专利名称：检测肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白gp73的装置及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种分离肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白GP73(或称为高尔基蛋白73异质体)的预装离心柱，还涉及了一种含有该预装离心柱的化学发光检测试剂盒和一种含有该预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及这些试剂盒的制备方法，属医疗产品技术领域，用于对肝癌的发生进行早期诊断。
背景技术：
肝细胞癌HCC(hepatocellular carcinoma)主要的病因学是HBV或HCV慢性肝病毒感染，在肝癌发生前一般有长时间的潜伏期-即感染肝病毒至肝癌发生时间。据2006年1月26日《中国医药报》报道以及《癌症》2005年第六期中文章的介绍，我国现有乙肝病毒携带者1.2亿左右，约占世界乙肝病毒携带者的1/3；有症状的慢性乙肝患者2000万人，另外我国还有360万人肝硬化患者。由于众多的肝病患者和肝癌高危人群，我国的肝细胞癌发病率最高。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)估计，2000年全球肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人；我国肝癌发病人数30.6万，死亡30.0万人，占全球50％。
在高危人群中建立早期诊断和监测机制是非常重要的。早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，高危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。另外要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。
目前，HCC疾病传统上的监测是体检，肝超声影象分析和血清标志系列检测。
其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白AFP，由于甲胎蛋白AFP具有与HCC的相对特异性，因此目前得到广泛应用，但是部分良性肝病中AFP为阳性和部分肝癌中AFP为阴性，使得依靠AFP用于HCC预警和监测带来一定的限制，而且在检测HCV相关的HCC不是很敏感。临床希望获得比甲胎蛋白更特异和更灵敏的新血清学指标。
疾病糖生物学研究结果显示，糖基化改变往往是疾病状态的特点。恶性肿瘤细胞和正常细胞的物质代谢有很大的不同，参与代谢的很多酶都发生活力的改变，特别是细胞增殖生长有关代谢过程的酶往往明显增高，使这一代谢过程加快，以适应肿瘤细胞不断分裂增殖的需要。其中糖基转移酶也是一类在恶性肿瘤细胞中活力有明显改变的酶。由于糖链的结构是由参与糖链合成的各种糖基转移酶的活力所决定，某一糖基转移酶活力的增减可以直接影响糖链中某一糖基的多少，所以恶性肿瘤中糖基转移酶活力的变化必然带来细胞合成的糖蛋白上糖链结构的相应变化。
这些结构异常的糖链可出现在肿瘤细胞表面的糖蛋白上，这些细胞释放或脱落的一些可溶性糖缀合物能发挥免疫抑制或拮抗作用。这种免疫抑制或拮抗作用包括干扰肿瘤相关抗原的加工与呈递、抑制淋巴细胞的增殖，以及消除对癌细胞进行杀伤的细胞毒反应等。此外，从癌细胞释放的一些糖蛋白或粘蛋白，也可以中和癌患者体内相应的抗癌抗体而削弱抗癌免疫反应。该过程进而导致细胞粘附、侵袭和迁移能力的改变，这是造成肿瘤细胞具有侵袭性和转移能力的一个重要原因。
众多研究表明肝癌发生伴随着多种蛋白的核心岩藻糖基化。这与肝癌细胞中岩藻糖基转移酶异常相关，通常将核心岩藻糖基化的蛋白称为其异质体。
目前成功的作为肿瘤预警标志物的甲胎蛋白异质体AFP-L3就是一个典型例子，FDA于2005年10月批准临床将甲胎蛋白异质体AFP-L3作为肝癌预警指标。甲胎蛋白异质体AFP-L3是甲胎蛋白在细胞癌变时发生的糖链异常的一个组分，对于检测肝癌的发生特异性显著提高。目前研究发现除了甲胎蛋白糖链异常之外，还有抗胰蛋白酶、转铁蛋白在肝细胞癌变时也伴随产生糖链异常。99年日本科学家Akira Naitoh采用凝集素亲和电泳显影方法检测肝病的糖基化异常，发现在肝癌和肝炎、肝硬化之间，甲胎蛋白异质体、抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体的含量和比率具有显著性差异。检测甲胎蛋白异质体、抗胰蛋白酶异质体、转铁蛋白异质体对于肝癌的早期诊断具有重要意义。
GP73(Golgi Protein 73)是个II型高尔基跨膜蛋白，是一个新发现的与肝病病程相关的一个蛋白。分子量接近73KD(Kladney et al.，2000，Gene 249，53-65)。在病毒性感染的肝细胞中高表达(Kladney，et al.，2000，Gene 249，53-65)，GP73也表达在胆汁上皮细胞中。而正常肝细胞中很少。相反的，肝病患者的肝细胞显示对GP73强烈免疫反应。GP73 mRNA和蛋白在不同的转染病毒后的HepG2肝恶性肿瘤细胞中也高表达，包括转染腺病毒。在病毒性肝病或非病毒性促成肝病如酒精性肝病，自身免疫性肝病等中GP73显著性的升高(Kladney，et al.，2002，Hepatology 35(6)1431-40)。
相关研究还发现高尔基蛋白GP73比甲胎蛋白AFP可以更早的在早期肝癌中异常升高，而且在慢性病毒性肝病也导致GP73上升。研究发现对于早期肝癌的检测，GP73的灵敏度比AFP高出2-3倍。但是GP73在良性病毒性肝病中也异常升高，所以单独GP73指标来预测肝癌发生也存在特异度问题。
