利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种在毕赤酵母表达系统中生产高效分泌表达核心岩藻糖基转移酶FUT8的方法，属于基因工程领域和蛋白质工程领域。该方法主要包括三个部分：重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8毕赤酵母分泌表达体系的构建、重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的分离纯化和重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8酶活性的检测。本发明合成并分泌表达的核心岩藻糖基转移酶FUT8可广泛用于该蛋白抑制剂、生物学功能和体外寡糖研究，同时，合成的成本低，合成的周期短，技术操作上容易，所得FUT8的纯度高。
【专利说明】
利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的方法
技术领域
[0001]本发明涉及寡糖生物合成，特别是一种利用毕赤酵母表达系统分泌生产重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的方法，属于基因工程领域和蛋白质工程领域。【背景技术】
[0002]大部分糖基转移酶是组装在内质网和高尔基体膜上的具有两个跨膜域的膜蛋白， 糖基转移酶在内质网和高尔基体内将各个单糖催化到相应的糖链上形成具有生物活性的糖链。
[0003]迄今为止，已知的岩藻糖基转移酶有11种，岩藻糖基转移酶基因家族中核心岩藻糖基转移酶Fut8是最古老的基因。GDP-L-岩藻糖:N-乙酰-13-D-葡萄糖胺核心岩藻糖基转移酶(Fut8)是将鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)转移至混合型或复杂型N-聚糖核心结构的最内侧N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的6位碳原子，形成al，6糖苷键连接核心岩藻糖结构的糖基转移酶，故又称a 1，6岩藻糖基转移酶，Fut8主要定位于中部高尔基体，催化底物蛋白的核心岩藻糖基化修饰。
[0004]Fut8是修饰核心岩藻糖基化的唯一的糖基转移酶，其催化反应如图5所示，能够调节蛋白质的空间结构和生物学功能，如分子间相互作用、细胞与细胞间的相互识别、蛋白质的正确定位、细胞信号传导等。FutS^vj、鼠有肺气肿表现型，这是因为转化生长因子1 (TGF1)受体上的核心岩藻糖基缺损则降低转化生长因子1(TGF1)与受体的结合能力，激活基质金属蛋白酶(MMP)的表达，引起肺气肿病变;Fut8基因敲除导致细胞表面的血管内皮生长因子受体表达量下降。另外，Stubbs等发现核心岩藻糖基化程度能影响糖蛋白分子上的 N-糖链的分子构象和柔软性。
[0005]核心岩藻糖基转移酶在很多癌症患者体内表达或活性均有升高，大量获得核心岩藻糖基转移酶是研究核心岩藻糖基转移酶功能的前提，调研发现目前只有在C0S-1哺乳细胞中表达过人源的核心岩藻糖基转移酶，人源核心岩藻糖基转移酶的合成对于体外寡糖修饰具有重要意义，在哺乳细胞内可以合成具有活性的核心岩藻糖基转移酶但其周期长耗资多。
[0006]毕赤酵母表达系统是迄今最为成功的高效表达系统，其遗传背景相对清楚，外源基因可稳定遗传，表达产量高，成本低，特别适合表达有活性的蛋白。另外，作为真核表达系统，毕赤酵母具有类似其他动植物细胞的翻译后修饰功能，蛋白质折叠等。由于毕赤酵母表达系统兼有原核和真核表达系统的优点，在基因工程领域中得到日益广泛的应用，用该系统表达核心岩藻糖基转移酶可以作为理想的选择途径。但至今还未见核心岩藻糖基转移酶在毕赤酵母中成功表达进行大量合成的报道。
【发明内容】
[0007]针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明目的就是提供一种利用毕赤酵母表达系统生产高尔基体膜蛋白核心岩藻糖基转移酶的方法，可以有效解决核心岩藻糖基转移酶制备问题。
[0008]本发明解决的技术方案是包括三个部分:重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8毕赤酵母分泌表达体系的构建、重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的分离纯化和重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8酶活性的检测，具体包括以下步骤
