专利名称：水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株、其构建方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于酶的基因工程技术领域，特别是涉及水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株及其构建方法，以及将该菌株应用于水解大豆异黄酮糖苷的生产中。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，保健意识的增强，大豆异黄酮产品越来越受到人们的重视。大豆中含有的大豆异黄酮是一类重要的生理活性物质，具有较强的生理功能。迄今为止，已知大豆中的异黄酮共有12种异构体，其中3种为苷元的形式，9种为葡萄糖苷的形式。大豆异黄酮在大豆中含量仅有千分之五左右，而大豆异黄酮异构体中97％-98％是以结合型大豆异黄酮糖苷形式存在，游离型的苷元形式大豆异黄酮总量的2％-3％，但是人体一般不吸收大豆异黄酮的糖苷形式。大豆异黄酮糖苷在人的消化酶(特别β-葡萄糖苷酶)作用下水解成苷元形式，才能被吸收。研究证明，大豆异黄酮的生理活性主要是大豆异黄酮苷元的活性。大豆异黄酮糖苷的水解也成为科研工作者重点研究现状。大豆异黄酮糖苷在酸性或碱性条件下糖苷键可断裂，分解为大豆异黄酮苷元和葡萄糖，但碱性条件水解所得大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解。因此，目前人们多用酸水解手段制大豆异黄酮苷元。酸水解用酸主要是盐酸。多采用较浓的盐酸(如1-3mol·L-1)，较高的温度(98-100℃)酸水解的效率很高，可是有很多人对于酸性条件下大豆异黄酮苷元的稳定性表示怀疑。另外，强酸条件下不易进行工业化，而且还会带来工业污染。酶法水解糖苷便成了糖苷水解的重要手段，酶水解条件温和，多采用弱酸性的缓冲溶液，大豆异黄酮苷元不易变性，是工业上制备富含大豆异黄酮苷元的大豆异黄酮保健食品的十分有前途的途径。研究最多的大豆异黄酮糖苷水解酶就是β-葡萄糖苷酶，大豆自身含有的内源β-葡萄糖苷酶水解活性不强，水解效率只要22％-29％，添加足量的高活性酶可使水解达到100％。事实上研究研究发现，只要糖苷的水解程度达到70％，就能充分利用大豆异黄酮糖苷。因为人体内有少数的消化酶能水解部分糖苷。随着科技的发展，人们保健意识的增强，成本低、水解效果好、安全的水解酶成了研究的目标。但是现在大多的糖苷水解酶β-葡萄糖苷酶来自于曲霉类和酵母中，虽然具有很高的水解效率，但存在安全隐患。
发明内容
本发明目的是利用基因工程手段构建一种新的工程菌株，以求既能高效水解大豆异黄酮糖苷，又能解决活性水解酶来源的安全问题。
本发明的另一目的是提供该菌株的构建方法。
本发明的又一目的是提供该菌株的用途。
上述工程菌的代表菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCCNo.1619，保藏日2006年2月16日。
本发明所要解决的问题就是从产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌中选一株进行酶学性质研究，然后提取该菌株β-葡萄糖苷酶的基因组DNA，并将该基因亚克隆至pET 28a(+)载体中，最后在大肠杆菌中实现高效表达。
本发明的工程菌特征是，该菌株的染色体包含有效蛋白质种类β-葡萄糖苷酶基因组DNA序列表如下1atgactgaca ttaccacggc cggctctttg gaaagtccgc gttatctgac ttacactttg61 gatggcaagg atggcaaagt agctgggatg ttcgccagct ccttgccaaa gggcgctaag121 gggaagattt ttgacaatga atactacccg aaccatgtag cgatcgattt ttaccatcac181 tacaaggaag acatcaagat gttcgcggac atgggcttta aggtattcag aacttccatt241 gcctggacgc ggattttccc aaccggtgaa gaagacaagc caaaccagga agggctggac301 ttctaccgca gagtctttga agaattgaag aagaacggga ttgaaccatt agttacgatt361 tcccactatg aagacccatt ggctttaggc gaaaagtaca acgactggca agaccgcaag421 atgattgacc tctacgttaa gtacgcgacg accttgttca aggaatacaa ggacctggtt481 aagtactggc tgaccttcaa cgaaatcaac tcatctttga tgttcttgaa gctggtgggt541 gatggcaagg tatctgatgc agattaccaa aaggcttacc aaaagctgca ccaccaattc601 gttgcttccg ctaaggcagt tgttgcaggc cacaagatca acccagactt catgatcggg661 aacatgattg ccggttctgt ttactaccca ggcactcctg atccaaagga tgctttggct721 gctcgctatg aagaagaatt gagccagctt tactgtgctg acgcgcaagc taagggtgag781 tatccaagtt ttgccaagcg cttatgggat gaacacaatg