2006年Richard R等在Molecular & Cellular Proteomics发表文献发现GP73和肝癌细胞其他相关蛋白类似，在肝细胞癌变后，GP73也发生核心岩藻糖基化，GP73的核心岩藻糖基化与肝癌的发生更为密切。实验证明GP73为指标，灵敏度和特异度分别为65％、90％。而采用质谱分析方法，以Fuc-GP73为指标，灵敏度和特异度分别为90％和100％。
凝集素是一类广泛存在于自然界的一大类非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，它能与糖专一性地、非共价地可逆结合，并且有凝集血细胞的作用，故称为凝集素。
Sumner和Howell于1936年首先从刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)种子纯化了伴刀豆凝集素-ConA。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推测ConA的血凝作用是与细胞表面糖作用的结果。
目前已有近千种植物被测得具有凝集素活性。植物中，不只种子中存在凝集素，根、茎、叶、皮、果实汁中也发现有凝集素。除植物外，其它生物，如各种真菌、某些病毒、无脊椎动物、脊椎动物及至人体的各种组织和器官中都存在凝集素。
凝集素可与糖专一性地结合。目前按结合糖的类型，凝集素可分为六类D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-岩藻糖；麦胚凝集素(WGA)可专一结合唾液酸。
鉴定得最清楚的植物凝集素家族是豆科，包括刀豆蛋白凝集素ConA、小扁豆凝集素LCA等。
小扁豆学名兵豆，从小扁豆中提取的凝集素LCA(Lens culinaris lectin)，可以特异结合核心岩藻糖基，橘果粉孢凝集素AAL也一样对核心岩藻糖基结合。
目前用于Fuc-GP73(或称为高尔基蛋白73异质体)的检测方法主要是凝集素亲和层析和质谱分析方法，但是该方法都无法应用到常规检测中。同时传统的凝集素亲和层析纯化糖基化蛋白，存在介质中残留物多，洗脱时的稀释导致样本浓度低等问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种分离肝癌高尔基蛋白Fuc-GP73(或称为高尔基蛋白73异质体)的预装离心柱及含有该预装柱的诊断试剂盒。通过该试剂盒可以真实地检测出血清中Fuc-GP73的含量水平，准确地诊断出早期原发性肝癌，具有极高的灵敏度，方法快速简便。
一种分离肝癌Fuc-GP73(或称为高尔基蛋白73异质体)的预装离心柱，该预装离心柱由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离心管装有偶联凝集素的亲合介质，所述下部收集管中装有缓冲溶液，所述分离管底部有一滤布，使得琼脂糖颗粒无法穿过的滤布。
所述凝集素包括小扁豆凝集素LCA和橘果粉孢凝集素AAL。
所述小扁豆凝集素LCA和橘胞粉凝集素AAL可以由商品化购买获得，例如从Sigma公司购买。
所述亲合介质可采用琼脂糖凝胶为基础载体的介质，如琼脂糖凝胶sephrose 4B、琼脂糖凝胶sephrose 6B或琼脂糖凝胶sephrose FF，琼脂糖凝胶sephrose CL-4B、琼脂糖凝胶sephrose CL-6B，所述缓冲溶液为凝集素的活性保护液。
所述琼脂糖凝胶为sephrose 4B，缓冲液为凝集素的活性保护液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述滤布是能阻挡偶联有凝集素的亲合介质穿过而不阻挡液体和蛋白质穿过的滤布。
所述装有偶联扁豆凝集素的琼脂糖凝胶由以下步骤得到的采用Pharmacia公司经CNBr活化的Sepharose 4B偶联LCA。
(1)将1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨胀，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗涤约30min；
(2)称取2mgLCA，溶于7.5mL偶联缓冲液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，与经洗涤的Sepharose 4B合并，以带塞的10mL试管上下颠倒混匀(室温，2h)；(3)以10mL偶联缓冲液洗去未偶联的LCA，测定洗涤液中的LCAI含量，计得偶联率为98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封闭剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris缓冲液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗涤3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗涤1次，4℃暂存备用。
本发明提供了与微量离心柱配套使用，用于洗脱结合到LCA-Sepharose上面的Fuc-GP73的洗脱液，其制作方法和组成如下20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4缓冲液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，为保证长时间保存而不长菌，加入防腐剂Proclin 300至0.1％。
洗脱步骤在洗脱时，将上述溶液加入其中，在温箱中温育30分钟，并离心收集达到洗脱的目的。
本发 明提供了一种采用该预装离心柱进行纯化Fuc-GP73步骤及其相关试剂组成。