[0009](1)按照Protein Data Bank(UniProtKB-Q9BYC5)人源核心岩藻糖基转移酶结构信息设计融合蛋白序列，利用RCSB PDB公布核心岩藻糖基转移酶蛋白信息去除核心岩藻糖基转移酶N端与高尔基体膜结合的跨膜区域，并在剩余序列的N端引入alpha信号肽，，在C端的终止密码子前引入6个His氨基酸，用于分离纯化标签，方便后续的蛋白质纯化，蛋白质标签为组氨酸(6XHis)，氨基序列表SEQ ID N0.l;
[0010]利用毕赤酵母密码子偏好性合成核心岩藻糖基转移酶FUT8基因，是在不改变核心岩藻糖基转移酶FUT8氨基酸序列的基础上，按照毕赤酵母偏好性密码子对核心岩藻糖基转移酶FUT8全基因序列进行优化并合成，同时在核心岩藻糖基转移酶FUT8的5’端和3’端引入酶切位点。其核苷酸序列表为SEQ ID N0.2;
[0011]所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞X-33。[〇〇12](2)利用限制性内切酶构建重组表达质粒pPICZaA_FUT8，方法是:将步骤(1)中合成的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8与表达质粒载体pPICZaA，利用限制性内切酶进行酶切，回收目的片段，利用T4DNA连接酶将FUT8的酶切片段与质粒载体X酶切片段连接，得到重组表达质粒pPICZaA_FUT8，转化到大肠杆菌TP10中进行扩增；
[0013]其具体操作步骤为:利用限制性内切酶X hoi和X bal将步骤(1)中合成的核心岩藻糖基转移酶基因FUT8与诱导型表达载体pPICZaA进行双酶切，凝胶电泳分离后回收目标 DNA片段即双酶切后的pPICZaA线性片段基因，然后利用T4DNA连接酶对目标DNA片段进行16 °C连接过夜，42°C热击转化大肠杆菌TP10感受态细胞，涂布含25ug/ml Zeocin(博莱霉素) 的LB培养基平板，置于37°C下培养过夜，随机挑取单克隆，抽提重组表达质粒pPICZaA-FUT8,通过双酶切鉴定阳性克隆子；[〇〇14]所述的LB培养基是由酵母粉5g、10g蛋白胨、5g氯化钠，调节pH值至7.2-7.4，加水至1000ml制成。[〇〇15](3)利用限制性内切酶对重组表达载体pPICZaA_FUT8进行线性化后转化毕赤酵母菌细胞X-33的感受态细胞，应用含抗生素的YPDS平板筛选出诱导型阳性转化子；
[0016]利用限制性内切酶Pmel酶切诱导型表达载体pPICZaA-FUT8,取5-20ug质粒进行电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，所用的eppendorf-Eporator电转化仪的参数是:电压 1.5KV，电容阻200 Q，放电时间4.8-5.2ms，电击后立即加入1.0ml冰冷的1.0M山梨醇，30°C 振荡培养l_2h后涂布含有100ug/ml Zeocin的YPDS平板，置于28-30°C培养2-4d后长出诱导型阳性转化子。[0〇17]所述的YPDS平板是由:10g酵母粉、20g蛋白胨、20g-D葡萄糖、15g琼脂，10g山梨醇加水至l〇〇〇ml制成。[〇〇18](4)表达重组蛋白FUT8毕赤酵母菌株的发酵筛选:步骤(3)筛选出的诱导型阳性转化子在BMGY培养基中培养0D600 = 2-6时，换培养基为BMMY进行重组蛋白的诱导表达，诱导 2-4天，发酵液上清以SDS-PAGE检测蛋白质表达量并用蛋白印迹方法检测是否为核心岩藻糖基转移酶，筛选出诱导型高水平分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株；[〇〇19]具体操作为:从步骤(3)中筛选出的诱导型阳性转化子在YPDS平板上划线培养2-3 天，挑取单菌落接种于含有lml BMGY培养基的5ml离心管中，30°C200rpm培养0D600 = 2-6 时，换培养基为BMMY进行重组蛋白的诱导表达，BMMY培养基培养菌株中每24h加入甲醇终浓度为0.5%，并在30°C200rpm培养，诱导2-4d后5000rpm离心收集上清。用SDS-PAGE检测蛋白表达量并用蛋白印迹方法进行检测，每一样品平行两行进行检测，最终筛选获得高水平并正确分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母菌株；
[0020]所述的BMGY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、10g山梨醇、pH6.0的lOOmM磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1 (T4生物素、加水至1000ml制成；
