专利名称：氯化糖衍生物的酶促去乙酰化反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产l-6-二氯-l-6-二脱氧-(3-呋喃果糖-4-氯-4-脱氧-吡喃 半乳糖苷(TBS)的新方法和新策略，包括在氯化反应后获得的6-0-保护的 TGS的酶促去乙酰化反应。
背景技术：
现有技术方法生产4，1，,6，三氯半乳蔗糖(TGS)的策略主要包括通过使 用来自形成氯化的蔗糖-6-酯的Vilsmeier-Haack试剂来氯化蔗糖-6-酯以形成 6-乙酰基-4， r，6，-三氯半乳蔗糖，所述Vilsmeier-Haack试剂使用诸如三氯氧 磷、草酰氯、五氯化磷等的不同氯化试剂和诸如二甲基甲酰胺(DMF)的三 级酰胺(tertiary amide)。所述氯化反应后，使用适宜的钙、钠等的碱性氢氧 化物中和反应物料至pH 7.0 7.5。然后使用钙、钠、钾等的碱性氢氧化物进 一步使已中和物料的pH升至9.5或更高以使6-乙酰基-4， l'，6，-三氯半乳蔗糖 去酯化/去乙酰化形成4,1，，6，三氯半乳蔗糖。这一碱去酯化反应/去乙酰化反应 包括将反应物暴露于碱性范围内的苛刻pH中，这导致了大量DMF被破坏， 这是昂贵的投入，不利地影响其在反应后的回收。在现有技术方法中，该反应混合物在去乙酰化反应时也暴露于苛刻温度 中，这导致了产物TGS自身的破坏。因此，需要一种不暴露DMF至破坏的去乙酰化的方法。已经发展了一种方法，其在不暴露DMF至破坏的pH下完成酶促去乙酰化。发明内容Palmer等(1995)在美国专利no. 5445951己经报道了酶促去乙酰化反应以 制备蔗糖的部分乙酰化的衍生物，其利用蔗糖酯的酶促去乙酰化反应，从无 水有机介质中的蔗糖酯，用能催化所述蔗糖酯去乙酰化的一种酶或酶的组合以产生在预选位置具有自由羟基的部分去乙酰化的蔗糖衍生物，并且回收所 获得的部分去乙酰化的蔗糖衍生物，所述的蔗糖酯选自由蔗糖八酰酯(sucrose octaacylate)、蔗糖七酰酯和蔗糖六酰酯组成的组。关于蔗糖酯或其衍生物/前体的酶促去乙酰化反应没有其它已知的报道。 本发明涉及在制备人工甜味剂TGS期间氯化反应后获得的6-0-保护的 TGS的酶促去乙酰化。可以进行本发明所述过程的氯化反应混合物的实施方 式包括但不限于，蔗糖-6-酯与一种氯化试剂混合后所获得的工艺液流，所述 氯化试剂描述于Mufti等(1983)美国专利no 4380476 、 Walkup等(1990 No.4980463)、 Jenner等(1982)美国专禾!jno. 4,362,869、 Tulley等(1989)美国专利 no. 4,801,700、 Rathbone等(1989)美国专禾Uno. 4,826,962、 Bornemann等(1992) 美国专利no. 5,141,860、 Navia等(1996)美国专禾lJno. 5,498,709、 Simpson (1989) 美国专利no. 4,889,928、 Navia (1990)美国专禾廿no. 4,950,746、 Neiditch等(1991) 美国专利no. 5,023,329、 Walkup等(1992) 5,089,608、 Dordick等(1992)美国专利 no. 5,128,248、 Khan等(1995)美国专利no. 5，440，026、 Palmer等(1995)美国专利 no. 5,445,951、 Sankey等(1995)美国专利no. 5,449,772、 Sankey等(1995)美国专 利no. 5,470,969、 Navia等(1996)美国专利no. 