ttcatttgaa gattgaagat841 ggcgaccttg aagtcatgaa ggaaggtaaa gttgacatgt acaccttctc atactacatg901 tcaaacatgg ttaccaccca tgatgttggc gaaaaggcta agggcaactt cgctgccggc961 gctaagaacc catatcttga atactctgaa tggggctggt caactgaccc agacggcttg1021 caactgtact tggaaaagat gtatgaccgt tatggcatcc caatgatggt ggtggaaaat1081 ggtcttggtg ccgttgataa gctagaagat ggtactgttc atgacgatta ccggattgac1141 tacttgagaa agcacatcaa ggcgatggac aaggcagttg aacatggggt tgacctgcgt1201 gcctacacga cttggggctg cattgactgc gtttctgctg gaactggtca aatgtccaag1261 cggtatggct tcatctacgt tgaccgtgat gacaagggcg aaggtacgct taagcgcctg1321 cctaaggatt catactactg gtaccaaaag gttatcgctt caaacggcga tgaattataa
β-葡萄糖苷酶基因组DNA序列推导的酶的氨基酸序列表1MTDITTAGSLESPRYLTYTLDGKDGKVAGMFASSLPKGAKGKIFDNEYYPNHVAIDFYHH61YKEDIKMFADMGFKVFRTSIAWTRIFPTGEEDKPNQEGLDFYRRVFEELKKNGIEPLVTI121SHYEDPLALGEKYNDWQDRKMIDLYVKYATTLFKEYKDLVKYWLTFNEINSSLMFLKLGD181GKVSDADYQKAYQKLHHQFVASAKAVVAGHKINPDFMIGNMIAGSVYYPGTPDPKDALAA241RYEEELSQLYCADAQAKGEYPSFAKRLWDEHNVHLKIEDGDLEVMKEGKVDMYTFSYYMS301NMVTTHDVGEKAKGNFAAGAKNPYLEYSEWGWSTDPDGLQLYLEKMYDRYGIPMMVVENG361LGAVDKLEDGTVHDDYRIDYLRKHIKAMDKAVEHGVDLRAYTTWGCIDCVSAGTGQMSKR421YGFIYVDRDDKGEGTLKRLPKDSYYWYQKVIASNGDEL本发明提供的一种高活性水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株的构建方法，采用以下技术方案来实现的，具有如下步骤首先是选用产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌；第二步是从选出的乳酸菌中扩增bgl A基因(β-葡萄糖苷酶基因)；第三步是根据实验要求设计引物；第四步从提供的乳酸菌中提取基因组DNA；第五步以基因组DNA为模板，BglA F/BglA R为引物，使用TaKaRa LA TaqTM(CodeNo.DRR002A)进行PCR扩增目的片段。再使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(Code No.DV805A)切胶回收PCR扩增片段，命名为CTA480-I；第六步使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，将CTA480-I与pMD18-T Simple载体(Code No.D103A)连接后，热转化至E.coli CompetentCells JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。挑选菌落，提取质粒后，命名CTA480-T-1、CTA480-T-2。
第七步将表达载体pET28a(+)用EcoR I/HindIII进行双酶切，使用TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收载体部分DNA，命名为VectorDNA；第八步将含BglA目的基因的CTA480-T-1质粒用EcoR I/HindIII进行双酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收约1.4kb的DNA片段，命名为Insert DNA；第九步使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，将Vector DNA和Insert DNA连接后，热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。挑选菌落，提取质粒后，质粒命名CTA480-P-1和CTA480-P-2；第十步将质粒CTA480-P-1和CTA480-P-2用EcoR I/HindIII分别进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳，质粒CTA480-P-2符合要求。
第十一步分别取CTA480-P-2及pET28a(+)质粒100ng转至100ul BL21(DE3)感受态细胞中，100ul涂平板，挑取单菌落接种，在进行主培养，集菌破碎，SDS-PAGE检测；第十二步纯化β-葡萄糖苷酶液，测定酶活。
