一种检测α-L-岩藻糖苷酶含量的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试剂R1的组分包括：生物缓冲液1、金属离子络合物、α-L-岩藻糖苷酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1；试剂R2的组分包括：生物缓冲液2、2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷酶、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。本发明中的试剂盒采用双试剂模式，检测灵敏度高、检测限低、线性测试范围宽、精确度高、重复性好、稳定性好、抗干扰性强。可以用于半自动、全自动生化分析仪，所需检测仪器（生化分析仪）在各大医院和检验中心普遍使用。适用于临床上的推广应用，特别对于急诊能实现快速诊断。
【专利说明】-种检测a-L-岩藻糖音酶含量的试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种aA-岩藻糖巧酶检测试剂盒及其制 备方法。
【背景技术】
[0002] AFU是一种酸性水解酶，广泛分布于哺乳动物体液和组织细胞的溶酶体中，W肝肾 等组织活性较高。其主要生理功能是参与含岩藻糖基的各种糖脂、糖蛋白、黏多糖等大分子 物质的分解代谢。它合成于细胞中，正常情况下其体内含量始终保持在一个低水平范围内。 AFU的化学本质是一种糖蛋白，它在体内分布相对分子质量也不尽相同，其血中的相对分子 质量为2. 7X105?3. 9X10抓a，远大于白细胞和肝脏细胞中的。AFU在人体中呈多型性， 当pH值为3. 8?3. 9时酶活性基本消失，而在抑值为6. 2?7. 0时酶活性上升。早期测 定该酶主要用于诊断遗传性AFU缺乏症，并W此与其他遗传性黏多糖储积病进行鉴别。自 Deugnier提出AFU对原发性肝癌有一定提示作用后，该方面的研究也相应增多。
[0003] A即常表达于P肥患者发病早期，其生物活性明显高于继发性肝癌及肝硬化，它与 AFP浓度无明显相关性。研究发现血清的A即在肝癌患者中的活性明显高于在慢性肝炎、 肝硬化、其他肿瘤患者及健康人群中的活性，较AFU具有更高的敏感性，若两者联合检测可 将肝癌的敏感性提高到82. 16%。有研究表明在诊断肝癌时AFU活性与肿瘤大小无关，该 就对于AFP阴性和小肝癌患者的诊断更具有意义。而且，有研究认为，A即水平与肝癌患者 TOM分期呈相关性，A即水平越高，?!分期越晚，遂认为A即是一个有效的用于判断原发性 肝癌病情的血清学指标。
[0004] P肥患者在有效治疗后，A即水平发生显著下降，该为A即阴性的原发性肝癌患者 诊疗提供重要的参考标准。若术后或药物治疗后，患者血清A即再度升高，说明病情恶化。 有研究认为PHC患者癌细胞合成和释放A即增加，或肝癌时血清A即激活物增加及A即作 用的底物浓度增加，最终导致血清A即增高。肿瘤切除后癌细胞减少，上述机制发生改变， 使酶活性下降，所W含量降低；当肿瘤复发时血清A即可再次升高。因此A即为PHC患者治 疗后的动态监测、疗效和预后判断W及转归提供非常重要的信息。
[0005] AFU除在PHC相应升高外，在一些非肝癌性疾病如肝硬化、急慢性肝炎、病毒性肝 炎、肾病、糖尿病、膜腺炎、甲状腺功能减低及白血病患者中，其血清水平也会升高。所WA即 在诊断上述疾病时具有很高的诊断价值。同时，有研究报道AFU在恶性胸腔积液中含量高 于良性，所WA即是判断良、恶性胸腔积液的可靠依据；其机制为人体感染己型肝炎病毒 (皿V)后，皿V活跃复制启动肝脏组织炎症反应因素，使肝细胞出现变性、坏死，进而肝细胞 再生和纤维组织增生，从而导致AFU活性升高。
[0006] 目前，临床上对A即的测定方法很多，有英光巧灭法、速率法、终点法等。目前在临 床上应用较为广泛的是酶法。
【发明内容】
[0007] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测时间短，稳定性 好、重复性好、精确度高、检测灵敏度高、线性测试范围宽、抗干扰性强的aA-岩藻糖巧酶 检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明的第一方面提供一种aA-岩藻糖巧酶 检测试剂盒，由彼此独立的试剂Rl和试剂R2组成；其中试剂Rl的组分包括；生物缓冲液 1、金属离子络合物、aA-岩藻糖巧酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1 ;试剂R2的组分包 括；生物缓冲液2、2-氯-对硝基苯酷-aA-岩藻糖巧酶、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。
[0009] 优选的，所述试剂Rl中，所述生物缓冲液1选自磯酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨 酸缓冲液、测酸缓冲液或巧樣酸-磯酸盐缓冲液中的一种或多种的组合；更优选Tris缓冲 液，其原因是Tris缓冲液碱性较强，可调节PH范围广，对生物化学过程干扰很小，不与巧、 镇离子及重金属离子发生沉淀。所述试剂R2中，所述生物缓冲液2选自磯酸盐缓冲液、Tris 缓冲液、甘氨酸缓冲液、测酸缓冲液或巧樣酸-磯酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。