该组合包括预装微量离心柱(内装已经偶联了小扁豆凝集素LCA的琼脂糖和其保护液)，清洗液(20mmTris-Hcl，PH7.4缓冲液，0.1％Proclin 300)，洗脱液(20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4缓冲液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，0.1％，Proclin 300)。
1.将待检测血清完全离心，无溶血；取出预装微量离心柱，弃去下层收集管中液体。
2.样本稀释吸取250ul血清于试管中，并加入350ul清洗液稀释、摇匀。
3.加样吸出450ul稀释后标本加入上部分离心管中。37℃温箱静置，此操作请不要盖离心管盖子，血清稀释液将在15分钟内流入下层收集管中；4.将收集管内液体弃去；5.往上部离心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下层收集管中(约3分钟)，盖上离心管盖，2000转(或3000转)室温下离心1分钟；6.弃去下层收集管中液体；7.往上部离心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下层收集管中(约3分钟)，盖上离心管盖，2000转(或3000转)室温下离心1分钟；8.弃去下层收集管中液体；9.加入洗脱液450ul，等洗脱液体数滴出现在下层收集管时，盖上离心管盖，放置37℃恒温箱中，温育30分钟；10.取出离心管，2000(或3000转)转室温下离心1分钟；11.收集流入下层收集管中的液体(样本1)备检测。
本发明提供了一种含有上述预装离心柱的化学发光试剂盒及其制作方法。
该化学发光试剂盒包括了分离Fuc-gp73(高尔基蛋白73异质体)的预装离心柱、包被了GP73单克隆抗体的化学发光酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的兔抗GP73多克隆抗体；底物溶液A、显色液B、Fuc-gp73清洗缓冲液、Fuc-gp73洗脱液、GP73标准品。
本试剂盒的制作方法如下(1)包被将GP73单克隆抗体(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)用0.05M柠檬酸缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。化学发光酶标板可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板；(2)阳性、阴性对照物阳性对照物收集GP73阳性肝癌病人腹水，过滤除菌、分装；阴性对照物收集GP73阴性正常人血清，过滤除菌、分装；(3)酶标记多抗(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)本试剂盒中的酶标多克隆抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体而制备的，步骤如下a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/m；b)和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗GP73抗体；(4)辅助试剂的配制方法如下a)底物溶液A通过市售获得b)显色液B通过市售获得c)Fuc-GP73清洗缓冲液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐剂d)Fuc-GP73洗脱液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐剂d)浓缩洗涤液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；(5)将预装离心柱、包被了GP73单克隆抗体的化学发光酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的抗GP73多抗、底物溶液A、显色液B、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、GP73标准品共同包装，得到试剂盒。
本发明还提供了一种含有上述预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及其制作。
该试剂盒包括了分离岩藻糖基化GP73(或高尔基蛋白GP73异质体)的预装离心柱；包被了高尔基蛋白GP73单克隆抗体的酶标板；阳性对照物、阴性对照物；酶标记的抗高尔基蛋白GP73多抗；底物溶液A、显色液B、反应终止液、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、GP73标准品、浓缩洗涤液。
本试剂盒的制作方法如下(1)包被将GP73单克隆抗体(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)用0.05M碳酸缓冲液稀释后(稀释浓度为20ug/ml)加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。酶标板是聚苯乙烯酶标板，可选用国产板或进口板；规格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆条板；(2)阳性、阴性对照物阳性对照物收集GP73阳性肝癌病人腹水，过滤除菌、分装；阴性对照物收集GP73阴性正常人血清，过滤除菌、分装；(3)酶标记GP73多抗(市售，Santa Cruze Biotechnology公司)本试剂盒中的酶标抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体而制备的，步骤如下a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化，达到终浓度10mg/ml；b)抗体和HRP在碱性碳酸盐缓冲液中透析6小时，实现HRP对单克隆抗体的标记，反应结束后用NaBH4溶液终止反应，再对PBS透析过夜；c)用饱和硫酸铵沉淀，获得纯化的HRP酶标抗GP73抗体；(4)辅助试剂的配制方法如下a)底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3％过氧化氢溶液；b)显色液B四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；c)GP73清洗缓冲液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐剂
