一种产n-乙酰氨基葡萄糖的工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺。
[0002]
【背景技术】
[0003] 甲壳素（CsH1305N)n，又名几丁质、甲壳质或壳多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖通过糖 苷键结合起来的聚合物，是一种含氮多糖类物质，为虾、蟹、昆虫等甲壳的重要成分。在自然 界中分布极其广泛，且含量仅次于纤维素，是世界第二大自然可再生资源。
[0004] N-乙酰氨基匍萄糖是壳多糖保健食品系列中最新的第二代保健机能性食品添加 剂，可作低热量的甜味剂，也可作为抗癌、防癌、降血脂、降血压的食品添加剂，也可作为糖 尿病患者的食品添加剂。主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞 的过度生长，对癌症和恶性肿癌能起到抑制和治疗作用，此外，N-乙酰氨基葡萄糖对于骨关 节炎及关节疼痛具有极佳的治疗作用。目前市场上多以其盐酸盐及硫酸盐出售。
[0005] N-乙酰氨基葡萄糖生产法主要是通过化学法，但此法环境污染巨大、反应效率低、 产品质量差、过程不易控制等缺点，已逐步被生物酶法降解几丁质取代。但用生物酶法难以 避免因为发酵液的组分复杂，造成产物的后期分离难度及成本大大增加。此外，转化过程难 以控制，极易出现染菌的情况。
[0006]
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺， 所得N-乙酰氨基葡萄糖纯度高，工艺简单，易操作，适合产业化。
[0008] 为解决现有技术的问题，本发明采取的技术方案为： 一种产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，包括以下步骤： 步骤1，几丁质粗酶液的制备 选几丁质酶生产菌株，培养得种子液，再以体积分数5°/p10%接种量接入装有产酶发酵 培养基的发酵罐，其中，产酶发酵培养基的装液量为40~60%，培养温度24°C ~37°C，转速为 200~500 rpm，通气量lvvm~3 vvm，初始pH 7.0~8.0,发酵72~96 h后收集发酵液，发酵液在 低温离心机进行6000~8000 g离心，分离菌体，收集上清，即得几丁质酶粗酶液； 步骤2,几丁质酶与几丁质的亲和吸附 向几丁质酶粗酶液中加入10-40 g/L的粉粒几丁质，在4-37°C下搅拌50-400 rpm，调 节 pH 至 4. 0-8. 0,亲和吸附 10-180 min ; 步骤3, N-乙酰氨基葡萄糖的生产 将步骤2中吸附酶的粉粒几丁质从粗酶液里分离出来，加入纯水后25-37Γ，200-400 rpm下无菌转化得转化液； 步骤4, N-乙酰氨基葡萄糖的分离 将转化液离心，取上清液清除蛋白和色素后，浓缩干燥得产品。
[0009] 作为上述工艺优选的是，所述产几丁质酶的菌株为ier 做?份（CGMCC3438，ATCC BAA-2140)或 6·/λ CCTCC NO :M2014113)。
[0010] 作为上述工艺优选的是，步骤3中分离吸附酶的粉粒几丁质的方法为离心或抽 滤。
[0011] 作为上述工艺优选的是，步骤3中无菌转化加入几丁质酶耐受有机试剂，所述有 机试剂为正己烷、正庚烷或环己烷中任一种，且体积分数为10%_60%。
[0012] 作为上述工艺优选的是，步骤4中分别采用体积分数为10%_50%的无水乙醇和100 mg/L-2000 mg/L活性炭去除上清液中的蛋白和色素。
[0013] 有益效果 (1)利用了底物几丁质与几丁质酶的特异性亲和作用来吸附几丁质酶，除去了粗酶液 里大部分杂质，然后对吸附有酶的几丁质进行降解不需要外界能量辅助。
[0014] (2)几丁质降解过程中产率高达97. 5%，产物分离简单，产物纯度可达98%，大大降 低了生产成本。
[0015] (3)采用往转化体系中加入酶耐受的有机试剂，可有效地防止染菌，降低了安全隐 患且有机试剂回收再利用。