5,498,709、 Navia等(1996)美国专 利no. 5,530,106。在6-0-保护的TGS中间产物分离后或未分离，中和氯化反应物料后，在 以如上所提及的方式获得的工艺液流上进行酶促去乙酰化反应。由于该酶促 反应，存在于已中和的反应物料中的溶剂三级酰胺不会分解并因此导致所述 溶剂的回收率提高。在本发明中，用适宜的碱中和氯化反应后的氯化反应物 料。中和时，pH被控制为低于6.0，形成的化合物TGS在6位仍旧具有完整 的被保护基团。在带有或不带有分离所述化合物下进行该6位的去保护(deblocking)。另外的一些参考文献也指出可在有或没有三级酰胺和其它溶 剂和水溶液条件下进行该去保护。本发明描述了使用酶促方法在6位去乙酰化反应，其中，在三级酰胺(包括用于氯化反应的DMF)存在或不存在时，酶选择性地除去被保护的基 团。本发明的方法对不是氯化反应结果的实施方式(例如纯TGS-6-酯的单一 溶液)的去乙酰化效果也很好。催化去乙酰化反应的酶是众所周知的，酯酶和蛋白水解酶在温和的反应条件下进行去乙酰化和乙酰化反应并且已经被Soedjak HS, Spradlin JE (1994). Biocatalysis 11: 241—248; Therisod M, Kliba, AM (1986) J. Am. Chem. Soc. 108: 5638 — 5640; B. Cambou and A.M. Klibanov, J. Am. Chem. SOC., 106,2687(1984); Kirpal S Bisht,Pure & Appl. Cbem., Vol. 68， No. 3， pp. 749-752, 1996; F丄Ploul;—, M.A. Crucesl, Biotechnology Letters 21: 635—639， 1999广泛 地报道。在本发明中，反应物料中和后，使用适宜的碱调节pH至6.5。然后在室 温搅拌下，将酯酶缓慢地加入到反应物料中。取决于酶活性和反应条件，加 到反应物料中的酶量在10% 40% w/v变化。在已中和的反应物料中三级酰 胺含量大约10% 40%。将反应混合物持续搅拌10 60h的时间，优选16 20h。通过TLC监测6-0-保护的TGS到TGS的转变。彻底去乙酰化以后， 反应混合物利用亲和色谱层析进行TGS分离。然后利用适宜的方法结晶该分 离的TGS。6-0_保护的TGS去乙酰化为TGS所使用的酯酶或蛋白水解酶可以是其天 然形式或固定化形式。当使用固定化酶时，该酶在完成去乙酰化反应后被过 滤掉。该回收的酶还可以再利用。该固定化酶也可以填充到柱中并且反应物 料可以通过该柱以及可以进行6-0-保护的TGS原位去乙酰化。这些酶可以固 定在合成的聚合物载体中或其上，所述载体例如但不限于聚丙烯酸、或聚苯 乙烯或聚丙烯酰胺、尼龙基的载体；或半合成或天然有机载体，例如基于多 聚糖(例如但不限于纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、几丁质等) 的那些载体；或者无机载体，例如基于碳、二氧化硅、氧化锆、氧化铝、磷 酸锆等的那些载体。酯酶的来源可以是动物、植物或微生物源，优选微生物或细菌源的，例 如5ac/〃tw Aermocafewiz/a^s^, i^ewcfewwway aerag/wosa等；真菌源的，例如 尸ew'c/〃/讓Aogw^/bW/， A/7e/7力'〃"s mger， v4s/7er^〃m" / /z/zof^ "/ve叫在所述发明的过程期间，TGS产物没有暴露于如在使用酸、碱的常规去 乙酰化过程的情况下的任何苛刻的pH或温度条件中。