d)GP73洗脱液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐剂e)浓缩洗涤液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；f)反应终止液2mol/L硫酸；(5)将预装离心柱、包被了GP73单克隆抗体的酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的抗GP73多抗、底物溶液A、显色液B、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、反应终止液、GP73标准品共同包装，得到试剂盒。
本发明克服了以往检测方法操作步骤烦琐、耗时长、需要配套设备多等缺点，操作者只需要离心和温育等简单操作，在2小时内就可以完成检测，直接定量计算出血样标本中所含的Fuc-GP73(高尔基蛋白73异质体)的含量，以Fuc-GP73含量超过5ng/ml为肝癌阳性判断，方法简便，检测快捷，结果准确，为肝癌的预防、诊断、治疗提供了支持。
附图为本发明预装离心柱的剖面结构示意图。
具体实施例方式
下面用实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。
参见附图，本发明提供的一种分离肝癌Fuc-GP73(高尔基蛋白73异质体)的预装离心柱，由位于上部的分离管1和位于下部的收集管3组成，通常可以采用将分离管插接到收集管上的方式实现两者的连接，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质4(为图面清晰起见，图中标注的是用于装亲合介质的管内空间，没有绘出介质实物)，所述下部收集管中装有缓冲溶液(为图面清晰起见，图中标注的是用于装缓冲溶液的管内空间，没有绘出溶液实物)，所述分离管底部主要是一滤布，该滤布采用能阻挡偶联有凝集素的亲合介质穿过而不阻挡液体和蛋白质穿过的滤布，以便在离心分离时，分离出来的液体和蛋白质能够透过该滤布进入下面的收集管。可以使用现有的这种滤布，并通过在分离管底部设置一个夹持塑料垫圈，将滤布固定住。
实施例1检测肝癌Fuc-GP73(高尔基蛋白73异质体)的酶联免疫定量检测试剂盒的制作该试剂盒(96人份)组成包括GP73阴性、阳性对照物各1瓶；GP73单克隆抗体包被板(96孔)1块；辣根过氧化物酶(HRP)标记的GP73多抗1瓶，6ml/瓶；GP73标准品1瓶；底物溶液A、显色液B各1瓶，5ml/瓶；反应终止液1瓶，5ml/瓶；Fuc-GP73清洗缓冲液 25ml/瓶Fuc-GP73洗脱液 15ml/瓶浓缩洗涤液(20倍浓缩液，20×) 20ml/瓶具体操作如下1.制备GP73-阴性、阳性对照物1)收集血清从医院或血站获得健康正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存备用；2)分装GP73阳性对照物肝癌阳性病人腹水，在无菌条件下分装入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃；
阴性对照物正常人血清，经检定为GP73阴性。取多份以上血清合并成批，经60℃1小时处理后，过滤除菌。在无菌的条件下分装入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.制作GP73单克隆抗体包被板a)包被酶标板采用进口或国产的12×8可拆条板。将GP73单克隆抗体用0.05mol/L碳酸盐缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液2％BSA封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；b)制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗GP73多抗兔抗GP73多抗可以商品化购得。
3.抗体的标记1)酶的氧化(全过程避光)a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)称取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌；d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌；f)室温静置30分钟；g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)抗体的准备及标记(避光)a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次；b)将抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小时以上，前两个小时换液一次；c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；d)用pH7.2的10 mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗GP73抗体a)完成标记的GP73抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3；b)4℃静置1小时；c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮；d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀；e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀；f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀；g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；h)提纯的HRP-多抗对PBS透析过夜；i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-多抗，获得克分子比接近1∶8的酶标抗单克隆抗体。
4)分装用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3)获得的酶标抗GP73多抗至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.辅助试剂的配制
1)底物溶液A磷酸-柠檬酸缓冲液(PH5.0)配制的3％过氧化氢溶液，按5ml/瓶分装；2)显色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分装；3)反应终止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分装；4)Fuc-GP73清洗缓冲液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐剂5)Fuc-GP73洗脱液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐剂6)浓缩洗涤液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；实施例2检测肝癌岩藻糖基GP73(高尔基蛋白73异质体)的化学发光检测试剂盒的制作该试剂盒(48人份)组成包括GP73阴性、阳性对照各1瓶；GP73单克隆抗体包被板(96孔)1块；辣根过氧化物酶(HRP)标记的GP73多抗1瓶，6ml/瓶；GP73标准品1瓶底物溶液A、显色液B各1瓶，5ml/瓶；Fuc-GP73清洗缓冲液 25ml/瓶Fuc-GP73洗脱液 15ml/瓶浓缩洗涤液(20倍浓缩液，20×) 20ml/瓶具体操作如下1.制备GP73-阴性、阳性对照物1)收集血清从医院或血站获得正常人血清、肝癌病人腹水，于-70℃保存备用；2)分装
GP73阳性对照物肝癌阳性病人腹水，在无菌条件下分装入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃；GP73阴性对照血清正常人血清，经检定为GP73阴性。取多份以上血清合并成批，经60℃1小时处理后，过滤除菌。在无菌的条件下分装入1.5mleppendorf管中，每管0.5ml。贮存于4℃。
2.制作GP73单克隆抗体包被板a)包被化学发光酶标板采用进口或国产的12×8可拆条板。将步骤1)AFP单克隆抗体用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释为20μg/ml后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用清洗缓冲液洗板，再用该封闭液缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。按96孔/块用铝箔袋包装、真空封闭；b)制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗GP73多抗兔抗GP73抗体可以商品化购得。
3.抗体的标记1)酶的氧化(全过程避光)a)称取HRP 5mg，加ddH2O 250μl溶解；b)称取NaIO45mg，加ddH2O 250μl溶解，配制成20mg/mL的浓度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaIO4溶液，边加边搅拌；d)将混合好的溶液置于4℃，静置30分钟；e)取5ml乙二醇溶于25μl ddH2O中，逐滴加入上述混合溶液中，边加边搅拌；f)室温静置30分钟；g)酶氧化过程完成，HRP终浓度为10mg/ml。
2)抗体的准备及标记(避光)
a)调整抗体浓度到5mg/ml左右(蛋白浓度过低则用PEG20000浓缩)，用pH9.5左右的50mmol/L CB(1mol/L NaHCO3与1mol/L Na2CO3按10∶1的比例混合，使用前以蒸馏水稀释20倍)透析去甘油或杂质(如Tris)，4℃下透析过夜，其中换液3次；b)将抗体与HRP按1∶4混合，于50mmol/L pH9.5 CB中透析6小时以上，前两个小时换液一次；c)用新鲜配置的1mg NaBH4溶液终止反应。摇匀，4℃静置2小时，每半小时摇一次，NaBH4溶液加入的量要合适；d)用pH7.2的10mM PBS(预配置0.01mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4储备液，根据需要的pH值混匀二者成PBS缓冲液)透析过夜。换液一次即可。