[0021]所述的BMMY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、pH6.0的lOOmM磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1(T4生物素、5ml甲醇，加水至1000ml制成；[〇〇22]通过上述发酵筛选，获得具有高分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母菌株pPICZaA-FUT8/X-33。经检验，表达的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8具有天然生物学活性。
[0023](5)毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化重组人源核心岩藻糖基转移酶 FUT8,将步骤
[0024](4)筛选获得的具有高分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株进行发酵诱导表达2-4天，在5000rpm、4°C对发酵液离心10min，收集上清液，用N1-NTA Sepharose? excel column一步法进行纯化，获得纯化的重组蛋白FUT8。[〇〇25]用平衡缓冲液平衡N1-NAT层析柱10个柱体积，将上述透析平衡后的蛋白样品上柱，进行亲和交换层析，样品上柱完毕后，继续用平衡缓冲液洗20个柱体积，接着分别用含有40、60、80、100、120和200mM咪唑浓度的平衡缓冲液进行梯度分段洗脱，收集洗脱液，即获得纯化后的重组蛋白FUT8，用SDS-PAGE检测蛋白纯化的效果；
[0026]纯化后的核心岩藻糖基转移酶采用脱盐柱的方法除盐，低温保存。
[0027]本发明的有益效果为:表达的重组蛋白去掉了在高尔基体膜上的滞留信号使核心岩藻糖基转移酶成功分泌到培养基中；对基因序列FUT8按照毕赤酵母密码子的偏好性进行优化，使其更适于在毕赤酵母中表达;表达的重组蛋白带有特殊的标签，易于进行重组蛋白的分离纯化；由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化后的FUT8具有酶活性，可以直接用于体外寡糖修饰。合成的成本低，合成的周期短，技术操作上容易，所得FUT8的纯度高。【附图说明】
[0028]图1是本发明合成的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8基因结构示意图；
[0029]图2是本发明的构建的表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8诱导型质粒表达载体pPICZaA_FUT8的示意图；
[0030]图3是本发明的检测核心岩藻糖基转移酶是否表达正确的考马斯亮蓝染色和蛋白印迹示意图，其中，A图为考马斯亮蓝染色:1)预染Marker，2)纯化后的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8，B图为蛋白印迹:1)人源核心岩藻糖基转移酶FUT8抗体检测重组蛋白，2)His 标签抗体检测重组蛋白；
[0031]图4是本发明的检测重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8蛋白酶活性，其中，A为底物检测示意图，a峰为FUT8催化底物峰，出峰时间约为3.7min，B为加入重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8后产生催化反应示意图，a峰为FUT8催化底物峰，出峰时间约为3.7min，b峰为其催化产物峰，出峰时间约为12.8min;[〇〇32]图5是FUT8催化反应模式图。【具体实施方式】[〇〇33]以下结合附图和具体情况对【具体实施方式】做详细说明。
[0034]本发明在具体实施中，包括以下步骤:
[0035](1)按照Protein Data Bank(UniProtKB-Q9BYC5)人源核心岩藻糖基转移酶结构信息设计融合蛋白序列，以实现利用毕赤酵母分泌表达核心岩藻糖基转移酶。去除核心岩藻糖基转移酶N端与高尔基体膜结合的跨膜区域，并在剩余序列的N端引入a 1 pha信号肽 (Native saccharomyces cereisiae secret1n signal)，在C端弓丨入6个His氨基酉爱用于分离纯化标签。序列表SEQ ID N0.1;
