一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其应用，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1，其编码的蛋白含有529个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2，预测蛋白分子量为58.8kDa。本发明通过对编码岩藻多糖水解酶的基因GenBank No：AJ877239进行密码子优化，优化后共有1599bp个碱基，载入克隆载体为pET28a中，使优化的岩藻多糖水解酶的基因可以在大肠杆菌BL21中表达，获得了一种能够高效，专一水解岩藻多糖的糖苷水解酶，为岩藻多糖水解提供了一种生物降解酶。
【专利说明】
一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列及其应用，属于分子生物 学、基因工程、糖化学领域。
【背景技术】
[0002] 岩藻多糖是一种独特的结合有硫酸基团的水溶性多糖，多存在于褐藻及海洋无脊 椎动物中，由硫酸基岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、鼠李糖、糖醛酸等单糖组成。其多糖结构 主要包括两种主链类型：I由（1-3)连接的a-L-岩藻糖残基构成；II由包含交替的（1-3)， (1-4)-连接的a-L_岩澡糖残基构成。
[0003] 岩藻多糖作为一种广泛纯在于褐藻中的生物多糖，其生物学活性越来越被广大研 究人员关注，各种生物学活性，陆续被发现报道。研究发现岩藻多糖具有抗凝血、抗肿瘤、抗 炎等生物活性（Holtkamp，A.D.，et al.，Appl .Microbiol .Biotechnol. ,2009,82,1-11)。
[0004] 岩藻多糖由于分量大，不易吸收，制约了岩藻多糖的广泛应用。而岩藻寡糖分子由 于具有分子量小、易吸收、水溶性好、生物活性多样等特点，日益受到人们的关注 (Hoitkamp，A.D?，et al ?，Appl .Microbiol .Biotechnol ?，2009,82，1-11。所以岩藻寡糖的 制备成为岩藻多糖利用的关键技术。
[0005] 目前寡糖的制备方法主要有化学法、物理法及生物降解法。化学法主要包括酸解 法和氧化法，其中酸解法是企业生产寡糖采用的主要方法，具有速度快、技术简单的特点， 但是需要剧烈的反应条件(强酸以及加热回流），因此该方法具有产物分子量分布宽泛、质 量不可控、生产成本高、对环境污染大等缺点。氧化法主要是利用H 202等强氧化剂降解多糖， 同样存在着产物分子量分布宽泛、质量不可控、环境污染大等问题。物理法主要是利用微波 等方法降解多糖，不过目前还在实验阶段，并未广泛应用。生物降解法主要是利用专一性的 糖苷水解酶水解多糖，该方法具有反应条件温和、产品均一度高、产品质量可控、成本低、环 境污染低等优点。因此，该方法越来越受到人们重视。但是，生物降解法需要使用高效、专一 的糖苷水解酶。目前针对岩藻多糖水解酶研究的报道还比较少，市场上还未见利用生物法 制备的岩藻寡糖产品。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列，及其该核苷酸 序列表达的岩藻多糖水解酶在制备岩藻寡糖方面的应用。本发明的技术方案如下：
[0007] 岩藻多糖水解酶表达菌株的构建
[0008] 参照编码岩藻多糖水解酶的基因(GenBank N〇:AJ877239)，通过密码子优化，委托 生物工程(上海)股份有限公司合成了截断的岩藻多糖水解酶基因，共有1599bp个碱基，核 甘酸序列为SEQ ID NO. 1，克隆载体为pET28a，结构如图1所示，克隆位点为Ndel和Xhol，载 体抗性为卡那霉素(Kan)，优化物种为E.coli。对携带表达质粒pET28a-Fuc的大肠杆菌进行 培养，使用Plasmid Mini Kit I试剂盒提取质粒，然后将表达质粒导入感受态大肠杆菌 BL21 (DE3)中，获得重组菌株。
[0009] 本发明中，核苷酸SEQ ID NO. 1编码的蛋白含有529个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID N0.2,预测蛋白分子量为58.8kDa。
[0010] 岩藻多糖水解酶在重组菌种中的表达
[0011] (1)配制含有Kan抗性的LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化 钠，120°C灭菌20min，冷却到室温加入Kan使其终浓度50ug/ml。
[0012] ⑵将上述得到重组菌株，接种到含有Kan抗性的固体LB培养基上，37 °C过夜培养， 挑取单菌落接种到5ml含有Kan抗性的液体LB培养中，37°C，200rmp摇床培养24小时后，将上 述菌液接种到500ml含有Kan抗性的液体LB培养中，37°C、200rmp床培养至0D6Q()nm = 0.6时， 加入0.5mM IPTG，16°C、200rmp诱导表达24小时，5000rmp离心，收集菌体。
[0013] 本发明所具有的优点：本发明通过对岩藻多糖糖苷水解基因进行序列优化，使其 可以在大肠杆菌BL21中表达，获得了一种能够高效，专一水解岩藻多糖的糖苷水解酶，为岩 藻多糖水解提供了一种生物降解酶。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明岩藻多糖水解酶的表达质粒结构示意图；
[0015] 图2为本发明表达岩藻多糖水解酶镍柱纯化的SDS-PAGE电泳图；其中，M为marker; 1 为上清；2 为穿透；3 为BufferA;4为BufferA+20mM 咪唑；5 为BufferA+20mM 咪唑；6 为BufferA +60mM 咪唑；7 为BufferA+60mM 咪唑；8 为BufferA+lOOmM 咪唑；9 为BufferA+lOOmM 咪唑；10 为 BufferA+160mM 咪唑；11为BufferA+160mM 咪唑；12 为BufferA+500mM 咪唑；