经过酶活测定，新菌株的酶活是原菌株酶活的10倍。将该菌株应用于水解大豆异黄酮糖苷，糖苷水解率能达到80％以上，水解效果得到很大的改善。
根据上述方法所得到的工程菌，菌株在显微镜下呈短杆状。
本发明选用含有β-葡萄糖苷酶的乳酸菌进行培养，提取出葡萄糖苷酶的基因组DNA并对其进行PCR扩增、测序，把该基因亚克隆至T载体，最后克隆至表达载体，在大肠杆菌中进行表达，得到高活性水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株。本发明得到的工程菌酶活高，价格低，应用于水解大豆异黄酮糖苷，水解效果得到的改善，同时菌株来源具有良好的安全性，作为工程菌株水解糖苷在功能性食品应用中，具有广泛的应用前景和经济意义。
图1是从乳酸菌中提取基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表MDNA Marker DL2,0001基因组DNA图2是CTA480-I琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表MDNA Marker DL2,0001CTA480-I图3是质粒琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表1CTA480-T-1质粒2CTA480-T-2质粒Mλ-Hind III DNA Marker图4是Vector DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表Mλ-Hind III DNA Marker1Vector DNA图5是质粒CTA480-T-1、CTA480-T-2的构建过程；图6是Insert DNA琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表MDNA Marker DL2,0001Insert DNA图7是质粒琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表
Mλ-Hind III DNA Marker1CTA480-P-12CTA480-P-2图8是质粒CTA480-P-1和CTA480-P-2构建过程；图中的数字和字母分别代表图9是质粒CTA480-P-1和CTA480-P-2酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；图中的数字和字母分别代表M1λ-Hind III DNA Marker1CTA480-P-1 EcoR I/HindIII切2CTA480-P-2 EcoR I/HindIII切M2DNA Marker DL2,000图10是目的基因可溶性表达；图中的数字和字母分别代表M1protein MW marker(High)1pET28a(+)全细胞2pET28a(+)上清3pET28a(+)沉淀4CTA480-P-2全细胞5CTA480-P-2上清6CTA480-P-2沉淀M2protein MW marker(Low)0.1OD相当上样。
图11是纯化和酶活测，M1，M2 Mark标准蛋白，图中的数字分别代表1β-葡萄糖苷酶标准品2表达后的经过DEAE纯化的β-葡萄糖苷酶3经过葡聚糖G-200二次纯化的β-葡萄糖苷酶图12是40％的大豆异黄酮糖苷高效液相图；图13是40％的大豆异黄酮糖苷水解高效液相图；图14是40％的大豆异黄酮糖苷和水解高效液相重合效果图。
具体实施例方式
以下结合附图，对依据本发明提供的具体实施方式
、特征及功效，详细说明如后从筛选出的高产β-葡萄糖苷酶乳酸菌中扩增bgl A基因，并将该基因亚克隆至pET 28a(+)载体(载体为pET系列)中，并在大肠杆菌中实现表达。
1.根据实验要求设计并合成如下引物BglA F5′GAATTCATGACTGACATTACCACGGC 3′ (26mer)BglA R5′AAGCTTTTACGCTTTAATTTTATAA 3′ (26mer)CTA480 T-R5′TTAGCCTTTTCGCCAACATC 3′ (20mer)BglA f1 5′TTTGGCTGCTCGCTATGAAG 3′ (20mer)BglA r1 5′CTTCATAGCGAGCAGCCAAA 3′ (20mer)BglA r2 5′AATCATCTTGCGGTCTTGCC 3′ (20mer)2.使用DNAiso(DNA提取试剂)从乳酸菌中提取基因组DNA。取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果图1所示；3.以基因组DNA为模板，BglA F/BglA R为引物，使用TaKaRa LA TaqTM(CodeNo.DRR002A)进行PCR扩增目的片段。再使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification KitVer.2.0(Code No.DV805A)切胶回收PCR扩增片段，命名为CTA480-I。取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示；4.将CTA480-I用BglA R/BglA f1/BglA r1/BglA r2引物进行测序。
5.使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，将CTA480-I与pMD18-T Simple载体(Code No.D103A)连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。
