氧化水解酶基因BtLPMO10A及氧化水解酶与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种新型氧化水解酶化LPM010A的基因序列（来源于苏云金芽抱杆菌 库斯塔克亚种ACCC 10066)及其编码的氧化水解酶的制备方法和应用（Pr巧aration and application of a novel lytic polysaccharide monooxygenase)。本发明还提供了该氧 化水解酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明设及的氧化水解酶化LPMOIOA可应用在 生物能源、绿色农业、健康食品及生物医药等领域。
【背景技术】
[0002] 几下质是一种主要来源于海洋邮蟹壳、昆虫外壳等的等难溶性天然多糖，几下质 的高效生物降解在生物能源、绿色农业、生物医药、材料化工等领域具有重要的意义。目前 可用于几下质生物降解的酶主要为糖巧水解酶，从其催化反应模式上又可分为=类：内切 型糖巧水解酶、外切型糖巧水解酶、二糖水解酶。到目前为止，已有大量的关于运些糖巧水 解酶的报道，然而由于运些难溶性天然多糖的晶体结构难W被破坏，致使糖巧水解酶的催 化效率较低。2010年挪威生命科学大学的团队首次报道了一种来自粘质沙雷氏菌的几下质 氧化水解酶（SmCBP21)，该酶可催化位于几下质糖链Cl位上的氧化反应，生成具有不同聚 合度的糖酸，该酶可W通过氧化破坏几下质表面的晶体结构，辅助几下质酶高效降解几下 质。对于该类酶的新发现和深入研究对于实现几下质等多糖物质的生物转化具有重要的意 义。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的是提供一种新型氧化水解酶化LPM010A及其编码基因。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种制备新型氧化水解酶化LPM010A的方法。 阳0化]本发明的第S个目的是提供含有所述的新型氧化水解酶化LPM010A基因的基因 工程表达体系。
[0006] 本发明的第四个目的是提供新型氧化水解酶化LPM010A在多糖降解中的应用。
[0007] 本发明所提供的新型氧化水解酶化LPM010A，来源于苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚 种菌株（购于中国农业微生物菌种保藏管理中屯、，编号为ACCC 10066)，其氨基酸序列具有 如下特征之一：
[0008] 1)序列表SEQ ID NO. 2中的氨基酸残基序列；
[0009] 2)将序列表SEQ ID NO. 2中的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加后，具有降解多糖活性的蛋白质；
[0010] 3)与序列表SEQ ID NO. 2中所限定的氨基酸序列的同源性达到90%及W上且具 有降解多糖活性的蛋白质。
[0011] 本发明还提供了新型氧化水解酶化LPM010A的编码基因（命名为化LPM010A)，具 有下述核巧酸序列特征之一： 阳01引 1)具有序列表中SEQ ID NO. 1的脱氧核糖核酸值NA)序列；
[0013] 2)编码SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脱氧核糖核酸值NA)序列；
[0014] 扣具有与序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脱氧核糖核酸值NA)序列的同源性达到 90%及W上，且能编码降解多糖的蛋白质的脱氧核糖核酸值NA)序列。
[0015] 本发明的氧化水解酶化LPM010A的氨基酸序列及其核巧酸编码序列也可W根据 预测的化LPM010A的氨基酸序列及其核巧酸编码序列人工合成获得。
[0016] 制备重组酶化LPM010A的方法，是将编码基因化LPM010A克隆入重组表达载体，导 入宿主细胞，获得重组表达的氧化水解酶。
[0017] 所述的重组表达氧化水解酶化LPM010A的表达载体可W是大肠杆菌表达载体、酵 母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、隧菌体载体、丝状真菌 表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。
[0018] 用于重组表达氧化水解酶化LPM010A的重组菌或转基因细胞系，可W是大肠 杆菌宿主细胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli D册 a 等）、酵母菌宿主细胞（如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces Iactis 等）、枯草杆菌宿主细胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主细胞（如 Lactic acid bacteria COCCIOI 等）、放线菌 宿主细胞（如Streptomyces spp.等）、丝状真菌宿主细胞（如I'richoderma viride、 Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆虫细胞（女日 Bombyx mo;ri、Antharaea eucalypti等）或哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小 仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等）。
[0019] 本发明提供的氧化水解酶化LPM010A对于几下质具有较强的结合能力，可氧化水 解几下质等多糖物质，可辅助多糖水解酶提高多糖的降解效率。
