PNP-NAG法、CNP-NAG法，MPT-NAG法等方法。 PNP-NAG法是以P-硝基苯酚-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（PNP-NAG)做为底物，在NAG作 用下，生成N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖在N-乙酰氨基葡萄糖氧化酶（NAG0D)的 作用下生成H202。H202在过氧化物酶（P0D)的作用下与高灵敏的发色剂双〔3-双（4-氯 酚）甲基-4-二甲氨苯基〕胺（BCMA)反应，生成绿色色素。通过测定此色素可求得NAG的 活力。此底物价廉，容易获得，但是必须设定样本空白，而且操作时间较长，不适合大批量自 动化分析。CNP-NAG法是以2-氯-4-硝基苯乙酰氨基葡萄糖苷为底物，经NAG酶解后的产 物不需碱化可直接呈色，，无需设样品空白，可实现大批量自动化操作，但底物较难溶，测定 时需严格控制缓冲液pH值，底物溶液以新鲜配制为宜，操作繁琐。MPT-NAG是的测定原理 是NAG催化6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG)水解，生成产 物6-甲基-2巯基吡啶（ΜΡΤ)，ΜΡΤ在340nm处有强烈吸收能力，通过测定340nm处每分钟 的吸光度增加速度计算NAG的活力。
[0004]在此基础上，本发明使用了新型的VRA-NAG[(4-(3-甲基-苯乙烯)-绕丹宁-3-乙 酸氨基-N-乙酰氨基-beta-D-葡萄糖苷]物，它是一种新的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷 酶的衍生物，它与其他的底物相比具有水溶性好，稳定性强的优点。此外，采用柠檬酸-柠 檬酸钠缓冲体系，并添加多种表面活性剂起助溶作用，稳定剂起稳定作用，是一种更加稳 定，抗干扰能力更强的NAG试剂。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测尿液中NAG的试剂及使用该试剂检测NAG含 量的方法。该试剂盒采用VRA-NAG作为新型底物，可以更加有效的检测NAG含量，具有稳定 性好，抗干扰能力强的特点。
[0006]基本原理 底物VRA-NAG在样品中的NAG的催化下，水解释放出有色化合物集团VRA，它在505nm波长处有吸收峰，检测505波长处吸光度的增加值就可以计算出NAG活性。
[0007] 本发明是通过以下步骤得到的： 一种NAG检测试剂，包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1和试剂R2的组成如下： 1) 试剂R1的组分为： 缓冲液...............................................100mmol/L VRA-NAG...............................................3mmol/L BSA...................................................lg/L 乙二醇................................................lml/L TritonX-100...........................................lml/L 抗坏血酸氧化酶........................................lml/L 防腐剂................................................2mmol/L 2) 试剂R2的组分为： 缓冲液.................................................lmol/L 防腐剂.................................................2mmol/L 所述的NAG检测试剂，试剂R1中缓冲液为25°C，PH为5. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲 液。
[0008] 所述的NAG检测试剂，试剂R2中缓冲液为25°C，PH为10. 2的碳酸钠-碳酸氢钠 缓冲液。
[0009] 所述的NAG检测试剂，所述防腐剂为NaN3。
[0010] 所述的NAG检测试剂来检测NAG的方法，使用全自动生化分析仪利用终点法进行 测定，检测主波长为505nm〇
[0011] 所述的检测方法，R1试剂和R2试剂的比例为3 :1。
[0012] 本发明的有益效果： 1)采用新型底物VRA-NAG，此底物与其他底物相比水溶性好，稳定性强，是一种可靠的NAG底物。
[0013] 2)采用表面活性剂TritonX-100以及乙二醇，对于底物的溶解具有很显著的助溶 作用，并增强了试剂的抗干扰能力。
[0014] 3)采用新的缓冲体系柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，大大提高了试剂的分析灵敏 度。
【附图说明】
[0015] 图1为两种试剂的相关性曲线图。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明进行机一步说明： 实施例1 N-乙酰-β-D葡萄糖苷酶的检测试剂，包括试剂R1和试剂R2 : 1)试剂R1的组分为： 柠檬酸-磷酸氢二钠钠缓冲液（ΡΗ=5· 0).....................100mmol/L VRA-NAG.................................................3mmol/L BSA.....................................................lg/L 乙二醇..................................................lml/L TritonX-100..............................................lml/L 抗坏血酸氧化酶..........................................lml/L 防腐剂NaN3...............................................2mmol/L 2) 试剂R2的组分为： 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（ΡΗ=10· 2).........................lmol/L 防腐剂NaN3...............................................2mmol/L 3) 本实施例试剂的使用方法： 本实施例描述的NAG检测试剂，在使用时采用双试剂功能的全自动生化分析仪，如日 立7180全自动生化分析仪等，利用两点终点法进行测定。将R1和R2按照3 :1的比例放置 到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1 : 表1实施例1试剂检测方法