3)纯化HRP酶标抗GP73抗体a)完成标记的单克隆抗体溶液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液，边加入边搅拌，直至饱和硫酸铵浓度降低至1/3；b)4℃静置1小时；c)8000rpm离心10分钟，将上清移至新管中，沉淀用等体积PBS重新悬浮；d)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到40％，分别收集上清和沉淀；e)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到50％，分别收集上清和沉淀；f)重复以上操作，将饱和硫酸铵浓度提高到60％，分别收集上清和沉淀；g)收集分离的各个组分，SDS-PAGE鉴定纯度；h)提纯的HRP-多抗对PBS透析过夜；
i)超滤管离心浓缩纯化的HRP-多抗，获得克分子比接近1∶8的酶标抗多抗。
4)分装用含10％胎牛血清的缓冲液稀释由步骤3获得的酶标抗GP73多抗至合适的工作浓度，按6ml/瓶分装，贮存于4℃。
4.辅助试剂的配制1)底物溶液A1.0ml EDTA(1.0×10-2M、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)和0.2ml Tween20(1％)2)显色液Bluminol 5.0×10-4Mol/L；3)Fuc-GP73清洗缓冲液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐剂4)Fuc-GP73洗脱液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐剂5)浓缩洗涤液(20倍浓缩液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液；实施例3预装离心柱的制备和使用1、预装离心柱由离心柱和填充介质组成，离心柱由上部的离心管和下部的收集管组成，二者套在一起，组成离心柱，辅助试剂包括Fuc-GP73清洗液和Fuc-GP73洗脱液。
2、离心柱填充材料的制备采用Pharmacia公司经CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的LCA，按以下步骤偶联(1)将1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨胀，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗涤约30min；(2)称取50mg LCA，溶于7.5mL偶联缓冲液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，与经洗涤的Sepharose 4B合并，以带塞的10mL试管上下颠倒混匀(室温，2h)；
(3)以10mL偶联缓冲液洗去未偶联的LCA。经测定洗涤液中的LCA1含量，计得偶联率为98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封闭剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris缓冲液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗涤3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗涤1次，4℃暂存备用。
3、在上部分离心管中，加入一层滤布，并加一个塑料垫圈固定，该滤布的孔径小于琼脂糖，因此琼脂糖不能经过，但是蛋白质量和液体可以流过。取300ul已经偶联的凝集素的sephrose 4B加入离心柱上部的离心管中。
4、加入1ml-2ml凝集素保存缓冲液，缓冲液充满存在介质的部位，并大部分存在于下面的收集管中，本发明预装离心柱下部收集管中的缓冲液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5本预装离心柱的使用方法如下1.将待检测血清完全离心，无溶血；取出预装微量离心柱，弃去下层收集管中液体。
2.样本稀释吸取250ul血清于试管中，并加入350ul清洗液稀释、摇匀。
3.加样吸出450ul稀释后标本加入上部分离心管中。37℃温箱静置，此操作请不要盖离心管盖子，血清稀释液将在15分钟内流入下层收集管中；4.将收集管内液体弃去；5.往上部离心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下层收集管中(约3分钟)，盖上离心管盖，2000转(或3000转)室温下离心1分钟；6.弃去下层收集管中液体；
7.往上部离心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下层收集管中(约3分钟)，盖上离心管盖，2000转(或3000转)室温下离心1分钟；8.弃去下层收集管中液体；9.加入洗脱液450ul，等洗脱液体数滴出现在下层收集管时，盖上离心管盖，放置37℃恒温箱中，温育30分钟；10.取出离心管，2000(或3000转)转室温下离心1分钟；11.收集流入下层收集管中的液体(样本1)备检测。
本发明的试剂盒的质量检测方法是1)蛋白载量偶联LCA的含量通过计算偶联前蛋白含量减去未偶联蛋白获得含量。要求不低于7mg/ml，在7mg/ml-10mg/ml可以取得较好的结果。
2)准确性10份正常阴性质控血清(包括特异性对照血清)参考品的检测结果，无假阳性出现。5份肝癌GP73阳性质控血清的参考品检测结果无假阴性出现。
3)精密度随机抽取20盒不同批次试剂盒，用同一份肝癌阳性质控血清按说明书操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于15％。
3)检测灵敏度根据GP73标准品稀释测定结果，本试剂盒的检测灵敏度为1ng/ml。