6.挑选菌落，提取质粒后，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如下图3所示7.选取质粒CTA480-T-1、CTA480-T-2，构建过程如图5以BcaBEST Primer M13-47/BcaBEST Primer RV-M/CTA480T-R为引物进行DNA测序，质粒CTA480-T-1符合要求。
8.将表达载体pET28a(+)用EcoR I/HindIII进行双酶切，使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收载体部分DNA，命名为Vector DNA。取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示9.将含BglA目的基因的CTA480-T-1质粒用EcoR I/HindIII进行双酶切，使用TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)切胶回收约1.4kb的DNA片段，命名为Insert DNA。取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示10.使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)中的Ligation Mix，将VectorDNA和Insert DNA连接后，热转化至E.coli Competent Cell JM109(Code No.D9052)中，涂布平板过夜培养菌体。
11.挑选菌落，提取质粒后，取1μl进行琼脂糖凝胶电泳，结果图7所示12.将质粒CTA480-P-1和CTA480-P-2(构建过程如图8)用EcoR I/HindIII分别进行酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示；
13.分别取CTA480-P-2及pET28a(+)质粒100ng转至100ul BL21(DE3)感受态细胞中，100ul涂平板。
将转化的感受态细胞进行蓝白斑筛选，随机挑取4-6个白色单菌落接种含卡那酶素50ug/ml的LB培养液(具体成分1g胰蛋白胨、1g氯化钠、0.5g酵母浸出粉，加入100ml蒸馏水，PH＝7.2)，37℃过夜震荡培养；将活化的种子菌以5％-8％的比例接种于LB培养基中，37℃扩大培养。培养至对数生长期(OD600为0.6-0.8)加IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导培养2-4小时，6000-8000r/min离心10-15min，收集菌体。取样加入1×SDS上样缓冲液，按照常规方法进行SDS-PAGE检测。目的基因可溶性表达如图10，检测结果如下
实验结果发现菌体中有大量的蛋白存在，说明菌株构建成功。
14.进行纯化和酶活测定经过酶活测定新构建的菌株的酶活为34U，是原菌株酶活的10倍，酶活检测方法如下a.采用染料木苷为底物的酶活测定用染料木苷为底物，染料木素为产物的相对酶活力测定方法取0.1ml的底物溶液(用0.02mol/L，pH5.0HAVc-NaAc缓冲液将染料木苷配成浓度为15mg/ml)，加入0.1ml的粗酶液，混匀，40℃下反应适当时间后，加入2倍体积的乙酸乙酯萃取1h，萃取取物10ul作薄层层析(TLC)。薄层层析板在使用前需在110℃活化30-60min，展开剂为氯仿∶丁酮∶甲醇∶水(10∶7∶1∶1)，展开约6cm，挥干溶剂，用双波长薄层扫描仪扫描，根据斑点面积的积分值计算酶活力。酶活力单位的定义是在上述测定条件下，每小时释放1nmol染料木素的酶量为一个酶活力单位(U)。
b.以pNPG为底物的酶活测定取0.4ml 1mM的pNPG(用0.02mol/L，Ph5.0的醋酸缓冲液配制)，于40℃下预热5min，加入0.1ml的酶液，反应30min，向反应液加入2.5ml 1mol/L的NaCO3溶液，于405nm波长下测OD值。酶活力定义为在上述条件下，每小时水解底物所产生1umol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。
c.以人参皂苷Rd为底物的酶活力测定取0.1ml的底物溶液(用0.02mol/L，pH5.0 HAc-NaAc缓冲液将Rd配成浓度10mg/ml)，加入0.1ml的酶液，混匀，40℃下反应适当时间后，向反应体系中加入2倍体积的水饱和正丁醇萃取1h，取萃取相10ul作薄层层析(TLC)。薄层层析板在使用前需在110℃活化30-60分钟，展开剂为氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5)，展开约6cm，挥干溶剂，喷洒10％硫酸加热显色。用双波长薄层扫描仪扫描，根据斑点面积的积分值计算酶活力。酶活力单位定义是在上述测定条件下，每小时释放1nmol人参皂苷产物的酶量，定义为一个酶活力单位。
d.以水杨素为底物的酶活测定取1.0ml 0.05mol/L pH5.0醋酸缓冲液配制的1.0％水杨素，加入1.0ml已纯化的酶液，50℃反应30min，加入2.5mlDNS试剂后100℃水浴5min，冷却到室温后用去离子水定容到5.0ml，测定OD530，以每毫升酶溶液，在上述条件下30min内酶解水杨素产生1mg葡萄糖为一个酶活力单位。
水解糖苷效果验证如图11所示提取大豆异黄酮产品，含量大约为40％。进行酶法水解实验将酶液和底物溶液按照1∶1体积混合，是底物浓度为10mg/ml，混匀，50℃水浴摇床反应1.5h，然后用2倍体积的乙酸己脂萃取，萃取物浓缩蒸干，用HPLC检测。酶解效果见图12、13、14。