计算：NAG含量（U/L) =(ΔΑ测定+ΔΑ标准）XC标准。
[0017] 实施例2 干扰性试验：取新鲜尿液，分为2等份，然后将每等份再分为5等份，加入不同的干扰物 质，使其在尿液中浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可 的NAG试剂同时对比测定血清中UA的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的 测定结果见表2。相对偏差（%) =(干扰样本的测定均值一对照样本的测定均值）/对照样本 的测定均值X100%。
[0018] 由表2可以看出，实施例1试剂在乳酸< 0. 9g/L、丙酮酸< 20mg/L、酒石酸< 17 mg/L、尿酸彡g/L、葡萄糖彡g/L、胆红素彡mg/L对测定结果没有明显干扰。而对照试剂在 上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明实施例1试剂的抗干扰性能远远优于对 比试剂。
[0019] 表2实施例试剂抗干扰性能比较
实施例3 相关性试验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认 可的某公司的NAG试剂盒进行对照检查，同时检测了 20个临床样本，检测结果如表3所示。 并获得了两种试剂的相关性曲线(如图1所示)，通过结果显示，两个试剂盒的相关系数为 0. 9994,说明两者有极大的相关性。
[0020] 表3实施例1与市场常见并得到认可的NAG测定试剂盒对比检测结果
实施例4 分析灵敏度实验：用本发明NAG检测试剂盒测试已知浓度为38U/L的样本，记录吸光 度差值。同时用市场认可的NAG试剂测试作为对照。检测结果如表4所示。
[0021] 表4 分析灵敏度实验结果_
通过检测数据可知，对照试剂的吸光度差值比实施例1的高，说明柠檬酸-磷酸氢二钠 缓冲液使试剂的缓冲能力得到提高，并大大提高了试剂的分析灵敏度。
【主权项】
1. 一种N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶检测试剂，包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1和 试剂R2的组成如下： 试剂R1的组分为： 缓冲液...................................................100mmol/L VRA-NAG...................................................3mmol/L BSA.......................................................lg/L 乙二醇...................................................lml/L TritonX-100................................................lml/L 抗坏血酸氧化酶............................................lml/L 防腐剂....................................................2mmol/L 试剂R2的组分为： 缓冲液....................................................lmol/L 防腐剂....................................................2mmol/L〇2. 根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于使用新型底物VRA-NAG。3. 根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于试剂R1缓冲液为PH5. 0的柠檬 酸-磷酸氢二钠缓冲液。4. 根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于试剂R2缓冲液为PH10. 2的碳酸 钠-碳酸氢钠缓冲液。5. 根据权利要求1所述的NAG检测试剂，其特征在于所述防腐剂为NaN3。6. -种使用权利要求1-5中任一项所述的NAG检测试剂来检测NAG的检测方法，其特 征在于使用全自动生化分析仪利用两点终点法进行测定，检测主波长为505nm。7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于R1试剂和R2试剂的比例为3:1。
【专利摘要】本发明试剂NAG检测技术领域，特别试剂一种NAG检测试剂，试剂R1中含有缓冲液、VRA-NAG、牛血清白蛋白、TritonX-100、乙二醇、抗坏血酸氧化酶、防腐剂；试剂R2中含有缓冲液、防腐剂。本试剂采用新型底物VRA-NAG，此底物与其他底物相比水溶性好，稳定性强，是一种可靠的NAG底物。本试剂使用柠檬酸-磷酸氢二钠做缓冲液，大大提高了试剂的缓冲能力，同时不破坏反应体系。添加TritonX-100以及乙二醇做助溶剂，促进底物溶解，具有明显助溶效果。添加BSA做稳定剂，大大增强了试剂的稳定性以及抗干扰能力。产品配置简单，价格低廉，非常适合大面积临床推广。
【IPC分类】G01N33/573
【公开号】CN105424934
【申请号】CN201510723864
【发明人】谭柏清, 刘慧 , 王绮, 赵新
【申请人】山东博科生物产业有限公司
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年10月30日