双眉藻及其在产生物柴油、epa、岩藻黄素中的应用

双眉藻及其在产生物柴油、epa、岩藻黄素中的应用
【专利摘要】本发明公开了一株双眉藻(Amphora sp.)及其在产生物柴油、EPA、岩藻黄素中的应用。本发明的双眉藻的保藏编号为CGMCC No.11816。本发明的双眉藻是一株综合性状优良藻株。该藻株生长快，易采收，生物质生产成本低于多数微藻。在制备生物柴油的同时，利用生物精炼技术可以获得EPA、类胡萝卜素和岩藻黄素等高附加值产品，其胞外多糖和二氧化硅硅壳也具有商业价值。CGMCC No.1181620160108
【专利说明】
双眉藻及其在产生物柴油、EPA、岩藻黄素中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一株富油微藻及其在产生物柴油、EPA、岩藻黄素中的应用，特别涉及 一株双眉藻及其在产生物柴油、EPA、岩藻黄素中的应用。
【背景技术】
[0002] 化石燃油短缺及其燃烧时带来的环境污染问题，使可再生的代用燃料一一生物柴 油备受关注。微藻可以在滩涂、盐碱地、粘土地等荒芜土地上及浅海和湖泊中大规模培养， 不与粮争地，不与人争粮，并可节约淡水资源，还可与工厂废弃的二氧化碳处理和减排相结 合。因此，微藻被认为是极具开发潜力的生物柴油原料。近几年，研究者们获得了许多具有 生物柴油开发潜力的富油微藻。然而，由于微藻培养、采收和加工的高成本，导致微藻生物 柴油的生产成本仍不能与化石燃油相比，限制了微藻生物柴油的商业化生产。
[0003] 目前，研究者们普遍认为，将微藻生产生物柴油藻与微藻生物精炼(Biorefining) 技术相结合将是解决微藻生物柴油高成本的有效途径。微藻富含多不饱和脂肪酸、优质蛋 白、多糖、色素及多种特殊的次级代谢物质，在生产生物柴油的同时，进行多不饱和脂肪酸、 蛋白或色素等高附加值产品的生产，将有效降低微藻生物燃油的成本。

【发明内容】

[0004] 本发明提供了一株双眉藻(Amphora sp.)及其产生物柴油、EPA和岩藻黄素富油微 藻中的应用。
[0005] 本发明的双眉藻(Amphora sp.)是本实验室经过多年筛选，获得一株综合性状优 良硅藻株系，命名为BQWSM，已于2016年1月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 11816。双眉藻藻株BQWSM的形态为壳面椭圆形，长10~12.5微米，宽6~7.5微米。两端头 形，宽2.8~3.5微米，背缘凸出、腹缘内凹，壳缝直，左右对称。
[0006] 本发明经过培养检测发现，双眉藻(Amphora sp. )BQWSM CGMCC No . 11816环境适 应性强，易培养，易采收，具体如下所述：
[0007] (1)温度适应性强：属耐高温藻种，生长最适温度:30-38°C，可耐4°C低温和45°C高 温。在海南可常年室外培养，无需温控设备。
[0008] (2)盐度适应性强：属广盐性藻种，目前实验表明，在淡水至盐度为80%。的海水中 均可生长，最适盐度为30%。一60%。，最尚盐度尚未实验。
[0009] (3)可进行附着培养和悬浮培养。
[0010] (4)容易采收:该藻种在不同培养条件下呈较大颗粒状或片状的群体细胞形态，可 用筛网过滤采收，降低采收成本。
[0011]双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No.11816油脂含量可达细胞干重30-60%。在 35°C条件下，F/2海水培养基培养3天，总脂含量可达到20%以上;培养7天，当达到指数生长 中后期时，藻细胞总脂含量可达30%以上；当达到生长后期，或环境刺激（如低温或高盐条 件培养），藻细胞总脂含量最高可达到60%以上。
[0012]双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No .11816藻油主要成份是：
[0013]棕榈酸(C16:0):30% 左右；
[0014] 棕榈油酸(C16:1):25%左右；
[0015] EPA(二十碳五烯酸，C20:5):3%-25% 左右
[0016] 棕榈酸(C16:0)和棕榈油酸(C16:1)比例高，占50%以上，两种脂肪酸碳链较短，饱 和度较高，适合做生物柴油。
[0017] 双眉藻（Amphora sp. )BQWSM CGMCC No.11816只含EPA，不含DHA，因而较易获得 已卩八纯品。此外，双眉藻(細?11〇^8?.沖0131061〇：如.11816藻株易采收和培养，生物质生 产成本较低，油脂含量高，EPA占脂肪酸量最可达25%，高于多数微藻，因而是较理想的制备 EPA的原料。
