专利名称：紫菜藻胆蛋白光敏抑制肝癌活性的测定方法
技术领域：
本发明涉及藻胆蛋白对肿瘤细胞的光敏抑制作用活性的测定方法，特别是涉及条斑紫菜藻胆蛋白对人肝癌细胞的光敏抑制作用活性的测定方法。
背景技术：
光动力疗法是近20年来建立和发展起来的一种新型肿瘤疗法。其原理主要通过光敏剂富集于病灶处，并在光照下产生光敏损伤来实现对肿瘤细胞的杀伤作用。光动力治疗在很大程度上取决于采用的光敏剂的性质。
传统光敏剂具有严重的皮肤光毒性等缺点，开发新型光敏剂成为研究热点。藻胆蛋白是很好的纯天然色素，可用于食物、化妆品、荧光检测等领域，近年来，根据其吸收光谱的特征和产生自由基特点，藻红蛋白、藻蓝蛋白均可作为光敏剂，国内首先有蔡心涵、何立明等报道100ug/mL螺旋藻藻蓝蛋白经铜泵激光器辐照12 J/cm2，使人大肠癌细胞HR8348存活率仅为22. 2% 。之后又有李冠武、王广策等报道用提取自多管藻的藻红蛋白处理人口腔8113细胞和小鼠S180细胞，再经488nm氩离子激光器辐照25 J/cm2，发现细胞存活率分别为25%和24%。藻胆蛋白以其高效、无毒、副作用小等优点，被认为是光动力学治疗法中一种非常有前景的光敏剂。相比螺旋藻、多管藻，条斑紫菜在我国己大量人工栽培，具有量上的优势，其本身作为高等红藻也富含藻胆蛋白。
以条斑紫菜为原料，进行藻胆蛋白抑瘤活性的研究，可以为藻胆蛋白药物的开发提供更多的原料选择，及光敏剂药物制备的详实依据。藻胆蛋白抑制肝癌活性的研究模型的建立，能为有效药物的合理开发与完善提供简便有效的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供藻胆蛋白光敏抑制肝癌活性的测定方法，以建立一种紫菜藻胆蛋白光敏剂抑制肝癌活性研究的模型，为抑瘤光敏剂药物的开发制备提供新技术方案。本发明的目的是这样实现的
藻胆蛋白抑制肝癌活性的测定方法，包含以下步骤
(1) 培养人肝癌7721细胞株，当细胞生长旺盛时，用胰酶消化细胞，接种于96孔板；
(2) 将浓度为100-250yg/mL的藻胆蛋白无血清培养基替代上述培养基，培养4小时；
(3) 用碘钨灯或He-Ne激光器辐照上述96孔板；碘钨灯辐照时隔热，辐照结束后再换入新鲜培养液继续培养24h;
(4) 用MTT法测定杀伤率，测定藻胆蛋白抑制肝癌的活性。其特征在于所述的细胞培养液为10%小牛血清的1640培养液。所述的细胞培养条件为37T:、 5%0)2浓度及饱和湿度。所述的隔热，是指被照射样品与光源之间加隔热水槽以消除温度影响。所述的激光辐照能量为35-100J/cm2。
由于本发明以条斑紫菜藻胆蛋白和人肝癌7721细胞为材料，通过碘钨灯或He-Ne激光器辐照杀伤肿瘤细胞，因此，具有以下优点
1、 藻胆蛋白来源丰富，我国是紫菜生产大国，年产量20亿张左右，目前市场上大多是自然凉干的紫菜，销售价格在每千克20 - 30元，而每吨饲料级螺旋藻干粉6-8万元人民币(60 - 80元/千克)，曾一度高达每kg 30美元
(约240元/千克)，是紫菜的十倍，因此本发明所用原料来源广泛，无需加工，成本相对于螺旋藻便宜的多；
2、 藻胆蛋白提取方便，根据之前制备流程(发明专利申请号2004100990370)，目前从条斑紫菜提取高纯度藻胆蛋白工艺简单，成本低廉，得率较高；
3、 我国是肝癌的高发地区，发病率占全球的45%，占癌症死亡率的第三位，光动力治疗肿瘤副作用小，该方法一旦应用于临床，市场前景广阔；
4、 该方法以碘钨灯或He-Ne激光器为光源，可根据具体情况灵活使用；
5、 从结果看，条斑紫菜藻红蛋白和藻蓝蛋白均对人肝癌7721细胞有较高杀伤率，是一种有效的光敏剂。
图l:藻胆蛋白光动力杀伤对7721细胞存活率的影响
具体实施例方式
以下结合实施例，对本发明所公开的的藻胆蛋白抑制肝癌活性的测定方法作进一步详细的描述。条斑紫菜(采自江苏吕泗条斑紫菜栽培海区)，藻胆蛋白
