一种检测人类cox-2基因多态性的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，特别设及一种检测人 类C0X-2基因多态性的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 环氧化物水解酶(cyclo-0巧gen-ase，C0X)，是前列腺素(PGs)合成所必须的酶，也 是PGs合成初始步骤中的关键性限速酶。C0X有两种同工酶C0X-1和C0X-2。人体C0X-2基因定 位于染色体的lq25.2~q25.3区，长度约8.3kb，包含10个外显子和9个内含子，共编码604个 氨基酸。在5^端转录起始点上游有一些转录调控序列，包括2个核转录因子-KB(nuclear facto;r-KB，NF-KB)位点、2个激活蛋白质-(2activator po;rtein-2，AP-2)位点、TATA box序 列、cAMP反应元件（cAMPresponsive element，CRE)、CCAAT增强子结合蛋白位点（CCAAT/ enhancer binding protein，C/邸P)、Ets-l转录因子位点等。COX-2几乎在所有组织中有表 达，主要分布于细胞核膜上，其表达调控主要集中在转录水平。诱导其表达的因素包括癌基 因、白细胞介素-1、缺氧、紫外线、转化生长因子和肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis f actor-α，TNF-α)等，而地塞米松、抗氧化剂、抑癌蛋白P53等则可抑制其表达。因此，COX-2 基因多态性改变可能潜在地影响某种因子的结合，改变基因的转录活性，进而影响环氧化 酶的表达。通过对C0X-2基因多态性的检测可为个体对某些疾病(如癌症等）的易感性诊断 提供帮助
[0003] 在本发明作出之前，目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为基因测 序法。基因测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备 和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因忍片法具有快速高通量的 优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。W限制性酶切片段长度多态性(RFLP) 检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制一种检测人类C0X-2基因多态性的试剂 盒及其应用。
[0005] 本发明的技术方案是：
[0006] -种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其主要 技术特征在于:所述盒体内的物质包括检测C0X-2基因上的rs20417号SNP位点的特异性引 物及特异性巧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCb溶液、巧光定量PCR反应缓冲液和 去离子水；
[0007] 所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：
[000引 正义引物：5 ' -CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3 '，
[0009] 反义引物：5 ' -TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3 ' ；
[0010] 所述特异性巧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：
[0011] 野生型探针：5 ' -FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3 '
[0012] 突变型探针：5 ' -HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3 '。
[0013] 所述盒体中各物质的含量为:浓度为ΙΟμΜ的特异性引物共0.45μ1，其中正义引物 和反义引物各0.22扣1;浓度为扣Μ的特异性巧光探针共0.化1，其中野生型探针和突变型探 针各0.化1;浓度为5单位/μ1的化q DNA聚合酶0.02μ1;浓度为20mM的dNTP混合液0.化1;浓 度为25mM的MgC12溶液0.化1; 5X巧光定量PCR反应缓冲液化1;去离子水4.73μ1。
[0014] 所述特异性引物中，正义引物的Tm值为58.6°C，反义引物的Tm值为58.5°C;所述特 异性巧光探针中，野生型探针的化值为67Γ，突变型探针的化值为66Γ。
[0015] 所述试剂盒的保存溫度为-2(TC。
[0016] 本发明的另一技术方案是：
[0017] -种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒的应用，其主要技术物征在于:所述试剂 盒用于检测C0X-2基因上的rs20417号SNP位点的基因型。
[0018] 本发明与现有技术相比，优点在于检测准确性高、检测简单方便、检测时间短、结 果分析简单的优点，适合临床实验室使用：
[0019] (1)利用本发明试剂盒能够对C0X-2基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点 进行PCR巧光扩增反应，只需根据两种不同的巧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产 生人为误差，假阳性和假阴性率低，提高效率降低检测成本。
[0020] (2)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完 成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染，提高检测效率和准确度，缩短检测 时间。
[0021] (3)本发明试剂盒所使用的巧光检测探针为Taqman探针，该探针费用低廉；同时本 发明所有的反应全程闭管操作，PCR反应后不需要进行PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交等，在 节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了 PCR产物污 染引起假阳性的风险。
【附图说明】
[0022] 图1--C0X-2基因上的rs20417号SNP位点-纯合野生型扩增曲线示意图。
[0023] 图2--C0X-2基因上的rs20417号SNP位点-杂合型扩增曲线示意图。
[0024] 图3--C0X-2基因上的rs20417号SNP位点-纯合突变型扩增曲线示意图。
【具体实施方式】
[0025] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在W本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0026] -种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，试剂盒中包括W下C0X-2基因上的 rs20417号SNP位点的扩增特异性引物1对及2条特异性巧光探针。
[0027] 用于C0X-2基因上的rs20417号SNP位点检测的特异性引物中的正义引物和反义引 物的序列为：
[002引正义引物：5 ' -CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3 '，
[00巧]反义引物：5 ' -TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3 ' ；
[0030] 所述特异性巧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：
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