[0018] 双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生产EPA中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0019] 所述应用中，生产EPA中包括培养双眉藻(Amphora sp.)CGMCCNo.ll816用于提取 EPA，所述双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816按照包括下述步骤的方法培养：
[0020] 1)将双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816接种至含硅酸盐的培养基静置或通气 培养藻种，培养温度为30~38 °C，，获得藻种培养液；
[0021] 2)将步骤1)培养的藻种培养液与含硅酸盐的培养基按照体积比1:20-120置于培 养容器中进行大量培养，将可供硅藻附着的固体附着板或附着网（如PC板或其它固体附着 材料)竖直(垂直于容器底部）固定于培养容器中，形成用于双眉藻附着的附板，相邻的两个 间隔3-6厘米，向培养容器中通入空气，使海水培养基的温度为30-38Γ，对硅藻附板照射灯 光，光照强度10-80mol .πΓ2. s^1，光照时间每天12-15小时，培养3至10天后，米收藻株细胞。 [0022] 所述双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816培养后还包括低温刺激，所述低温刺 激的步骤为:置于10-25Γ低温环境中给予低温刺激0.5-2天。
[0023] 所述低温刺激优选15-25Γ低温环境，低温刺激的方法可以为放置于低温循环水 浴锅中刺激。
[0024] 双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生产生物柴油中的应用也属于本发明的 保护范围。
[0025] 双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生产类胡萝卜素中的应用也属于本发明 的保护范围。
[0026]所述类胡萝卜素中，含量较高的是岩藻黄素，因此，本发明的双眉藻(Amphora sp.) CGMCC No. 11816也可以用于高效提取岩藻黄素。
[0027] 综上所述，本发明的双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816是一株综合性 状优良藻株。该藻株生长快，易采收，生物质生产成本低于多数微藻。在制备生物柴油的同 时，利用生物精炼技术可以获得EPA、类胡萝卜素和岩藻黄素等高附加值产品，其胞外多糖和 二氧化硅硅壳也具有商业价值。
【附图说明】
[0028] 图1为双眉藻(Amphora sp. )BQWSM显微镜下照片。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1.双眉藻(Amphora sp. )BQWSM的筛选、分离和鉴定 [0030] 1、双眉藻(Amphora sp · )BQWSM的筛选
[0031] 我们经过筛选，获得一株综合性状优良的硅藻株系：双眉藻（Amphora sp.) bqwsm，具体方法如下：
[0032] 取海南海口近岸海水，补加营养盐富集，瓶底长出褐色藻落后，取褐色藻落涂平板 (平板用F/2培养基+1.5%琼脂配制而成），获得多个双眉藻单克隆，挑取多个单克隆用F/2 液体培养基培养，再经过涂平板分离纯化，经十几代的分离纯化经，高温、高盐筛选适应性 强生长快的藻株，常温培养，检测EPA含量，挑取EPA含量最高的藻株，再进行平板纯化，培 养。获得一株双眉藻，命名为BQWSM。
[0033] 2、双眉藻(Amphora sp. )BQWSM的鉴定
[0034] 2.1形态学鉴定
[0035] 在100倍油镜和激光共聚焦显微镜下观察双眉藻(Amphora sp.)BQWSM(图1)，可见 藻细胞壳面椭圆形，长10~12.5微米，宽6~7.5微米。两端头形，宽2.8~3.5微米，背缘凸 出、腹缘内凹，壳缝直，左右对称。
[0036] 2.2、分子鉴定方法：已测定18s rDNA和ITS序列
[0037] 离心收集对数期微藻细胞，CTAB法提取基因组DNA。分别以真核藻类18srDNA和ITS 通用引物扩增藻细胞的18srDNA序列和ITS序列。
[0038] 18srDNA引物序列为：18SF:5'GGA TCA GAA TTC TAT CTG GTT GAT CCT GCC AG 3，；
[0039] 18SR:5'-CTC AGT AAG CTT GAT CCT TCC GCA GGT TCA CC-3'。
[0040] ITS引物序列为:ITSF: 5 ' -GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3 ' ；