(按2004100990370提取)，人肝癌7721细胞株(购自中科院细胞库)。其余试剂为化学分析纯按常规配制。
实施例一
本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻红蛋白(R-PE，紫菜藻红蛋白)和人肝癌7721细胞株，所用光源为碘钨灯，具体步骤如下
(1) 、人肝癌7721细胞株用含10%小牛血清的1640培养液培养，培养条件为37°C、 5%0)2浓度及饱和湿度。
(2) 、当细胞生长旺盛时，用含EDTA的胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞稀释至106/ml，每孔100uL接种于96孔板。
(3) 、将终浓度IO、 25、 50、 100ug/mL纯度为5. 5 (A564nm / A280nm)的藻红蛋白的无血清培养基替代上述培养基，培养4小时。
(4) 、用碘钨灯(购自上海顺丽照明电器有限公司，型号J118)辐照上述96孔板4h，被照射样品与光源之间加隔热水槽，以消除温度影响；并加有相应滤光片以滤去杂波，辐照功率密度约70mW/cm2，累计能量密度50J/cm2。
(5) 、碘钨灯辐照结束后再换入新鲜培养液继续培养24h，用MTT法测定各孔吸光度。
(6) 、以不加任何处理的培养细胞为空白对照，以单用藻胆蛋白不加碘钨灯辐
照以及不加蛋白单用碘钨灯辐照的培养细胞作为阴性对照。
(7) 、结果显示100 ug/mL浓度藻红蛋白对人肝癌7721细胞的光动力学杀伤率最高，为39%。见图1中曲线R-PE。
实施例二本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻蓝蛋白(C-PC，紫菜藻蓝蛋白)和人肝癌7721细胞株，所用光源为碘钨灯，具体步骤如下
(1) 、人肝癌7721细胞株用含10%小牛血清的1640培养液培养，培养条件为37°C、 5%0)2浓度及饱和湿度。
(2) 、当细胞生长旺盛时，用含EDTA的胰酶消化细胞，洗漆吹散细胞稀释至106/ml，每孔100tiL接种于96孔板。
(3) 、将终浓度IO、 25、 50、 100ug/mL纯度为4.0 (A615nm / A280nm)藻蓝蛋白的无血清培养基替代上述培养基，培养4小时。
(4) 、用碘钨灯(购自上海顺丽照明电器有限公司，型号J118)辐照上述96孔板4h，被照射样品与光源之间加隔热水槽，以消除温度影响；并加有相应滤光片以滤去杂波，辐照功率密度约70mW/cm2，累计能量密度50J/cm2。
(5) 、碘钨灯辐照结束后再换入新鲜培养液继续培养24h，用MTT法测定各孔吸光度。
(6) 、以不加任何处理的培养细胞为空白对照，以单用藻胆蛋白不加碘钩灯辐照以及不加蛋白单用碘钩灯辐照的培养细胞作为阴性对照。
(7) 、结果显示100 u g/mL浓度藻蓝蛋白对人肝癌7721细胞的光动力学杀伤率最高，为28%。见图1中曲线C-PC。
实施例三
本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻红蛋白(R-PE，紫菜藻红蛋白)和人肝癌7721细胞株，所用光源为He-Ne激光器(QHP型，上海玻璃仪器一厂)，具体步骤如下
(1) 、人肝癌7721细胞株用含10%小牛血清的1640培养液培养，培养条件为37°C、 5%0)2浓度及饱和湿度。
(2) 、当细胞生长旺盛时，用含EDTA的胰酶消化细胞，洗涤吹散细胞稀释至106/ml，每孔100uL接种于96孔板。
(3) 、将终浓度30、 60、 120、 250ug/mL纯度为5. 5 (A564nm / A280nm)的藻红蛋白的无血清培养基替代上述培养基，培养4小时。