[0016] (4)转化体系是经过单因子实验优化，得到效率最高的转化体系。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1为几丁质降解产物液相色谱检测（安捷伦HPLC)图谱，其中，5. 857的峰为对 GlcNAc的响应峰。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0021] 实施例1 步骤1，几丁质粗酶液的制备 取 在培养基为（2 g/L葡萄糖，2 g/L 蛋 白胨，0.7 g/L KH2P04,0.3 g/L Κ2ΗΡ04·3Η20,0·4 g/L MgS04.7H20，pH 7·0)37Γ、200 rpm 培养12 h得种子液，按照体积分数5%接种量接入装有液态产酶发酵培养基的7. 5 L发酵 罐，装液量3L，产酶发酵培养基为（5 g/L粉粒几丁质，5 g/L菊芋粉，5 g/L蛋白胨，5 g/L 牛肉膏，〇· 7 g/L ΚΗ2Ρ04,0· 3 g/L Κ2ΗΡ04 · 3Η20,0· 5 g/LMgS04 · 7H20)培养温度 26°C，转速 为250 rpm，通气量1 vvm，初始pH 7.0,80 h结束发酵收集发酵液。发酵液进行7000 g离 心，分离菌体，收集上清，即几丁质酶粗酶液，4°C贮存备用。
[0022] 步骤2,几丁质酶与几丁质的亲和吸附 往步骤1中所得几丁质粗酶液中（1L)加入20 g的粉粒几丁质，温度20°C，搅拌400 rpm，pH 7.0,条件下进行亲和吸附lOmin。
[0023] 步骤3, N-乙酰氨基葡萄糖的生产 步骤2中吸附酶的粉粒几丁质经6000 g离心，收集沉淀，加入纯水重悬，离心，重复三 次，加入纯水1L，在温度35°C，200 rpm条件下无菌转化。其中，转化体系（20g吸附有酶的 粉粒几丁质、体积分数为20%的正庚烷)1250 mL，在温度37°C，200 rpm下搅拌转化48 h。 液相测N-乙酰氨基葡萄糖浓度为19. 5 g/L，产率97. 5%。
[0024] 步骤4, N-乙酰氨基葡萄糖的分离 将步骤3中的转化液，经过离心，对上清液先采用40%乙醇使蛋白析出，离心去除蛋白， 再加入lg活性炭进行除色素，经抽滤即得高纯度的N-乙酰氨基葡萄糖糖溶液，加热浓缩干 燥，经研磨得白色粉末状产品，纯度98%。
[0025] 实施例2 步骤1，几丁质粗酶液的制备 制备 SYBC-H1 种子液，培养基为（2 g/L 葡萄糖， 2 g/L 蛋白胨，0· 7 g/L ΚΗ2Ρ04，0· 3 g/L Κ2ΗΡ04 · 3H20，0· 4 g/L MgS04 · 7H20，pH 7. 0)， 37°C、200 rpm培养12 h，将种子以体积分数7%接种量接入装有液态产酶发酵培养基的7. 5 L发酵罐，装液量3L，产酶培养基为（5 g/L粉粒几丁质，5 g/L菊芋粉，5 g/L酵母膏，5 g/L 蛋白胨，0.7 g/LKH2P04,0.3 g/L Κ2ΗΡ04·3Η20，0·5 g/L MgS04*7H20)培养温度 26°C，转速 为300 rpm通气量1 vvm，初始pH 7.0,80 h结束发酵收集发酵液。发酵液进行8000 g离 心，分离菌体，收集上清，即几丁质酶粗酶液，4°C贮存备用。
[0026] 步骤2,几丁质酶与几丁质的亲和吸附 往步骤1中所得几丁质粗酶液中（1L)加入60 g的粉粒几丁质，温度10°C，搅拌300 rpm，pH 7.0,条件下进行亲和吸附30 min. 步骤3, N-乙酰氨基葡萄糖的生产 步骤2中吸附酶的粉粒几丁质经6000g离心，收集沉淀，加入纯水重悬，离心，重复三 次，加入纯水1L，在温度35°C，250rpm条件下无菌转化。其中，转化体系（60 g吸附有酶的 粉粒几丁质、体积分数为10%的正己烷)2222 mL，在温度37°C，200 rpm下搅拌转化36 h。 液相测N-乙酰氨基葡萄糖浓度为52 g/L，转化率86. 7%。
