0031] 野生型探针：5 ' -FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3 '
[0032] 突变型探针：5' -HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3'。
[0033] 所述的一种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，还包括化qDNA聚合酶、dNTP混合 液、MgCl2溶液、巧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。
[0034] 所述的野生型特异性巧光探针为化qman探针，该探针5'端的巧光基团为FAM，3'端 的泽灭基团为MGB。
[0035] 所述的突变型特异性巧光探针为化qman探针，该探针5 '端的巧光基团为肥X，3 '端 的泽灭基团为MGB。
[0036] 试剂盒组成
[0037] 试剂盒的配置成份配合配置，使用时仅需加入样本即可完成实验配置，此种配置 更为方便快捷，为优选配置。
[0038] 配合反应液成份组成：
[0039]
[0040] 使用试剂盒的操作步骤
[0041 ]步骤1:全血细胞裂解液的制备
[0042] 取受检者外周静脉血30化1，加入70化1细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离屯、1 分钟，倒去上清，并将离屯、管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加入30化 1双蒸水，满旋震荡混匀成细胞裂解悬液。
[0043] 步骤2:巧光定量PCR反应
[0044] 巧光定量PCR反应体系总体积为10μ1，包括:浓度为20ngAil的细胞裂解悬液化1、 浓度为lOliM的特异性引物共0.45μ1，其中正义引物和反义引物各0.22化1;浓度为扣Μ的特 异性巧光探针共0.化1，其中野生型探针和突变型探针各0.化1;浓度为5单位/μ1的化q DNA 聚合酶0.02μ1;浓度为20mM的dNTP混合液0.化1;浓度为25mM的MgC12溶液0.化1; 5X巧光定 量PCR反应缓冲液化1;去离子水4.73μ1。
[0045] 在ΑΒΙ 7500型巧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为：50°C下2min，95°C下 lOmin，再进行40~55个PCR循环(92°C下15s，58°C下Imin)，反应结束后在ABI 7900HT型巧 光定量PCR仪读取巧光量。
[0046] 步骤3:基因型分析及确定基因型
[0047]采用ABI 7500型巧光定量PCR仪自带软件SDS(Sequence Detection Systems) V2.0,根据检测反应管中的FAM巧光和皿X巧光PCR曲线，判断COX-2基因上的rs20417号SNP 位点的分型，分型的具体依据见下表。
[004引 C0X-2基因上的rs20417号SNP位点分型依据
[0049]
[0050] 如图1所示，巧光定量PCR扩增曲线仅FAM巧光起线，皿X巧光不起线，为C0X-2基因 上的rs20417号SNP位点纯合野生型。
[00引]如图2所示，巧光定量PCR扩增曲线FAM和皿X 2条巧光都起线，为C0X-2基因上的 rs20417号SNP位点杂合型。
[0052] 如图3所示，巧光定量PCR扩增曲线仅仅皿X巧光起线，FAM巧光不起线，为C0X-2基 因上的rs20417号SNP位点纯合突变型。
[0053] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其它不同形式的变化或 变动。运里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变 动仍处于本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在 于:所述盒体内的物质包括检测C0X-2基因上的rs20417号SNP位点的特异性引物及特异性 荧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水； 所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为： 正义引物：5 ' -CAGAAGAAATACTGTTCTCCGTACC-3 '， 反义引物:5 ' -TCCATCAGAAGGCAGGAAACT-3 ' ； 所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为： 野生型探针：5 ' -FAM-TTTCCCGCCTCTCT-MGB-3 ' 突变型探针：5 ' -HEX-TTTCCCCCCTCTCT-MGB-3 '。2. 如权利要求1所述的一种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，其特征在于:所述盒 体中各物质的含量为：浓度为1〇μΜ的特异性引物共0.45μ1，其中正义引物和反义引物各 0.225μ1;浓度为5μΜ的特异性荧光探针共0.2μ1，其中野生型探针和突变型探针各0. ΙμL;浓 度为5单位/μL的Taq DNA聚合酶0.02μ1;浓度为20mM的dNTP混合液0 . ΙμL;浓度为25mM的 MgC12溶液0.5μ1; 5X荧光定量PCR反应缓冲液2μ1;去离子水4.73μ1。3. 如权利要求1所述的一种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，其特征在于:所述特 异性引物中，正义引物的Tm值为58.6°C，反义引物的Tm值为58.5°C ;所述特异性荧光探针 中，野生型探针的Tm值为67°C，突变型探针的Tm值为66°C。4. 如权利要求1所述的一种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒，其特征在于:所述试 剂盒的保存温度为-20 °C。5. -种检测人类C0X-2基因多态性的试剂盒的应用，其特征在于:所述试剂盒用于检测 C0X-2基因上rs20417号SNP位点的基因型。
【专利摘要】本发明涉及一种检测人类COX-2基因多态性的试剂盒及其应用。本发明盒体内的物质包括检测COX-2基因上的rs20417号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq？DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。本发明克服了基因突变检测的多种方法各自存在的缺陷。本发明检测准确性高、检测简单方便、检测时间短、结果分析简单的优点，适合临床实验室使用，能够对COX-2基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行PCR荧光扩增反应，只需根据两种不同的荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，提高效率降低检测成本，无需DNA提取，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105671036
【申请号】
【发明人】徐运, 邵渊, 张希根
【申请人】南京仁天生物科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年9月10日