相比于任何其它形式 的去乙酰化过程该产物损失最小化。在所述发明的过程期间，三级酰胺没有暴露于如在使用酸、碱的常规去 乙酰化过程的情况下的任何苛刻的PH或温度条件。因此根本没有发生三级 酰胺的分解。从而三级酰胺的回收效率很大程度地得以提高。下面描述的是实施例，其说明了本发明的工作而不以任何方式限制本发 明的范围。反应物、使用的反应物的比例、描述的反应条件的范围、使用的 酶等仅仅是说明性的并且范围延伸至其类似的反应物、反应条件和类似通性 的反应。通常，对氯化蔗糖生产领域技术人员显而易见的任何等效替代被包 括在本说明书的范围内。因此，提及乙酸酯包括了可以进行本发明讨论的相 同功能的任何等效的酯基团，而使用酶将包括能够在类似反应条件下，提供 本文所描述的酶作用或类似作用的任何替代。实施方式的许多其它改变将被 本领域技术人员很容易地预想并且它们也被包括在本说明书的范围内。除非 文中不允许，所提及的单数也被认为包括其复数形式，即，使用用于提取的 "一种有机溶剂"包括使用一种有机溶剂或连续使用多种有机溶剂或作为混合 物组合使用多种有机溶剂。
具体实施方式
实施例l、蔗糖-6-乙酸酯的氯化反应在5L反应烧瓶中加入1280ml二甲基甲酰胺并冷却至0 5°C。然后在搅 拌下缓慢加入635g五氯化磷(5.4mol)，保持反应物料的温度低于30°C。将 该物料进一步冷却至低于0°C并且在-5。C缓慢加入蔗糖-6-乙酸酯的DMF溶 液。然后将反应物料加热至80°C并保持lh，进一步加热至100°C并保持 6h，最终达到U0 115。C并保持2 3h。利用HPLC分析监测该反应的进 程。然后，将反应混合物冷却到-5 -8°C并且缓慢加入20%氢氧化钠溶液以 便将物料的pH升到5.5 6.5。利用此方法获得的产率是55.4%的蔗糖输入。实施例2、利用酯酶进行6-0-乙酰基TGS的酶促去乙酰化反应使用50%的氢氧化钙浆液将1.5L按照实施例1描述所制备的、含有15g 6-0-乙酰化TGS的反应物料中和至pH 7.5。用水将已中和的反应物料稀释至 6L。在该己中和的物料中的DMF含量是33%。在环境温度下，将8化分离自Ap^g/〃M oo/zae ATCC 26850; NCIM 1212的酯酶持续搅拌地加入到反应 混合物中。反应持续几小时并且由TLC监测TGS的生成以及6-0-乙酰化 TGS的消失。在42h最后，完成高至98.4%的去乙酰化。 去乙酰化后，利用适宜的方法将该物料进行TGS分离。实施例3、利用在Endragit RL100上的固定化酯酶进行6-0-乙酰基TGS的 酶促去乙酰化反应在一个实验中，使用50%氢氧化钙浆液将2.5L含有80g 6-0-乙酰化TGS 的反应物料中和至pH5.5。用水将已中和的反应物料稀释至6L。在该己中和 的物料中DMF的含量是33%。在25。C 30。C的温度(通常是环境温度)， 120g在Eudragit RL100上的固定化酯酶持续搅拌地加入到反应混合物中。反 应持续几小时并且由TLC监测TGS的生成以及6-0-乙酰化TGS的消失。在 24h最后，完成高至98.3%的去乙酰化。然后过滤该物料并进行TGS分离。从过滤器滤饼中获得的酶用水冲洗并 储存以再次使用。实施例4、利用填充到柱中、在Eudragit RL100上的固定化酯酶进行6-O-乙 酰基TGS的酶促去乙酰化反应在一个实验中，将12g固定化酶填充到直径2cm且高8cm的玻璃柱。柱 的入口连接到蠕动泵的输出端(delivery)且出口连接到含有500ml已中和的 物料(具有5g6-O-乙酰基-)的烧瓶。蠕动泵的入口也连接到该己中和的物 料。己中和的物料以5ml/min的流速通过固定化的酯酶床循环6小时。