[0036]按照毕赤酵母密码子偏好性合成重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8基因的核苷酸序列表SEQ ID N0.2;[〇〇37]所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞X_33(市售产品，如ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心、ISF中国农业科学院土壤肥料研究所或CGMCC普通微生物菌种保藏管理中心保减的囷株)；
[0038](2)利用限制性内切酶酶切步骤(1)中合成的核心岩藻糖基转移酶基因与表达质粒载体pPICZaA，构建重组表达质粒pPICZaA_FUT8，方法是，将合成的基因序列核心岩藻糖基转移酶FUT8与质粒载体pPICZaA利用限制性内切酶进行酶切，回收目的片段，利用T4DNA 连接酶将核心岩藻糖基转移酶FUT8的酶切片段与质粒载体pPICZaA的酶切片段连接，得到重组表达质粒pPICZaA_FUT8，转化到大肠杆菌TP10中进行扩增；[〇〇39](3)利用限制性内切酶对重组表达载体pPICZaA_FUT8进行线性化后转化毕赤酵母X-33的感受态细胞，应用含抗生素的YPDS平板筛选出诱导型阳性转化子；
[0040](4)表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8毕赤酵母菌株的发酵筛选:从步骤(3) 筛选出的诱导型阳性转化子在BMGY培养基中培养至0D600 = 2-6时，BMMY培养基进行重组蛋白的诱导表达，诱导2-4天，发酵液上清以SDS-PAGE检测蛋白质表达量并用蛋白印迹方法检测是否为核心岩藻糖基转移酶蛋白，筛选出诱导型高水平分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株；
[0041](5)毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化重组人源核心岩藻糖基转移酶 FUT8,将步骤(4)筛选出的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株进行诱导表达2-4天，发酵上清液用N1-NTA Sepharose? excel column—步法进行纯化，获得纯化的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8。[〇〇42]每一步骤的具体操作如下；[〇〇43]步骤(1)中所述的按照毕赤酵母密码子偏好性合成核心岩藻糖基转移酶FUT8基因的核苷酸序列，是在不改变核心岩藻糖基转移酶FUT8氨基酸序列的基础上，按照毕赤酵母偏好性密码子对核心岩藻糖基转移酶FUT8全基因序列进行优化并合成，同时在核心岩藻糖基转移酶FUT8 5’端和3’端引入酶切位点，在C端的终止密码子前加入蛋白质标签序列方便后续的蛋白质纯化，蛋白质标签为组氣fe(6XHis)。[〇〇44]步骤(2)中所述的构建重组表达载体pPICZaA_FUT8，方法是，将合成的基因序列与质粒载体pPICZaA利用限制性内切酶进行双酶切，回收目的片段，利用T4DNA连接酶将FUT8 的酶切片段与质粒pPICZaA酶切片段连接，得到重组表达质粒pPICZaA_FUT8,转化到大肠杆菌TP10中进行扩增；
[0045]所述的双酶切是利用限制性内切酶X hoi和X bal将步骤(1)中合成的核心岩藻糖基转移酶基因FUT8与诱导型表达载体pPICZaA进行双酶切，凝胶电泳分离后回收目标DNA片段，然后利用T4DNA连接酶对DNA片段进行16°C连接过夜，42°C热击转化大肠杆菌TP10感受态细胞，涂布含25ug/ml Zeocin的LB培养基平板，置于37°C下培养过夜，随机挑取单克隆， 抽提重组表达质粒pPICZaA_FUT8,通过双酶切鉴定阳性克隆子，确定双酶切后片段大小是否符合目标基因大小，也就是检测筛选的克隆是否含有目标质粒，LB培养基是由酵母粉5g、 l〇g蛋白胨、5g氯化钠，调节pH值至7.2-7.4,加水至1000ml制成。
[0046]步骤(3)中所述的转化毕赤酵母X-33感受态细胞，方法是，采用电击转化或化学转化，电击转化是利用限制性内切酶对构建的重组质粒pPICZaA-FUT8进行线性化，用电转移器电击转化毕赤酵母菌株感受态细胞;化学筛选是利用平板筛选阳性转化子，在含相应抗生素的YPDS平板筛选获得诱导型阳性转化子；[〇〇47]所述的YPDS平板是由:10g酵母粉、20g蛋白胨、20g-D葡萄糖、15g琼脂，10g山梨醇加水至l〇〇〇ml制成；[〇〇48]步骤(3)所述的对表达质粒pPICZaA_FUT8进行线性化是，利用限制性内切酶Pmel 酶切诱导型表达载体pPICZaA-FUT8,取5-20ug质粒进行电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，所用的eppendorf-Eporator电转化仪的参数是:电压1.5KV,电容阻200 Q，放电时间 4.8-5.21118，电击后立即加入1.〇1111冰冷的1.(^山梨醇，30°(:振荡培养1-211后涂布含有 100ug/ml Zeocin的YPDS平板，置于28-30 °C培养2-4天后长出转化子。