[0020] 本发明提供的氧化水解酶化LPM010A可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加和 医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。
【附图说明】
[0021] 图1 :氧化水解酶化LPM010A的蛋白表达及纯化的聚丙締酷胺凝胶电泳图 (SDS-PAGE)。各泳道加入的样品分别是：泳道M :蛋白质标识物（marker);泳道1 :发酵液上 清，上样量10 y 1，泳道2 :5 y g纯化后的化LPM010A。
[0022] 图2 :氧化水解酶化LPM010A的底物结合实验。a为上清中未与底物结合的蛋白，电 泳实验的上样量为10yL;b为沉淀中与底物结合的蛋白。CK，对照度tLPMOlOA+缓冲液）； 1，化LPM010A+a -几下质粉末；2, BtLPMOlOA+0 -几下质粉末；3, BtLPMOlOA+微晶纤维素； 4,化LPMOIOA+a -胶体几下质；5, BtLPMOlOA+几下质珠。
[0023] 图3 :氧化水解酶化LPM010A的酶解产物分析。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚种的培养及其基因组DNA的提取
[00巧]苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚种菌株（购于中国农业微生物菌种保藏管理中屯、，编 号为ACCC 10066)的单克隆接种到IOml液体LB培养基中，接着放入溫度为30°C，转数为 15化pm的摇床培养16个小时，取3ml菌液，离屯、收集菌体，用于基因组DNA的提取。基因组 DM的提取与纯化方法按照试剂盒说明书操作完成。
[0026] 实施例沈tLPMOlOA基因在大肠杆菌中的重组表达
[0027] W苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚种ACCC 10066基因组DNA为模板，用下述引物对进 行PCR扩增。引物设计如下：
[0028] IES 引f勿 P-F :5，一C邑Ct邑ccca邑CC邑邑C邑at邑邑cccat邑邑atat邑ta邑aatcacca邑C邑_3，；
[0029] 反向引物 P-R :5, -gctttgttagcagccggatctcaaaatagtgtaggagtttgcatacg-3，；聚 合酶PrimeSTAR购自宝生物公司，PCR反应体系按照公司提供的产品说明操作。PCR反应条 件：94°C预变性5分钟，然后94°C变性30sec-50°C退火30sec-72°C延伸lmin，30个循环， 最后72°C延伸lOmin。PCR反应结束后将PCR产物作为引物，W祀T2化质粒作为载体，按照 上述PCR扩增条件进行二次PCR扩增，所得PCR产物利用化nl进行过夜处理，并进行琼脂 糖凝胶电泳和DNA测序验证。
[0030] 验证成功的带有目的基因的载体电转至大肠杆菌ToplO中，37°C培养12h，挑取单 克隆；将单克隆接入含有50 Ji g/ml氨节西林的液体Luria-Bertani培养基中培养，提取质 粒；将质粒用正向引物和反向引物进行菌落PCR验证，结果得到大小正确的扩增产物，初步 证明构建的重组质粒正确；接着将该重组质粒送去大连宝生物工程有限公司测序，结果表 明，在祀T-22b的信号肤末端和终止密码子之间插入SEQ ID NOl所示的化LPM010A基因， 且插入方向正确，所W进一步证明构建的重组质粒正确。
[0031] 将上述重组质粒转化大肠杆菌菌株化21 0E3)(购自美国Novagen公司），然后按 照该公司提供的操作步骤进行氧化水解酶化LPM010A的诱导表达及纯化，结果如图1所示， 氧化水解酶化LPM010B的表达成功，且主要W可溶的形式分布于周质空间中，经过几下质 亲和层析纯化后的氧化水解酶化LPM010A在电泳胶上呈单一条带，分子量大小为19kDa，与 通过氨基酸序列预测的分子量一致。
[0032] (1) SEQ ID No: 1的信息（参见序列表） 阳〇3引 （a)序列特征
[0034] *长度：561个碱基对 齡35] *类型：核酸
[0036] *链型：双链
[0037] *拓扑结构：线性
[0038] 化）分子类型：DNA
[0039] (C)假设杏
[0040] (d)反义杏
[0041] (e)最初来源：苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚种菌株ACCC 10066
[0042] (f)与核巧酸序列相关的特征关键词：为"氧化水解酶" 阳0创 似SEQ ID NO 2:的信息（参见序列表） 柳44] (a)序列特征：
[0045] *长度：187个氨基酸残基 阳046] *类型：蛋白
[0047] *结构：包含1个AAlO家族氧化水解酶结构域 W48] 化）分子类型：蛋白质
[0049] (C)假设杏
[0050] (d)反义杏
[0051] (e)最初来源：苏云金芽抱杆菌库斯塔克亚种菌株ACCC 10066 阳0巧 序列表
[0053]沈Q ID NO. 1
[0057] 实施例3氧化水解酶化LPMOIOB的生化特性分析
[0058] (1)多糖结合能力分析
[0059] 氧化水解酶化LPM010A与各种多糖的结合实验按W下条件进行：在1. 5ml的 Eppendcxrf管中将5mg各种不同多糖与0. 5mg纯化后的氧化水解酶化LPM010A混合，反应 终体积通过20mM、抑8. 0的化is-HCl缓冲液定容为1ml。酶与底物的结合在室溫下进行 24小时，为了让酶与多糖更好的结合，利用畑-II旋转混合仪（宁波新芝公司）。结束后， 通过离屯、分别收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE电泳检测。结果如图2所示，氧化水解酶 化LPM010A与晶体性质的几下质（a -几下质和0 -几下质）具有较强的结合能力，而与晶 体几下质（几下质珠和胶体几下质）结合能力较弱，与微晶纤维素的结合能力几乎无法观 测到。