[0041 ] ITSR:5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
[0042] PCR反应条件如下：94°C预变性5min;94°C变性lmin，55°C退火30s，72°C延伸 1.5min，30个循环；，最后72°C延伸8min。胶回收后的PCR产物与pMD 18-T载体(购自大连宝 生物)连接后转化感受态E.coliJM109(北京微生物研究所）。挑选5个转化菌落进行PCR检 测，再将扩大培养后的重组菌落送去上海生工和上海捷瑞公司完成测序。
[0043] 测序结果表明，18srDNA序列如序列表中序列1所示，ITS序列如序列表中序列2所 示。利用Blast将测序所得的18S rDNA和ITS序列进行同源性比对，结果表明，藻株的 18srDNA序列与Amphora cofeaefomis 18S rDNA序列的相似度98%. ;ITS序列与Amphora cofeaefomis序列的相似度95%,与Amphora salina序列的相似度97%。
[0044] 根据形态学和分子生物学鉴定方法，鉴定该藻种为双眉藻属，命名为：双眉藻 (Amphora sp.)BQWSM，双眉藻(Amphora sp.)BQWSM，已于2016年1月8日保藏于中国普通微 生物菌种保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所），保藏编号为CGMCC No.11816。
[0045] 实施例2.双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816的性能鉴定
[0046]
【申请人】经过对双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816多方面的综合评价分 析，发现该藻株是一株产EPA和岩藻黄素富油微藻，具有商业开发的潜力，具体如下所述：
[0047] 一、双眉藻(Amphora sp. )BQWSM CGMCC No. 11816的环境适应性检测：
[0048] 经过培养检测发现，双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816环境适应性强， 易培养，易采收，具体如下所述：
[0049] (1)温度适应性强：属耐高温藻种，生长最适温度:30_38°C，在海南可常年室外培 养，无需温控设备。
[0050] 温度实验：
[0051] 藻种培养:双眉藻以f/2培养基单藻种静止培养。待培养到指数生长期后，取藻液 按1:8比例接种于3L玻璃三角瓶中。摇匀后分装于500ml三角瓶中，每瓶400ml藻液。实验设4 个处理:20 °C、30°C、35°C、38°C，每个处理3个重复。光周期为14h: 8h，光照强度为4000Lux。 海水取自海口市白沙门，盐度30%。，pH8.1。过滤后高压灭菌。
[0052]生长测定:双眉藻培养6天后离心(5000g)收集，去离子水清洗一次，再次离心获得 藻细胞沉淀。藻细胞冷冻干燥(Labconco)后以精密分析天平(MA200，上海良平仪器仪表有 限公司)称重。据以下公式计算双眉藻的相对生长速率(K)和细胞倍增时间：
[0053] K=(lnN2-lnNl)/(t2_tl)
[0054] Τ = 0·6931/Κ(2)
[0055] 式中，Κ为相对生长速率;tl、t2为对应的培养时间（3天）；Ν1和Ν2分别为tl、t2时期 的细胞干重;T为细胞的平均倍增时间。
[0056] 实验结果:静止培养条件下细胞的比生长速率和倍增时间如表1
[0057] 表 1
[0059]备注:abc表示方差分析差异程度，同一栏内标有相同字母的处理之间没有显著差 异，P>0.05;同一栏内没有相同字母的处理之间差异显著，Ρρ〈0.05。
[0060] (2)广盐性：属广盐性藻种，目前实验表明，在淡水至盐度为80%。的海水中均可生 长，盐度为10%。一60%。的条件下生长速率无显著差异(P〈0.05)(表2)，最高盐度尚未实验。 [0061 ] 盐度实验：
[0062] 藻种培养:双眉藻以F/2培养基单藻种静止培养。待培养到指数生长期后，取藻液 按20mg/L比例接种于5L玻璃三角瓶中。摇匀后分装于500ml三角瓶中，每瓶400ml藻液。实验 设置6个盐度梯度（10%。一 60%。）的培养液，置于培养箱中静置培养，培养条件为光周期为 14h:8h，光照强度为4000LUX，温度30°C。每个梯度设3个平行。
[0063] F/2培养基为每升海水中添加如下元素：NaN03 75mg，NaH2P04 · 2H20 5.65mg, Na2EDTA 4.16mg,FeC13 · 6H20 3.15mg,Na2Si03 · 9H20 20mg,CuS04 · 5H20 0.01mg,ZnS04 · 7H20 0.022mg,CoCl2 · 6H2O O.Olmg, MnC12 · 4H20 0.18mg,Na2Mo04 · 2H20 0.006mg, Vitamin B12 0.0005mg，Vitamin B1 0.1mg，Biotin 0.0005mg。