[0049]步骤(4)中所述的筛选获得诱导型分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株，所述的诱导型分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株是在平板挑取转化子接种于培养基中，通过摇瓶发酵诱导表达，获得高分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母菌株；
[0050]其中；所述的培养基包括BMGY/BMMY;[〇〇511 所述的BMGY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、pH6.0的100mM磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1(T4生物素、10ml甘油，加水至1000ml制成；[〇〇52] 所述的BMMY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、pH6.0的100mM磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1(T4生物素、5ml甲醇，加水至1000ml制成；[〇〇53]步骤(5)中所述的从发酵培养基中分离纯化重组核心岩藻糖基转移酶FUT8是:将获得的高水平表达重组蛋白的毕赤酵母菌株发酵培养后，发酵液经离心得到上清，根据表达的重组蛋白选择带有的His标签的N1-NAT层析柱，将蛋白质粗提液首先上N1-NAT层析柱， 用平衡缓冲液洗脱掉未能结合到柱子上的蛋白，然后用含有不同盐离子浓度的平衡缓冲液精心洗脱，收集洗脱液，应用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化的效果，采用透析的方法或用脱盐柱洗脱的方式除盐。
[0054]用平衡缓冲液平衡N1-NAT层析柱10个柱体积，将上述透析平衡后的蛋白样品上柱，进行亲和交换层析，样品上柱完毕后，继续用平衡缓冲液洗20个柱体积，接着分别用含有40、60、80、100、120和200mM咪唑浓度的平衡缓冲液进行梯度分段洗脱，收集洗脱液，即获得纯化后的重组蛋白FUT8,用脱盐柱洗脱的方式除盐，检测酶活性。[〇〇55]由上述可以看出，本发明包括三个部分:重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8毕赤酵母分泌表达体系的构建、重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的分离纯化和重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8酶活性的检测，现根据上述具体操作步骤和说明书附图，对本发明进一步进行说明。
[0056]实施例1重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8分泌表达体系的构建
[0057](1)按照Protein Data Bank(UniProtKB-Q9BYC5)人源核心岩藻糖基转移酶结构信息设计融合蛋白序列，以实现利用毕赤酵母分泌表达核心岩藻糖基转移酶。去除核心岩藻糖基转移酶N端与高尔基体膜结合的跨膜区域，并在剩余序列的N端引入alpha信号肽 (Native saccharomyces cereisiae secret1n signal)，在C端弓丨入6个His氨基酉爱用于分离纯化标签。序列表SEQ ID N0.1;[〇〇58]按照毕赤酵母密码子偏好性合成重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8基因的核苷酸序列表SEQ ID N0.2;[〇〇59]将以上融合基因构建到毕赤酵母表达载体上，融合的重组蛋白将在毕赤酵母X-33 内表达:将上述设计合成的基因，用Xhol和Xba I构建到毕赤酵母表达载体pPICZaA上，得到重组载体pPICZaA_FUT8;(合成基因由苏州省心生物技术有限公司完成)