[0060] (2)酶反应产物分析 阳061] 为了分析酶反应产物，将氧化水解酶化LPMOIOAQ y M)，抗坏血酸（ImM)和0 -几 下质（2. Omg/ml)混合在一起，反应总体积通过抑8. 0,20mM化is-肥1缓冲液定容为1ml。 反应在30°C进行2地。产物通过MLTI T0F/T0F MS进行分析（如图3)。结果表明氧化水 解酶化LPM010A能氧化水解晶体几下质，产生聚合度为4-10的几下寡糖糖酸，且偶数聚合 度的糖酸呈现优势分布。
【主权项】
1. 一种氧化水解酶基因 BtLPMOlOA，其核苷酸序列具有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 1的脱氧核糖核酸（DNA)序列； 2) 编码SEQ ID NO. 2氨基酸序列的脱氧核糖核酸（DNA)序列； 3) 具有与序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脱氧核糖核酸（DNA)序列的同源性达到90% 及以上，且能编码降解多糖的蛋白质的脱氧核糖核酸（DNA)序列。2. -种权利要求1所述的氧化水解酶基因编码的氧化水解酶，其编码的氨基酸序列具 有如下特征之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸序列； 2) 将序列表中的SEQ ID NO. 2的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加后，具有降解多糖活性的蛋白质； 3) 与序列表中SEQ ID NO. 2所限定的氨基酸序列的同源性达到90%及以上且具有氧 化水解多糖活性的蛋白质。3. -种权利要求2所述的氧化水解酶的制备方法，其特征在于：是将权利要求1所述 的氧化水解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的氧化水解酶； 所述的重组表达氧化水解酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草 杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表 达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体。4. 按照权利要求3所述的方法，其特征在于：用于重组表达氧化水解酶的重组菌或转 基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞（如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM 109、Escherichia coli DH5a 等）、酵母菌宿主细胞（如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等）、枯草杆菌宿主细胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主细胞（如 Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放线菌宿主细胞（如Streptomyces spp.等）、丝状真菌宿主细胞（如Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆虫细胞 (如Bombyx mori、Antharaea eucalypti等），哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞CHO， 幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等）中的一种。5. -种权利要求2所述的氧化水解酶在多糖氧化水解中的应用，其特征在于：具有如 下用途之一或二种以上； 1) 氧化水解几丁质、壳聚糖、纤维素、半纤维素、淀粉等多糖物质中的一种或二种以上， 可用于功能性寡糖产品的生产或生物质转化生产燃料乙醇； 2) 通过氧化水解真菌细胞壁多糖的方式抑制真菌病害，可用于生物农药或生物医药的 制备； 3) 根据其强大的多糖结合能力，可作为多糖类物质的识别分子。
【专利摘要】本发明公开了一种氧化水解酶基因及其编码的氧化水解酶的制备与应用。本发明所涉及的氧化水解酶BtLPMO10A基因来源于苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(ACCC 10066)。本发明还提供了一种制备氧化水解酶BtLPMO10A的方法，即利用基因工程的技术方法，将该酶的基因克隆到大肠杆菌表达载体上，获得可表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该工程菌株表达制备的氧化水解酶BtLPMO10A对不溶性几丁质具有较强的结合能力，可氧化水解多糖物质产生具有不同聚合度的糖酸。本发明提供的氧化水解酶BtLPMO10A可辅助多糖水解酶，提高多糖的水解效率。
【IPC分类】C12N15/53, C12P19/14, A01P3/00, A01N63/02, C12N15/70, C12N9/02
【公开号】CN105713912
【申请号】CN201410719898
【发明人】赵勇, 尹恒, 王文霞, 张卉妍
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所