[0064] 生长测定：同温度实验中的生长测定方法。
[0065] 实验结果如表2所示：
[0066]表 2
[0068]备注:abc表示方差分析差异程度，同一栏内标有相同字母的处理之间没有显著差 异，P>0.05;同一栏内没有相同字母的处理之间差异显著，Ρρ〈0.05。
[0069] (3)可进行附着培养和悬浮培养。
[0070] (4)容易采收:该藻种在不同培养条件下呈较大颗粒状或片状的群体形态，可用筛 网过滤采收，降低采收成本。
[0071] 二.双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816细胞油脂含量测定
[0072] 双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816油脂含量可达细胞干重30-60%。在 35°C条件下，F/2海水培养基培养3天，总脂含量可达到20%以上;培养7天，达到指数生长中 后期，总脂含量可达30%以上；生长后期或低温或高盐条件下的藻细胞总脂含量最高可达 到60%以上。
[0073] 3.生物质产量高：
[0074] (1)静置培养：每升接种量20mg藻细胞（湿重），38°C，光照强度为4000LUX，400ml F/2海水培养基，500ml锥形瓶静置培养7天，生物量约为4.5g\m2，0.2g干重/L，高于两株海 水小球藻Chlorela ssp.相同培养条件下的生物质产量。
[0075] (2)通空气培养:接种量20mg藻细胞(湿重）/L，利用50L培养箱通入空气（空气流 量：15L/min)培养，30°C，光照强度为4000LUX，光周期为14h:8h，生物质产量约为3g/m2/d， 约0.2g/L/d。
[0076] 3、脂肪酸组成分析表明，该株藻种可以作为生产EPA和生物柴油原料
[0077] 培养条件为：500ml锥形瓶静置培养，光照强度为4000LUX，光周期为14h: 8h，温度 30°C。设2个处理：（1)30°C条件培养7天后，采收，冷冻干燥；（2)30°C条件培养7天后，转入20 °C条件下再培养2天，采收，冷冻干燥。
[0078]将冷冻干燥的藻粉0.3研磨，氯仿-甲醇法提取总脂（Bligh，E.G.，Dyer，W.J.， 1 9 5 9 . A rapid method of total lipid extraction and purif ication.Can. J.Biochem.Physiol ·37,911_917·)，然后甲酯化，甲酯化反应如下：
[0079] 甲酯化过程：先加入3ml 0 · 5mol/LK0H/甲醇溶液60°C水浴15min，冷却后加入2ml 14 %的BF3溶液，60 °C水浴中振荡2min，放至室温，加入2ml正己烷，振荡均匀，加入lml饱和 氯化钠溶液和少量无水亚硫酸钠，静置，取lml于2ml玻璃试管，加入适量白土去除色素，取 上清进行GC分析。
[0080] GC色谱条件:气相色谱分析过程中，进样量为lyL，分流比为30:1。色谱条件:FFAP 柱为30m*0.25mm，膜厚0.50μπι;进样口温度为250°C，检测器温度为280°C ;程序升温，50°C下 保留lmin.，以25°C/min升到200°C，再以3°C/min升高到230°C，保留lOmin.总运行时间 27min。载气为高纯氮气。通过样品保留时间与37种脂肪酸甲酯标准品（Supe lco 37Component FAME mix, St .Louis, MO, USA)色谱图保留时间的比对，确定样品中脂肪酸甲 酯的成分，（即保留时间相同则为同一脂肪酸甲酯成分）。
[0081 ] 结果如下：
[0082] 双眉藻(Amphora spjBQWSM CGMCC No .11816藻油主要成份是：
[0083] 棕榈酸（C16:0):30%;
[0084] 棕榈油酸（C16:l):25%;
[0085] EPA(二十碳五烯酸，C20:5):4% ~10%(3(TC 培养）20% - 25%(3(TC 培养 7 天，再 转入20°C培养2天）
[0086] 棕榈酸(C16:0)和棕榈油酸(C16:1)比例高，占50%以上，两种脂肪酸碳链较短，饱 和度较高，适合做生物柴油。
[0087] EPA属于Ω-3系列多不饱和脂肪酸，是鱼油的主要成分，具有多种药理作用。EPA具 有帮助降低胆固醇和甘油三酯含量、促进体内饱和脂肪酸代谢的作用，从而降低血液粘稠 度，增进血液循环，防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血 栓、脑溢血、高血压等心血管疾病。