(4) 、用波长514nm的氩离子激光器(美国Coherent公司，I丽OVR 400)逐照射上述96孔板，激光器输出功率100mW，每孔15min，累计能量密度100J/cm2。
(5) 、辐照结束后再换入新鲜培养液继续培养24h，用MTT法测定各孔吸光度。
(6) 、以不加任何处理的培养细胞为空白对照，以单用藻胆蛋白不加激光辐照 以及不加蛋白单用激光辐照的培养细胞作为阴性对照。
(7) 、结果如表l，显示250ug/mL浓度藻红蛋白对人肝癌7721细胞的光动力 学杀伤率最高，为80%。
表1 R-PE光动力杀伤对7721细胞存活率的影响(100J/cm2,哭土S)
R-PE浓度梯度 /(u g.mL")0 (对照)3060120250
重复例数1212121212
R-PE组存活率X/59±5.0*40±6.1**27±6.4"20±5.6**
t检验，*p<0.05， **/ <0.01
实施例四
本实施例中所用的材料为条斑紫菜藻蓝蛋白(C-PC，紫菜藻蓝蛋白)和人 肝癌7721细胞株，所用光源为He-Ne激光器，具体步骤如下
(1) 、以纯度为4.0(A615nm/A280nm)藻蓝蛋白替代藻红蛋白做实施例三中(1) -(3)各步操作。
(2) 、用波长632.8nm的He-Ne激光器逐孔照射上述96孔板，激光器输出功率 约为30mW，每孔20min，累计能量密度约为35 J/cm2。
(3) 、按实施例三中(5) - (6)各步操作。
结果见表2，显示250ii g/mL浓度藻蓝蛋白对人肝癌7721细胞的光动力学
杀伤率最高，为59%。
表2 C-PC光动力杀伤对7721细胞存活率的影响(35J/cm2, X±S)
C-PC浓度梯度 /(u g-ml/1)0 (对照)3060120250
重复例数1212121212
C-PC组存活率^/73+6.0*65±4.8**47±6.7**41±7.1**
t检验，*/ <0.05， **p<0.01
权利要求
1、藻胆蛋白抑制肝癌活性的测定方法，其特征在于包含以下步骤(1)培养人肝癌7721细胞株，当细胞生长旺盛时，用胰酶消化细胞，接种于96孔板；(2)将浓度为100-250μg/mL的藻胆蛋白无血清培养基替代上述培养基，培养4小时；(3)用碘钨灯或He-Ne激光器辐照上述96孔板；碘钨灯辐照时隔热，辐照结束后再换入新鲜培养液继续培养24h；(4)用MTT法测定杀伤率，测定藻胆蛋白抑制肝癌的活性。
2、 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的细胞培养液为10%小牛血清的1640培养液。
3、 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的细胞培养条件为37°C、 5%0)2浓度及饱和湿度。
4、 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的隔热，是指被照射样品与光源之间加隔热水槽以消除温度影响。
5、 如权利要求1所述的测定方法，其特征在于所述的激光辐照能量为35-100J/cm2。
全文摘要
本发明提供一种藻胆蛋白抑制肝癌活性的测定方法以条斑紫菜藻胆蛋白作为光敏剂，以碘钨灯或He-Ne激光器为光源，通过对人肝癌7721细胞抑制作用的研究，测定紫菜藻胆蛋白对肝癌细胞的抑制活性。为紫菜藻胆蛋白在抑瘤方面的开发应用，提供新的研究模型；为抑制肝癌的光敏剂的开发提供更为丰富廉价且有效的原料。
文档编号C12Q1/18GK101633949SQ20091019450
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月25日 优先权日2009年8月25日
发明者何培民, 李春霞, 卿 汪, 源 王, 蔡春尔 申请人:上海海洋大学