4)特异性取四份待测样品混合后分为四份混合血清标本，每份1ml。分别加入50ng剂量的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、血纤维蛋白溶酶(Plasmin)、或纤粘连蛋白(FN)后制成干扰试验血清标本#1、#2、#3，未加任何干扰物的#4混合血清标本作为基础样品。按说明书操作步骤进行测定并计算结果。然后按干扰试验计算公式计算干扰率。标本#1、#2、#3的干扰误差均小于5％。
实施例4用本发明提供的检测肝癌Fuc-GP73(高尔基蛋白73异质体)的化学发光检测试剂盒进行Fuc-GP73含量检测的方法和步骤是一、试剂盒组成1，鼠抗人GP73单抗包被板2，兔抗人GP73多抗酶标记物3，化学发光底物A和B4，浓缩洗涤液5，预装LCA-Sepharose 4B离心管6，LCA清洗液7，LCA洗脱液8，GP73定量标准品9，说明书10，盖板膜二、标本处理和Fuc-GP73纯化1.将待检测血清完全离心，无溶血；取出预装微量离心柱，弃去下层收集管中液体。
2.样本稀释吸取250ul血清于试管中，并加入350ul清洗液稀释、摇匀。
3.加样吸出450ul稀释后标本加入上部分离心管中。37℃温箱静置，此操作请不要盖离心管盖子，血清稀释液将在15分钟内流入下层收集管中；4.将收集管内液体弃去；5.往上部离心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下层收集管中(约3分钟)，盖上离心管盖，2000转(或3000转)室温下离心1分钟；6.弃去下层收集管中液体；
7.往上部离心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下层收集管中(约3分钟)，盖上离心管盖，2000转(或3000转)室温下离心1分钟；8.弃去下层收集管中液体；9.加入洗脱液450ul，等洗脱液体数滴出现在下层收集管时，盖上离心管盖，放置37℃恒温箱中，温育30分钟；10.取出离心管，2000(或3000转)转室温下离心1分钟；11.收集流入下层收集管中的液体(样本1)备检测。
三、定量检测Fuc-GP731.设计好包被板的位置及数量，未用的包被板密闭，放入到2-8℃冰箱中。
2.加入50μl已处理样本1到相应的包被板微孔中。
3.37℃温育30分钟。
4.洗涤5次，扣干包被板上残留的液体。
5.依次向各孔中加入100μl的酶结合物。
6.37℃温育30分钟7.洗涤5次，扣干包被板上残留的液体8.向每孔加入50μl底物液，请预先将A、B液等体积混合；或向每孔中先加25μl底物A再加25μl底物B，轻轻拍匀5秒钟。
9.在加入底物后10分钟内采用化学发光仪进行检测。
四、结果判定制作标准曲线以标准品浓度为横坐标，标准品测定的RLU值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.95时本次测定有效；将检测所得的读值按该试剂标准品曲线计算Fuc-GP73含量，Fuc-GP73含量大于5ng/ml为肝癌阳性判断。
实施例5采用本发明提供的试剂盒对肝癌病人阳性样品的检测结果
为判断本发明化学发光检测试剂盒和酶联免疫试剂盒与临床肝癌检测结果的符合率，取本发明的两种试剂盒进行了对比检测实验。采用北京佑安医院提供的标本进行对比检测50份已知原发性肝癌阳性标本，30份肝硬化血清、80份肝炎，这些肝病标本均为临床病理确诊。采用河北红十字血液中心200份体检健康血清。分别用化学发光检测试剂盒及酶联免疫定量检测试剂盒进行检测(2种方法检测不一致时以阳性数量多者计算)，结果见表1。
表1.在不同标本中检出率比较
本实验结果表明，本发明对于50份原发性肝癌的阳性符合率高达100％，在肝硬化中的特异性高达94％，在肝炎中的特异度高达90％。
权利要求
1.一种分离岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱，其特征在于其由上部分离管和下部收集管组成，所述上部离管装有偶联凝集素的亲合介质，上部的分离管底部有一滤布，所述下部收集管中装有缓冲溶液。为纯化亲和吸附的蛋白，并配套清洗液和洗脱液。
2，如权利要求1所述的分离岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱，其特征在于所述凝集素为小扁豆凝集素LCA或橘果粉孢凝集素AAL。
3.如权利要求1所述的分离岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱，其特征在于所述亲和介质是采用琼脂糖凝胶为基础载体，包括琼脂糖凝胶sepharose 4B、琼脂糖凝胶sepharose 6B、或琼脂糖凝胶sepharose FF、琼脂糖凝胶sepharose CL-4B、琼脂糖凝胶sepharose CL-6B。所述缓冲溶液为凝集素的活性保护液。
4.如权利要求1所述的分离岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱，其特征在于所述滤布是能阻挡偶联有凝集素的亲和介质穿过而不阻挡液体和蛋白质穿过的滤布。
5.如权利要求3所述的分离岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱，其特征在于所述装有偶联小扁豆凝集素的琼脂糖凝胶通过以下步骤获得(1)将溴化氢活化的Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗涤；(2)称取LCA，溶于偶联缓冲液中，与经洗涤的Sepharose 4B合并混匀；(3)用偶联缓冲液洗去未偶联的LCA，测定洗涤液中的LCA含量。(4)用甘氨酸封闭剩余活化基因，洗涤，4℃暂存备用。