[0088]目前商业上EPA主要来源是深海鱼油，由于深海鱼类生长的不确定性及人类频繁 捕捞，加上各种污染导致鱼类资源越来减少，质量也相应下降。因此，寻找其他替代资源已 成为新的研究热点。微藻来源的多不饱和脂肪酸具有原料容易获得，供应稳定，不破坏生态 平衡等优点。许多微藻如三角褐脂藻（Phaeodacty lum tr icornutum)和微绿球藻 (Nannochloropsis oculata)可以合成EPA，但往往同时含有一定量DHA，二者不易分离，分 离到的是产物往往是EPA和DHA的混合物。我们的藻株只含EPA，不含DHA，因而较易获得EPA 纯品。此外，Amphora sp.BQWSM藻株易采收和培养，生物质生产成本较低，油脂含量高，EPA 占脂肪酸量最可达25%，高于多数微藻，因而是较理想的制备EPA的原料。
[0089] 4、类胡萝卜素和岩藻黄素(fucoxanthin)含量高
[0090]类胡萝卜素是一种抗氧化剂，有缓解心血管病的药疗性能，2018年其全球市场销售 总值将达到3.09亿美元。目前，工业上生产类胡萝卜素的主要原料是红酵母和杜氏盐藻，其 最高含量分别为干物质重的3.5 %和10 %。
[0091 ] 按照萝卜素含量测定方法（参考文献：Lichtenthaler HK.Chlorophylls and carotenoids :pigments of photosynthetic biomembranes.Methods in Enzymology, 1987，148:350-382 ·)对Amphora sp · BQWSM藻株胡萝卜素进行测定：
[0092] 90%丙酮法提取色素，按照下式计算提取液中
[0093]类胡萝卜素的含量：
[0094] 类胡萝卜素(mg/L) = (1000 XD470 - 3 · 27 X Chla -104 X Chlb)/229
[0095] 我们实验结果表明，Amphora sp.BQWSM藻株的类胡萝卜素含量高达10%以上。
[0096]岩藻黄素是一种脂溶性天然类胡萝卜素，占类胡萝卜素总量10%以上，具有抗氧化 活性、抗炎症、抗肿瘤和抗肥胖等作用，可用于食品加工和动物饲料中，是预防癌症和减肥 的有效药物。自然界中岩藻黄素大量存在于褐藻、硅藻及海洋软体动物中，目前多从海带中 提取制备。研究表明（严小军，范晓，娄清香，等.海藻中类胡萝卜素的提取及含量测[J].海 洋科学集刊，2001，6(43): 108-114)，海带岩藻黄素含量约为干物质重的0.5mg/g左右，鼠尾 藻中岩藻黄素含量为〇.724mg/g，海黍子中岩藻黄素含量为0.680mg/g，裙带菜中岩藻黄素 含量为 1.141mg/g。
[0097]岩藻黄素提取和测定方法(刘梁，勾明玥等，海带岩藻黄素提取工艺的优化大连工 业大学学报，2010,29(8) :406-408):
[0098] 称取一定量的硅藻干粉（30mg)，加入20yLDMS0和0.5mL85%甲醇于研钵中避光研 磨lOmin。加入85%甲醇，置于40°C水浴避光浸提60min，静置，取上清，反复抽提，合并上清 液，于445nm处测定吸光值。
[0?00] 式中，A为样品在445nm处的吸光值;Alcm是在lcm光程长的比色皿中lg/L岩藻黄素 的理论吸收值，即1 600;n为稀释倍数;V为提取液总体积，mL;m为样品质量，g。
[0101] 我们实验表明，上述培养条件下（30°C，盐度30，光照40001ux)Amphora sp · BQWSM 藻株岩藻黄素含量高达l〇mg/g以上。因此，可以利用本发明的双眉藻(Amphora sp. )BQWSM CGMCC No. 11816提取生产岩藻黄素。提取方法可以为现有的岩藻黄素提取方法。
[0102] 综上所述，Amphora sp.BQWSM藻株是一株综合性状优良藻株。该藻株生长快，易采 收，生物质生产成本低于多数微藻。在制备生物柴油的同时，利用生物精炼技术可以获得 EPA、类胡萝卜素和岩藻黄素等高附加值产品，其胞外多糖和二氧化硅硅壳也具有商业价值。
[0103] 实施例3、双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC No. 11816在生产EPA中的应用
[0104] 如实施例2中所述，本发明的双眉藻(Amphora sp.)BQWSM CGMCC Νο·11816*ΕΡΑ 含量很高，并且不含DHA，比较容易提取和纯化，本发明的发明人提供一种培养双眉藻生产 EPA的方法，具体如下：
[0105] 1、藻种培养步骤：
[0106] F/2海水培养基静置培养藻种；
[0107] 培养温度为30-38°C，培养时间为7天，至藻种浓度0. lg/L左右。