[0060]实施例2构建诱导型重组表达质粒pPICZaA-FUT8
[0061]所述的双酶切是利用限制性内切酶X hoi和X bal将步骤(1)中合成的核心岩藻糖基转移酶FUT8基因与双酶切后的诱导型表达载体pPICZaA利用T4DNA连接酶对DNA片段进行 16°C连接过夜，42°C热击转化大肠杆菌TP10感受态细胞，涂布含25ug/ml Zeocin的LB培养基平板，置于37 °C下培养过夜，随机挑取单克隆，抽提重组表达质粒pPICTaA-FUT8，通过双酶切鉴定阳性克隆子，如图2所示，其为构建的重组核心岩藻糖基转移酶蛋白FUT8诱导型表达质粒载体pPICTaA_FUT8示意图；[〇〇62]上述LB培养基是由酵母粉5g、10g蛋白胨、5g氯化钠，调节PH值至7.2-7.4，加水至1000ml 制成。
[0063]实施例3毕赤酵母菌株转化及筛选[〇〇64]利用限制性内切酶Pmel酶切诱导型表达载体pPICZaA_FUT8,取5_20ug质粒进行电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，所用的eppendorf-Eporator电转化仪的参数是:电压 1.5KV，电容阻200 Q，放电时间4.8-5.2ms，电击后立即加入1.0ml冰冷的1.0M山梨醇，30°C 振荡培养l_2h后涂布含有100ug/ml Zeocin的YPDS平板，置于28-30°C培养2-4d后长出转化子。[〇〇65]所述的YPDS平板是由:10g酵母粉、20g蛋白胨、20g-D葡萄糖、15g琼脂，10g山梨醇加水至l〇〇〇ml制成；[〇〇66]实施例4高水平分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8毕赤酵母重组菌株的筛选[〇〇67]从步骤(3)中筛选出的诱导型阳性转化子在YPDS平板上划线培养2-3天，挑取单菌落接种于含有lml BMGY的5ml离心管中，30°C200rpm培养2-4天，BMMY培养基培养菌株中每 24h加入甲醇终浓度为0.5%，并在30°C200rpm培养。诱导2-4d后5000rpm离心收集上清。用 SDS-PAGE检测蛋白表达量并用蛋白印迹方法检测表达的蛋白是否为核心岩藻糖基转移酶图(3)，每一样品平行两行进行检测，最终筛选获得高水平并正确分泌表达FUT8的毕赤酵母菌株。[〇〇68]所述的BMGY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、10g山梨醇、pH6.0的lOOmM磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1 (T4生物素、加水至1000ml制成；[〇〇69]所述的BMMY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、pH6.0的lOOmM磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1(T4生物素、5ml甲醇，加水至1000ml制成。
[0070]通过上述发酵筛选，获得具有高分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母菌株pPICZaA-FUT8/X-33。经检验，如图3B所示，成功的从毕赤酵母中获得重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8。[0071 ]实施例5重组核心岩藻糖基转移酶的分离纯化[〇〇72]将步骤(4)筛选获得的具有高分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株进行发酵诱导表达2-4天，在5000rpm、4°C对发酵液离心10min，收集上清液， 用N1-NTA Sepharose? excel column—步法进行纯化。[〇〇73]用平衡缓冲液平衡N1-NAT层析柱10个柱体积，将上述透析平衡后的蛋白样品上柱，进行亲和交换层析，样品上柱完毕后，继续用平衡缓冲液洗20个柱体积，接着分别用含有40、60、80、100、120和200mM咪唑浓度的平衡缓冲液进行梯度分段洗脱，收集洗脱液，即获得纯化后的重组蛋白FUT8，重组蛋白FUT8的基因结构示意图如图3A所示，用SDS-PAGE检测蛋白纯化的效果；