[0027] 步骤4, N-乙酰氨基葡萄糖的分离 将步骤3中的转化液，经过离心，对上清液先采用50%乙醇使蛋白析出，离心去除蛋白， 再加入1. 5g活性炭进行除色素，经抽滤即得高纯度的N-乙酰氨基葡萄糖糖溶液，加热浓缩 干燥，经研磨得白色粉末状产品，纯度97%。
[0028] 实施例3 步骤2中温度对吸附效果的影响。
[0029] 离心实施例1中收集的发酵液上清，在步骤2吸附酶的过程中，通过改变温度，其 他条件一致，随着温度的升高，吸附能力增大，但随着进一步的升高，吸附效果反而变小。最 终研究表明最适温度为20 °C (见附表2 )。
[0030] 实施例4 步骤2中pH对吸附效果的影响。
[0031] 在实施例3的基础上，变量改为pH，其他条件一致，最终研究表明最适吸附pH为8 (见附表3)。
【主权项】
1. 一种产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，几丁质粗酶液的制备 选几丁质酶生产菌株，培养得种子液，再以体积分数5°/p10%接种量接入装有产酶发酵 培养基的发酵罐，其中，产酶发酵培养基的装液量为40~60%，培养温度24°C~37°C，转速为 200~500rpm，通气量lvvm~3vvm，初始pH7.0~8.0,发酵72~96h后收集发酵液，发酵液在 低温离心机进行6000~8000g离心，分离菌体，收集上清，即得几丁质酶粗酶液； 步骤2,几丁质酶与几丁质的亲和吸附 向几丁质酶粗酶液中加入10-40g/L的粉粒几丁质，在4-37°C下搅拌50-400rpm，调 节pH至 4. 0-8. 0,亲和吸附 10-180min; 步骤3,N-乙酰氨基葡萄糖的生产 将步骤2中吸附酶的粉粒几丁质从粗酶液里分离出来，加入纯水后25-37Γ，200-400rpm下无菌转化得转化液； 步骤4,N-乙酰氨基葡萄糖的分离 将转化液离心，取上清液清除蛋白和色素后，浓缩干燥得产品。2. 根据权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，其特征在于：所述产几丁质酶 Chitinolyticbacter meiyuanensi SYBC-HI^ Chitinibacter sp. GC72〇3. 根据权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，其特征在于：步骤3中分离吸 附酶的粉粒几丁质的方法为离心或抽滤。4. 根据权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，其特征在于：步骤3中无菌转 化加入几丁质酶耐受有机试剂，所述有机试剂为正己烷、正庚烷或环己烷中任一种，且体积 分数为10%_60%。5. 根据权利要求1所述的产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，其特征在于：步骤4中分别采 用体积分数为10%_50%的无水乙醇和100mg/L-2000mg/L活性炭去除上清液中的蛋白和 色素。
【专利摘要】一种产N-乙酰氨基葡萄糖的工艺，通过选取几丁质生产菌株发酵得几丁质酶粗酶液，向几丁质酶粗酶液中加入几丁质，发生亲和吸附，再将吸附上酶的几丁质分离，通过加入纯水搅拌后离心取上清液，最后出去蛋白和色素浓缩干燥得产品。本发明巧妙的利用了底物几丁质与几丁质酶的特异性亲和作用来吸附几丁质酶，除去了粗酶液里大部分杂质，然后对吸附有酶的几丁质进行降解；降解过程中采取了防止染菌措施；此方法能耗低，操作简单，污染少，且降解液中只含有产物、底物与极少量的蛋白，因此产物分离简单，纯度高，实现了以低价值的几丁质为原料低成本生产具有高医疗价值N-乙酰氨基葡萄糖的目的，具有显著的经济效益和社会效益。
【IPC分类】C12N9/42, C12P19/26
【公开号】CN105316377
【申请号】CN201510779357
【发明人】陈可泉, 张阿磊, 王璟, 应晗笑, 曹逊, 欧阳平凯
【申请人】南京工业大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月13日