[0108] F/2海水培养基的配方为每升海水中添加如下元素：NaN0375mg，NaH2P04 · 2H20 5.65mg，Na2-EDTA 4.16mg，FeCl3*6H2〇 3.15mg，Na2Si〇3*9H2〇 20mg，CuS〇4*5H2〇 O.Olmg， ZnS〇4 · 7H20 0.022mg，CoCl2 · 6H2O 0.01mg，MnCl2 · 4H20 0.18mg，Na2Mo〇4 · 2H20 0.006mg， Vitamin B120.0005mg,Vitamin B10.lmg,Biotin 0.0005mg〇
[0109] 2、大量培养步骤：
[0110] 向50升的培养容器中加入40升F/2海水培养基，海水培养基盐度为35%。至55%。，将 上步骤培养的藻种按静置培养藻种体积与海水培养基体积比1:100置于培养容器中，将PC 板竖直(垂直于培养容器底部）固定于培养容器中，形成多个用于双眉藻附着的附板，相邻 两个附板间隔3厘米，向硅藻附板吹送空气（10L-25L/min)，使海水培养基的温度为30-38 °C，对硅藻附板照射灯光，光照强度10-80mol .πΓ2. ?Γ1，使昼:夜比为14小时：10小时；
[0111] 采收步骤:在培养容器中培养3至5天后，取出硅藻附板，放置于添加起膜剂的溶液 中（添加起膜剂的F/2培养基或海水，起膜剂添加浓度为70g/L)，l至2天后，附着于硅藻附板 上的硅藻细胞会呈膜状或大块片状悬浮在水体中，用网筛过滤采收硅藻细胞;起膜剂由下 述重量份数比的组分组成NH 3S〇4: NaN03 = 5:1。
[0112] 低温刺激步骤:将采收后的硅藻细胞集中起来，置于循环水浴锅中给予15、18、20 或25 °C低温刺激1天，然后将硅藻细胞冷冻干燥。
[0113] 3、EPA的检测和提取(见实施例2的GC测脂肪酸方法，包括:抽提总脂，甲酯化反应， 气相色谱分析EPA和各种脂肪酸百分含量），提取方法可以按照现有技术提取。
[0114]本发明的硅藻培养方法包括低温刺激步骤，经分析，各低温刺激后的藻细胞油脂 含量可达50 %，EPA含量可占脂肪酸组成的20 %以上，是不经低温处理藻细胞的3倍。
[0115]以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解， 在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都 将落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一株双眉藻(Amphora sp·)，其特征在于，所述双眉藻(Amphora sp.)的保藏编号为 CGMCC No.11816。2. 双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No .11816在生产EPA中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，生产EPA中包括培养双眉藻(Amphora sp.) CGMCC No. 11816，所述双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816按照包括下述步骤的方法培 养： 1) 将双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816接种至含硅酸盐的培养基培养藻种，培养 温度为25 °C~38 °C，获得藻种培养液； 2) 将步骤1)培养的藻种培养液与含硅酸盐的培养基按照体积比1:20-120置于培养容 器中进行大量培养，将可供硅藻附着的固体附着板或附着网竖直固定于培养容器中，形成 用于双眉藻附着的附板，相邻的两个附板间隔3-6厘米，向培养容器中通入空气，使海水培 养基的温度为30-38°C，对硅藻附板照射灯光，光照强度10-80mol.m- 2. s-1，光照时间每天 12-15小时，培养3至10天后，采收藻株细胞。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述双眉藻（Amphora sp .) CGMCC No. 11816培养后还包括低温刺激，所述低温刺激的步骤为:给予10-25 °C低温刺激0.5-2天。5. 双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生产生物柴油中的应用。6. 双眉藻(Amphora sp.)CGMCC No. 11816在生产类胡萝卜素中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述类胡萝卜素为岩藻黄素。
【文档编号】C12P7/64GK105969666SQ201610414424
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】刘志媛
【申请人】海南大学