[0074]纯化后的核心岩藻糖基转移酶采用脱盐柱的方法除盐，低温保存。[〇〇75]实施例6重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8酶活性检测[〇〇76]为检验上述步骤(5)所制备的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的活性，采用原理和方法，过程如下:[〇〇77]该实验是利用带有荧光基团的核心七糖结构GnGn-b 1-Asn-PABA作为重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8催化底物，在含有重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的反应体系中，经过与底物的反应催化生成的产物同样带有荧光标记，利用带有荧光检测器的HPLC对催化底物和产物分离，检测。如图4所示，表达的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8具有天然生物学活性，为核心岩藻糖基转移酶FUT8体外寡糖修饰奠定了基础。[〇〇78]HPLC方法分析:取5ul脱盐后的核心岩藻糖基转移酶蛋白进行HPLC检测。色谱仪所用的栗为Waters 1525Binary HPLC Pump,检测器为Waters 474Scanning Fluorescence Detectoer,色谱柱为Nova-Pack C18 3.9X150mm(Waters)，柱温度55 °C。激发光/检测光波长为320/400nm，洗脱液流速为lml/min，实验完毕用水:甲醇(80:20)冲洗色谱柱4〇1^11。利用Breeze软件对色谱图像进行分析，根据产物峰峰面积计算单位浓度FUT8的相对催化活性图(4)。反应体系为 10ul:10uM GnGn-b1-Asn-PABA、0.5mM ⑶P-L-fucose、200Mm MES-NaOH pH 7.0、5ul核心岩藻糖基转移酶。
[0079]由上述可以看出，本发明有以下显著的优点:表达的重组蛋白去掉了在高尔基体膜上的滞留信号使核心岩藻糖基转移酶成功分泌到培养基中；对基因序列FUT8按照毕赤酵母密码子的偏好性进行优化，使其更适于在毕赤酵母中表达;表达的重组蛋白带有特殊的标签，易于进行重组蛋白的分离纯化；由毕赤酵母重组菌株表达上清液中分离纯化后的 FUT8具有酶活性，可以直接用于体外寡糖修饰。
【主权项】
1.利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的方法，其特征在于，包 括以下步骤:步骤1:按照Protein Data Bank(UniProtKB-Q9BYC5)人源核心岩藻糖基转移酶结构信 息设计融合蛋白序列，利用RCSB PDB公布核心岩藻糖基转移酶蛋白信息去除核心岩藻糖基 转移酶N端与高尔基体膜结合的跨膜区域，并在剩余序列的N端引入alpha信号肽，在C端的 终止密码子前引入6个His氨基酸，用于分离纯化标签，方便后续的蛋白质纯化，蛋白质标签 为组氨酸(6XHis)，氨基序列表SEQ ID N0.l;利用毕赤酵母密码子偏好性合成核心岩藻糖基转移酶FUT8基因，是在不改变核心岩藻 糖基转移酶FUT8氨基酸序列的基础上，按照毕赤酵母偏好性密码子对核心岩藻糖基转移酶 FUT8全基因序列进行优化并合成，同时在核心岩藻糖基转移酶FUT8的5，端和3，端引入酶切 位点，其核苷酸序列表为SEQ ID N0.2;所述的毕赤酵母为毕赤酵母菌细胞X-33;步骤2:利用限制性内切酶构建重组表达质粒pPICZaA_FUT8，方法是:将步骤(1)中合成 的重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8与表达质粒载体pPICZaA，利用限制性内切酶进行酶 切，回收目的片段，利用T4 DNA连接酶将FUT8的酶切片段与质粒载体X酶切片段连接，得到 重组表达质粒pPICZaA_FUT8，转化到大肠杆菌TP10中进行扩增；步骤3:利用限制性内切酶对重组表达载体pPICZaA_FUT8进行线性化后转化毕赤酵母 菌细胞X-33的感受态细胞，应用含抗生素的YPDS平板筛选出诱导型阳性转化子；步骤4:表达重组蛋白FUT8毕赤酵母菌株的发酵筛选:步骤(3)筛选出的诱导型阳性转 化子在BMGY培养基中培养0D600 = 2-6时，换培养基为BMMY进行重组蛋白的诱导表达，诱导 2-4天，发酵液上清以SDS-PAGE检测蛋白质表达量并用蛋白印迹方法检测是否为核心岩藻 糖基转移酶，筛选出诱导型高水平分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母 重组菌株；步骤5:毕赤酵母重组菌株发酵上清液中分离纯化重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8。