水解糖苷结果发现大豆异黄酮糖苷在没有水解以前，糖苷含量占总糖苷的90％以上，甘元的含量很少，但是在水解以后苷元的含量占总糖苷的80％以上，达到的对糖苷的水解要求。
权利要求
1.一种水解大豆异黄酮糖苷工程菌，其特征在于菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的保藏编号CGMCCNo.1619。
2.如权利要求1所述的一种水解大豆异黄酮糖苷工程菌，其特征在于该菌株的染色体含有有效蛋白质种类β-葡萄糖苷酶基因组DNA序列表如下1 atgactgaca ttaccacggc cggctctttg gaaagtccgc gttatctgac ttacactttg61 gatggcaagg atggcaaagt agctgggatg ttcgccagct ccttgccaaa gggcgctaag121 gggaagattt ttgacaatga atactacccg aaccatgtag cgatcgattt ttaccatcac181 tacaaggaag acatcaagat gttcgcggac atgggcttta aggtattcag aacttccatt241 gcctggacgc ggattttccc aaccggtgaa gaagacaagc caaaccagga agggctggac301 ttctaccgca gagtctttga agaattgaag aagaacggga ttgaaccatt agttacgatt361 tcccactatg aagacccatt ggctttaggc gaaaagtaca acgactggca agaccgcaag421 atgattgacc tctacgttaa gtacgcgacg accttgttca aggaatacaa ggacctggtt481 aagtactggc tgaccttcaa cgaaatcaac tcatctttga tgttcttgaa gctggtgggt541 gatggcaagg tatctgatgc agattaccaa aaggcttacc aaaagctgca ccaccaattc601 gttgcttccg ctaaggcagt tgttgcaggc cacaagatca acccagactt catgatcggg661 aacatgattg ccggttctgt ttactaccca ggcactcctg atccaaagga tgctttggct721 gctcgctatg aagaagaatt gagccagctt tactgtgctg acgcgcaagc taagggtgag781 tatccaagtt ttgccaagcg cttatgggat gaacacaatg ttcatttgaa gattgaagat841 ggcgaccttg aagtcatgaa ggaaggtaaa gttgacatgt acaccttctc atactacatg901 tcaaacatgg ttaccaccca tgatgttggc gaaaaggcta agggcaactt cgctgccggc961 gctaagaacc catatcttga atactctgaa tggggctggt caactgaccc agacggcttg1021 caactgtact tggaaaagat gtatgaccgt tatggcatcc caatgatggt ggtggaaaat1081 ggtcttggtg ccgttgataa gctagaagat ggtactgttc atgacgatta ccggattgac1141 tacttgagaa agcacatcaa ggcgatggac aaggcagttg aacatggggt tgacctgcgt1201 gcctacacga cttggggctg cattgactgc gtttctgctg gaactggtca aatgtccaag1261 cggtatggct tcatctacgt tgaccgtgat gacaagggcg aaggtacgct taagcgcctg1321 cctaaggatt catactactg gtaccaaaag gttatcgctt caaacggcga tgaattataa。
3.权利要求1所述的工程菌株的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤提取该菌株β-葡萄糖苷酶的基因组DNA，并将该基因作为目的基因，通过PCR扩增后亚克隆至T载体之中，最后在克隆到大肠杆菌表达载体之中，获得目的菌株。
4.权利要求1所述的工程菌株的用途，其特征在于将该菌株用于水解大豆异黄酮糖苷。
全文摘要
本发明属于酶的基因工程技术领域，特别是涉及水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株及其构建方法，以及将该菌株应用于水解大豆异黄酮糖苷的生产中。本发明选用含有β－葡萄糖苷酶的乳酸菌进行培养，提取出葡萄糖苷酶的基因组DNA并对其进行PCR扩增、测序，把该基因亚克隆至T载体，最后克隆至表达载体，在大肠杆菌中进行表达，得到高活性水解大豆异黄酮糖苷酶工程菌株。本发明得到的工程菌酶活性高，价格低，应用于水解大豆异黄酮糖苷，水解效果得到改善，同时菌株来源具有良好的安全性，作为工程菌株水解糖苷在功能性食品应用中，具有广泛的应用前景和经济意义。
文档编号C12P17/06GK1944634SQ20061004599
公开日2007年4月11日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者刘长江, 李长彪, 张春红, 赵秀红, 孟宪文, 高荣海 申请人:沈阳农业大学