[0010] 优选的，所述Rl试剂中，生物缓冲液1的浓度为20?200mmol/l，PH7. 0-7. 5 ;R2 试剂中，生物缓冲液2的浓度为20?200mmol/L，PH7. 0-7. 5。
[0011] 优选的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂Rl中 的生物缓冲液1进行了改进，所述试剂Rl中的生物缓冲液1包括下列组分；水苏糖、明机、 果糖二磯酸轴、六偏磯酸轴和甘氨酸，且水苏糖、明机、果糖二磯酸轴、六偏磯酸轴、甘氨酸 的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的抑值为7. 2 - 7. 6。
[0012] 优选的，各组分在生物缓冲液1中的浓度为：
[0013]
【权利要求】
1. 一种a -L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成；其中试 剂R1的组分包括：生物缓冲液1、金属离子络合物、a -L-岩藻糖苷酶反应底物、表面活性剂 1、防腐剂1 ;试剂R2的组分包括：生物缓冲液2、2_氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷酶、激 活剂、表面活性剂2、防腐剂2。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中，所述生物缓冲液1选自 磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种 或多种的组合；所述试剂R2中，所述生物缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸 缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，生物缓冲液1的浓 度为20?200mmol/L，PH7. 0-7. 5 ;R2试剂中，生物缓冲液2的浓度为20?200mmol/L， PH7. 0-7. 5。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，金属离子络合物选自 乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或多种的组合，浓度为1? 5mmol/L〇
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，a-L-岩藻糖苷酶反应 底物为2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷，浓度为2?20mmol/L。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，所述表面活性剂1为椰 子油脂肪酸二乙醇酰胺，浓度为5?55mmol/L。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂1选自叠氮钠、硫柳汞、 ProClin300中的一种；所述R2试剂中，所述防腐剂2选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的 一种。
8. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，所述烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸还原态的浓度为0. 5?2mmol/L ;所述R2试剂中，所述激活剂为磷脂酰胆碱，浓度为 2 ?20mmol/L。
9. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的生物缓冲液1包括 下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸 钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3. 5 - 7. 5g/L，生物缓冲液1的pH值为7. 2 - 7. 6。
10. 根据权利要求1?9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在 于，具体包括如下步骤： (1) 按照比例分别配置试剂R1、试剂R2,按照需要的a-L-岩藻糖苷酶参考校准品浓度 将相应的a-L-岩藻糖苷酶标准品分别加入校准品中，制备得到含有不同浓度a-L-岩藻 糖苷酶标准品的一组校准品，并绘制标准曲线； (2) 将待测样本与试剂R1和R2按一定比例混合，使其充分反应； (3) 用全自动生化分析仪测定单位时间内吸光度变化率A A/min ; (4) 根据吸光度变化率计算出样本中a-L-岩藻糖苷酶的活性。
【文档编号】G01N21/31GK104359846SQ201410735824
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月5日 优先权日:2014年12月5日
【发明者】吉权 申请人:重庆中元生物技术有限公司