用于肉制品中鸭源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量pcr方法及其引物和锁核酸探 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物源性成分鉴定技术领域，具体设及用锁核酸探针巧光定量PCR检 测肉制品中鸭源性成分的方法及其引物和锁核酸探针序列。
【背景技术】
[0002] 由于肉价差巨大，利益的诱惑导致肉类食品"渗假使假"事件频发，2013年的欧洲 马肉丑闻席卷了瑞典、英国、法国、爱尔兰、荷兰、罗马尼亚等多个国家，引起了各国人民的 不安与愤懸，也引起了各国政府的重视而纷纷开展肉食品"渗假使假"调查。BALLIN等对近 千种肉制品的检测发现，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符现象。2013年上海市食 安办在查处问题羊肉时意外发现猪肉鸭肉渗假。山东鄂城警方捣毁一处生产加工伪劣牛羊 肉卷的窝点时发现"肥牛"实为牛肉加牛脂肪再加鸭肉做成，"黑排"是羊肉和鸭肉的混合 产品，而鸭肉的渗杂比例最高达70%。2014年羊城晚报委托某机构对珠海部分农贸市场出售 的"肥羊"进行检测，结果显示送检的7份产品全部设嫌渗假，除了羊肉，运些产品还渗杂了 牛肉、鸭肉和马肉。因此，打击肉制品渗假成为近年来我国肉制品监管的重点，而打击肉制 品渗假首先需要对肉制品的肉种成分进行快速鉴别。
[0003] 对肉制品的肉种成分鉴别主要基于对动物源性成分的鉴别。虽然动物源性成分的 鉴别方法很多，但W检测DNA为基础的分子生物学方法，尤其是PCR技术W稳定、准确、快速 等优势而得到广泛的应用。然而，食品中DNA成分复杂，加之PCR技术的高灵敏度，使得应用 PCR方法来鉴别物种存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，WPCR为基础，应 用改良的引物探针设计策略已逐步成为肉类鉴别的新方向。
[0004] 锁核酸探针巧光探针是在化qman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰 成LNA碱基，而每增加一个单体LNA分子可提升Tm值3-8°C，还可通过调整LNA碱基在探针中 的位置来调节最佳Tm值和锁核酸探针杂交的特异性，从而增加探针的稳定性、特异性和设 计的灵活性。目前，锁核酸探针巧光定量PCR已在病原检测、基因突变检测等方面得到广泛 应用。本研究利用锁核酸探针巧光探针的上述优点，建立肉制品中鸭源性成分的锁核酸探 针巧光定量PCR检测方法，为动物源性成分的检测提供了新的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种用于肉制品中鸭源性成分快速鉴别的锁核酸探针巧光 定量PCR方法及其引物和锁核酸探针序列。包括： (1)所述的引物和锁核酸探针的序列： 上游引物：5 ' -ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3 ' ； 下游引物：5 ' GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3 ' ； 锁核酸探针： 5 '-CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ3-3 ' (2)采用步骤（1)设计的引物和探针建立鸭源性成分的锁核酸探针巧光PCR检测方 法。其特征在于：巧光PCR检测的反应体系为：2化L，包括10化Probes Master 2Xconc ( 包含有dNTP，Mg2+ W及化q酶等），步骤（1)设计的10ymol/L上下游引物F/R各0.祉L，10y mol/L Taqman-LNA探针P 0.3化，0魁模板化L，超纯水补至20化。反应参数：95°C8min;95 °C，8s，58°C，25s(采集巧光信号），35~40循环。
[0006] 基于本发明建立的锁核酸探针巧光PCR检测方法，按下列步骤进行： 1)样品的制备与DNA模板的提取： 取上述样品化g，剪碎后，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50化于1.5mL离屯、管内，按 组织核酸提取(离屯、柱法)试剂盒使用说明操作，提取DNA备检。
[0007] 2)将试剂从冰箱取出后，置室溫融化，8000 rpm离屯、lOsec。根据样品数按下表计 算试剂用量。
[0008] ~n=l (阴性对照)+1 (阳性对照)+样品数+损耗数 ' ' ' 将上述Probes Master 2Xconc.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入1.5mL离屯、 管中，混匀后，8000巧m离屯、lOsec。向设定的反应孔加入19化/孔。
[0009] 3)加样:将鸭肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别 加入样品反应孔，?μL孔。用反应膜封住反应孔，置于巧光定量PCR仪上检测。
[0010] 4)反应参数设置:95°C8min;95°C，8s，58°C，25s(采集巧光信号），35~40循环。
[0011] 5)结果判断： (1)质控标准 一一阴性对照:无 Ct值或Ct值>30,且无典型扩增曲线； 一一阳性对照：Ct含20，且扩增曲线明显呈对数增长。
[0012] 阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
[OOU] (2)判定和报告：样品无 Ct值，或Ct(棉。。)>30,或let(棉。η)- Ct脚I? I >7,且样品无明 显扩增曲线的，判为阴性，报告样品不含鸭源性成分。
[0014] let(棉。。)-ct咖电I且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性，报告样品渗有 鸭源性成分。
[001引let猫a)- ct獅电|>7，ct猫a)<30,且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为假阳性， 报告样品污染鸭源性成分。
[0016] 本发明的优点为： 1.本发明提供的引物和锁核酸探针具有良好的检测灵敏度和特异性。
[0017] 2.本发明建立了用于快速检测肉制品中鸭源性成分渗假的锁核酸探针巧光定量 PCR方法。该法提出W样品ct值与阳性对照ct值的绝对差值作为渗假成分阳性判定标准， 解决了生产加工和销售过程中肉污染造成的渗假误判和其他肉类非特异性反应造成的假 阳性。
[0018] 3.本发明为其他动物源性成分的检测探索了新的途径。
【附图说明】
[0019] 图1鸭源性成分锁核酸探针巧光定量PCR特异性试验扩增曲线图 其中图中1为鸭源性成分;2-12为牛、绵羊、山羊、猪、驴、鸡、碟、火鸡、兔、邮源性成分 和阴性对照。
[0020] 图2鸭源性成分锁核酸探针巧光定量PCR检测方法灵敏性扩增曲线图。
[0021] 其中图中：1-7 的 DNA 浓度分别为：164ng、16.4ng、1.64ng、0.164ng、0.0164ng、 0.00164ng、0.000164ng; 8为阴性对照。
[0022] 图3人为渗入鸭源性成分的牛肉丸锁核酸探针巧光定量PCR检测扩增曲线图。
[0023] 其中图中：1为阳性对照，2~4为人工渗入50%，30%和5%鸭肉的牛肉丸，5为纯牛肉 丸，6为阴性对照。
【具体实施方式】
[0024] W下实施例子是对本发明作进一步详述。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0025] 实施例1:特异性实验 检测设备:Li曲tCycler ? 480型巧光定量PCR仪(Roche)，高速