6.如权利要求1所述的分离岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱，其特征在于下部收集管中的缓冲液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH7.5。
7，如权利要求1所指的预装离心柱的使用配套溶液包括清洗缓冲液(20mmol/L Tris-HcL，PH7.4)和洗脱缓冲液(20mmol/LTris-HcL，PH7.4，500mmol/L α-甲基-D-甘露糖苷)。
8.一种检测岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的定量检测试剂盒，其特征为试剂盒所含的标本处理系统如权利要求1所述，经过权利要求1所述的装置进行离心、洗脱获得Fuc-GP73后，然后进行定量检测，方法包括放射免疫测定法、荧光免疫测定法(时间分辨荧光技术)、酶免疫测定法、免疫胶体金标记技术、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法。
9.一种如权利要求8所述的检测岩藻糖基化GP73的定量检测试剂盒，其特征为标本处理系统如权利要求1所述，检测GP73和Fuc-GP73含量采用化学发光方法，检测试剂盒包括下列组件(1)分离岩藻糖基化GP73的预装离心柱；(2)包被了GP73抗体的化学发光酶标板；(3)阳性对照物、阴性对照物；(4)酶标记的抗GP73抗体；(5)化学发光底物溶液A、化学发光底物显色液B、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、GP73标准品。所述分离肝癌岩藻糖基化GP73的预装离心柱由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质，所述下部收集管中装有缓冲溶液。
10.如权利要求7所述的试剂盒，其制作方法包括以下步骤(1)高滴度的GP73单克隆抗体包被到酶标板吸附过夜；(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；(3)收集GP73阳性肝癌病人腹水，过滤除菌、分装，即获得阳性对照物或作为阳性质控血清。收集GP73阴性正常人血清，过滤除菌、分装，即获得阴性对照物；(4)获得酶标记的兔抗GP73多抗；(5)将预装离心柱、包被了GP73单克隆抗体的化学发光酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的兔抗GP73多抗、底物溶液A、显色液B、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、GP73标准品、浓缩洗涤液共同包装，得到试剂盒。
11.一种如权利要求8所述的检测肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的定量检测试剂盒，其特征为标本处理系统如权利要求1所述，检测Fuc-GP73含量采用酶联免疫定量分析方法，检测试剂盒包括下列组件(1)分离肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱；(2)包被了GP73抗体的酶标板；(3)阳性对照物、阴性对照物；(4)酶标记的兔抗GP73多抗；(5)底物溶液A、显色液B、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、反应终止液、GP73标准品、浓缩洗涤液，所述分离肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白GP73的预装离心柱由上部分离管和下部收集管组成，所述上部分离管装有偶联凝集素的亲合介质，所述下部收集管中装有缓冲溶液。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其制作方法包括以下步骤(1)高滴度的GP73单克隆抗体(市售)包被到酶标板吸附过夜；(2)用吐温磷酸盐缓冲液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐温磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干；(3)收集GP73阳性肝癌病人腹水，过滤除菌、分装，即获得阳性对照物。收集GP73阴性正常人血清，过滤除菌、分装，即获得阴性对照物。(4)获得酶标记的兔抗GP73多抗；(5)将预装离心柱、包被了GP73单克隆抗体的酶标板、阳性对照物、阴性对照物、酶标记的兔抗GP73多抗、底物溶液A、显色液B、Fuc-GP73清洗缓冲液、Fuc-GP73洗脱液、反应终止液、GP73标准品、浓缩洗涤液共同包装，得到试剂盒。
全文摘要
本发明涉及了一种分离肝癌相关岩藻糖基化高尔基蛋白73(或称为高尔基蛋白73异质体)的预装离心柱。该离心柱由上部分离管和下部收集管组成。上部分离管装有偶联小扁豆凝集素(LCA)的亲合介质，上部分离管底部是一个滤布，下部收集管中装有缓冲溶液。小扁豆凝集素(LCA)能与岩藻糖基化高尔基蛋白73上的糖链相结合，通过加入洗脱液并离心进行纯化Fuc－GP73组分。本发明还涉及了一种含有该预装离心柱的化学发光检测试剂盒和一种含有该预装离心柱的酶联免疫定量检测试剂盒及其制备、使用方法。应用该试剂盒可快速、简便的测定肝癌岩藻糖基化高尔基蛋白73的含量，准确的对肝癌进行早期诊断，为肝癌的预防、诊断、治疗提供支持。
文档编号G01N33/68GK101062939SQ200710107508
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月17日 优先权日2007年5月17日
发明者林长青 申请人:北京热景生物技术有限公司