2.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，步骤2的具体操作步骤为:利用限制性内切酶X hoi和X bal将步骤(1)中 合成的核心岩藻糖基转移酶基因FUT8与诱导型表达载体pPICZaA进行双酶切，凝胶电泳分 离后回收目标DNA片段即双酶切后的pPICZaA线性片段基因，然后利用T4 DNA连接酶对目标 DNA片段进行16°C连接过夜，42°C热击转化大肠杆菌TP10感受态细胞，涂布含25ug/ml Zeocin的LB培养基平板，置于37 °C下培养过夜，随机挑取单克隆，抽提重组表达质粒pPICZa A-FUT8,通过双酶切鉴定阳性克隆子。3.根据权利要求2所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，所述的LB培养基是由酵母粉5g、10g蛋白胨、5g氯化钠，调节pH值至7.2-7.4,加水至1000ml制成。4.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，步骤3的具体操作为:利用限制性内切酶Pmel酶切诱导型表达载体pPICZ aA_FUT8，取5-20ug质粒进行电击转化毕赤酵母X-33感受态细胞，所用的eppendorf-Eporator电转化仪的参数是:电压1.5KV，电容阻200 Q，放电时间4.8-5.2ms，电击后立即加 入1.0ml冰冷的1.0M山梨醇，30°C振荡培养l_2h后涂布含有100ug/ml Zeocin的YPDS平板，置于28-30°C培养2-4d后长出诱导型阳性转化子。5.根据权利要求4所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，所述的YPDS平板是由:10g酵母粉、20g蛋白胨、20g-D葡萄糖、15g琼脂， l〇g山梨醇加水至1000ml制成。6.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，步骤4的具体操作为:从步骤3中筛选出的诱导型阳性转化子在YPDS平板 上划线培养2-3天，挑取单菌落接种于含有lml BMGY培养基的5ml离心管中，30°C200rpm培 养0D600 = 2-6时，换培养基为BMMY进行重组蛋白的诱导表达，BMMY培养基培养菌株中每24h 加入甲醇终浓度为0.5 %，并在30 °C 200rpm培养，诱导2-4d后5000rpm离心收集上清；用SDS-PAGE检测蛋白表达量并用蛋白印迹方法进行检测，每一样品平行两行进行检测，最终筛选 获得高水平并正确分泌表达重组人源核心岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母菌株。7.根据权利要求6所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，所述的BMGY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、10g山梨醇、pH6.0的100mM 磷酸缓冲液、13.4g无氨基酸酵母氮源、4X1 (T4生物素、加水至1000ml制成；所述的BMMY培养基是:10g酵母粉、20g蛋白胨、pH6.0的100mM磷酸缓冲液、13.4g无氨基 酸酵母氮源、4X1 (T4生物素、5ml甲醇，加水至1000ml制成。8.根据权利要求1所述的利用毕赤酵母表达系统分泌生产人源核心岩藻糖基转移酶的 方法，其特征在于，步骤5的具体操作为:将步骤4筛选获得的具有高分泌表达重组人源核心 岩藻糖基转移酶FUT8的毕赤酵母重组菌株进行发酵诱导表达2-4天，在5000rpm、4°C对发酵 液离心l〇min，收集上清液，用N1-NTA Sepharose? excel column—步法进行纯化，获得纯 化的重组蛋白FUT;用平衡缓冲液平衡N1-NAT层析柱10个柱体积，将上述透析平衡后的蛋白样品上柱，进 行亲和交换层析，样品上柱完毕后，继续用平衡缓冲液洗20个柱体积，接着分别用含有40、 60、80、100、120和200mM咪唑浓度的平衡缓冲液进行梯度分段洗脱，收集洗脱液，即获得纯 化后的重组蛋白FUT8，用SDS-PAGE检测蛋白纯化的效果；纯化后的核心岩藻糖基转移酶采用脱盐柱的方法除盐，低温保存。
【文档编号】C12N9/10GK105969747SQ201610485676
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】胡学军, 杨岩, 李文哲, 丁宁, 杨春光, 孙慎侠
【申请人】大连大学