每隔一小时进行TLC以观察烧瓶中发生的去乙酰化反应的程度。6小时 后，观察到高于98%的去乙酰化。6-0-乙酰基-TGS去乙酰化为TGS完成后，固定化酶的床用去离子水冲 洗并在10%丙酮水溶液下储存直到再次使用。实施例5、利用Alcalase -—种蛋白水解酶进行6-0-乙酰基TGS的酶促去乙 酰化反应将1.0L含有10g 6-0-乙酰化TGS的、氯化后的已中和物料进行酶促反 应。用水将该己中和的反应物料稀释至3.0L。在25 30°C温度下，将从 Novozymes巿售获得的衍生自B. lichenformis的200ml Alclalase 2.4L酶加入 到反应物中。反应持续几小时并且由TLC监测TGS的生成以及6-0-乙酰化 TGS的消失。在36h最后，完成高至96.4%的去乙酰化。去乙酰化后，使用 适宜的方法将该物料进行TGS分离。
权利要求
1. 一种生产氯化蔗糖化合物的方法，其中利用能够除去保护基团的酶的作用使在溶液中的6-O-保护的蔗糖去保护。
2、 根据权利要求l所述的方法，其中a、 所述6-0-保护的蔗糖包括蔗糖-6-乙酸酯、蔗糖-6-苯甲酸酯、蔗糖-6-丙酸酯、蔗糖-6-月桂酸酯、蔗糖-6-戊二酸酯、蔗糖-6-棕榈酸酯等的一种或多 种，b、 所述溶液包括一纯的6-0-保护的蔗糖溶液，或(ii) 一在生产氯化蔗 糖化合物的方法中获得的工艺液流。
3、 根据权利要求2所述的方法，其中a、 所述工艺液流包括一种或多种生产氯化蔗糖的方法，包括氯化蔗糖或 蔗糖衍生物的方法，和b、 所述氯化蔗糖化合物包括一种或多种的氯化蔗糖，包括三氯半乳蔗 糖、二氯半乳蔗糖、四氯半乳蔗糖等。
4、 根据权利要求3所述的方法，其中所述氯化的方法包括将蔗糖或蔗糖 衍生物与一种或多种氯化试剂利用下述一种或多种方法反应，包括a、 溶解在吡啶中的蔗糖与磺酰氯的反应，或b、 在三苯基膦和1,1,2-三氯乙烷存在下，蔗糖与亚硫酰氯的反应，或c、 蔗糖-6-酯与通式为[HClC二N+R2]Cr或[HPOCl2OC +=N "R2]Cr的 Vilsmeier试剂反应，其中R表示烷基，优选甲基或乙基。
5、 根据权利要求4所述的方法，其中能够除去保护基团的酶的作用是获 得自酯酶或蛋白酶。
6、 根据权利要求5所述方法，其中所述酯酶或蛋白酶是自由的或固定化 的酶。
7、 根据权利要求6所述的方法，包括步骤a、 将在(i) 一溶液或(ii) 一生产氯化蔗糖的反应中获得的工艺液流中 含有的蔗糖-6-乙酸酯用氯化试剂氯化，所述氯化试剂选自由Vilsmeier试剂、磺酰氯或亚硫酰氯组成的组，b、 调节本权利要求步骤(a)的工艺液流的pH至大约6.5 7，c、 将步骤(a)的工艺液流中形成的6-0-保护的TGS去乙酰化，其 (i)通过将其与自由的或固定化的酯酶、或者自由的或固定化的蛋白酶接触，优选伴随着在反应容器中震荡或者利用通过填充到柱中的酶床再循环， 优选在大约25 3(TC的环境温度足够时间以完成最大可能大约95%的去乙酰d、 从本权利要求步骤(c)的工艺液流的一种不想要的组分中分离 TGS。
全文摘要
本发明描述了生产三氯半乳蔗糖的方法，其中通过将氯化后的反应混合物进行中和并调节pH至6.5～7以利用游离或固定化形式的酯酶或蛋白酶去乙酰化，完成蔗糖-6-酯的去乙酰化。
文档编号C07H5/02GK101282983SQ200680034612
公开日2008年10月8日 申请日期2006年9月21日 优先权日2005年9月22日
发明者P·萨布拉曼亚姆, 拉克什·拉南, 森迪普·奥萝拉, 阿尔文·M·拉莉, 阿查纳·阿维纳斯·科蒂雅, 马尼施·瓦德哈拉杰·佩特卡 申请人:法马德医疗保险私人有限公司