[0016]图3为本发明表达岩藻多糖水解酶的Western Blot检测结果，其中，100、75、50、 37、25的单位是1(0&;
[0017] 图4为本发明岩藻多糖水解酶降解产物的HPLC检测结果，其中，1为岩藻寡糖_1;2 为岩藻寡糖-2; 3为岩藻寡糖-3; 4为岩藻寡糖-4; 5为岩藻寡糖-5; 6为岩藻寡糖-6; 7为岩藻 寡糖-7。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应 该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修 改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0019] 实施例1岩藻多糖水解酶在重组菌种中的表达
[0020] (1)配制含有Kan抗性的LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，10g/L氯化 钠，120°C灭菌20min，冷却到室温加入Kan使其终浓度50ug/ml。
[0021 ] (2)将上述得到重组菌株，接种到含有Kan抗性的固体LB培养基上，37 °C过夜培养， 挑取单菌落接种到5ml含有Kan抗性的液体LB培养中，37°C，200rmp摇床培养24小时后，将上 述菌液接种到500ml含有Kan抗性的液体LB培养中，37°C、200rmp床培养至0D6Q()nm = 0.6时， 加入0.5mM IPTG，16°C、200rmp诱导表达24小时，5000rmp离心，收集菌体。
[0022 ]实施例2对表达的岩藻多糖水解酶的检测
[0023] 将实施例 1 收集到菌体，悬浮到Buffer A(50mMTri-HCl+500mM NaCl，pH7.9)缓冲 溶液中进行超声破碎，12000rmp离心收集上清，进行SDS-Page检测，如图2所示。预测蛋白分 子量为58.8kDa，然后进行Western Blot检测，如图3所示。
[0024] 实施例3对表达的岩藻多糖水解酶的纯化 [0025]使用镍柱对上述蛋白进行纯化：
[0026] (1)以Buffer A(50mMTri-HCl+500mM NaCl，pH7.9)平衡柱子，流速lml/min;
[0027] (2)以Buffer A上样，流速lml/min，收集穿透。
[0028] (3)以Buffer A洗脱，流速lml/min，洗脱30ml;
[0029] (4)依次使用含有2〇111]\1、6〇1111、10〇111]\1、16〇1111、50〇1111咪唑的81^€61八洗脱，流速11111/ min，每5min收集一管；
[0030] (5 )G250检测每个收集组分中蛋白含量；
[0031] (6)选取每个咪唑浓度洗脱蛋白含量高的组、原液、上样穿透、1 XBinding Buffer 洗脱，进行SDS-PAGE检测，如图2所示。
[0032]按照上述步骤获得纯化后的岩藻多糖糖苷水解酶蛋白，使用8000Da的蛋白浓缩管 进行浓缩。
[0033]实施例4岩藻多糖水解酶水解岩藻多糖实验 [0034](一)水解条件 [0035] 底物浓度:0.25%
[0036] 反应buffer:Tris-HCl+0.05M CaCl2+0.3M NaCl，pH 7.5
[0037] 反应体积：1ml
[0038] 酶浓度：l〇〇ul(1.52mg/ml)
[0039] 反应温度：30 °C
[0040] 反应时间：24小时
[0041 ](二)对水解产物HPLC检测
[0042]实验条件：
[0043] (1)仪器:华谱S6000液相色谱仪
[0044] (2)色谱柱:华谱XAmide分析色谱柱
[0045] (3)检测器:蒸发光检测
[0046] (4)色谱条件:如表1所示，其中，A:水;B:乙腈;C: 100mM甲酸铵
[0047] (5)上样量:2〇ul
[0048] (6)检测器条件:增益6
[0049]表 1
[0051]检测结果如图4所示，岩藻多糖水解酶水解岩藻多糖后获得7个含有岩藻寡糖的组 分，命名为：1为岩藻寡糖-1; 2为岩藻寡糖-2; 3为岩藻寡糖-3; 4为岩藻寡糖-4; 5为岩藻寡 糖-5; 6为岩藻寡糖-6; 7为岩藻寡糖-7。
【主权项】
1. 一种编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID Ν0·1〇2. 含有如权利要求1所述编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列的片段、质粒或者菌 株。3. 如权利要求1所述编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列编码的蛋白。4. 如权利要求3所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。5. 如权利要求1所述编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列在制备岩藻多糖糖苷水解 酶中的应用。6. 如权利要求2所述含有编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列的片段、质粒或者菌 株在制备岩藻多糖糖苷水解酶中的应用。7. 如权利要求3所述编码岩藻多糖糖苷水解酶的核苷酸序列编码的蛋白在制备岩藻多 糖糖苷水解酶中的应用。8. 如权利要求4所述氨基酸序列SEQ ID NO.2在制备岩藻多糖糖苷水解酶中的应用。
【文档编号】C12N9/24GK105821061SQ201610187324
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】林成彬, 李建军, 任立世, 王斌, 惠锋基
【申请人】山东洁晶集团股份有限公司