离屯、机(Beckman)，恒溫 干热器(E卵endorf )。
[0026] 检测试剂：核酸提取（离屯、柱法）试剂盒由达安公司提供，Probes Master 2X cone.由Roche公司提供，上、下游引物和锁核酸探针由上海辉眷公司合成标记。具体序列如 下： 上游引物：5 ' -ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3 ' ； 下游引物：5 ' GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3 ' ； Taqman-LNA 探针： 5 '-CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ3-3 ' 样品：牛、绵羊、山羊、猪、驴、鸡、鸭、碟、火鸡、兔、邮肌肉。
[0027] 检测步骤： 1)样品的制备与DNA模板的提取： 取样品化g，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50化于1.5mL离屯、管内，按核酸提取(离 屯、柱法)试剂盒使用说明操作，提取DNA。经紫外分光光度计测定其纯度为1.81~2.11，DNA 浓度为107.38~183.11叫/41^。其中鸭肉0麻含量为164.75叫/41^，00260/00280值为 2.02。
[0028] 2)反应液配制： 将试剂从冰箱取出后，置室溫融化，8000 rpm离屯、lOsec。按下表计算试剂用量，
将上述Probes Master 2Xconc.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入1.5mL离屯、 管中，混匀后，8000巧m离屯、1 Osec。分别加入96孔反应板，1化L/孔。
[0029] 3)加样： 将鸭肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别加入样品反 应孔，ΙμL孔。用反应膜封住反应孔，置于Li曲tCycler? 480型巧光定量PCR仪上检测。
[0030] 4)反应参数设置:95。[8111山95。(：，83,59。(：，253(采集巧光信号），40循环。
[0031] 5)结果判断： (1)质控标准 一一阴性对照:无 Ct值； --阳性对照：ct为14.41，且扩增曲线明显呈对数增长。详见图1 阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
[0032] (2)判定和报告 所有样品均无 Ct值，也无明显扩增曲线，均判定为阴性。报告牛、绵羊、山羊、猪、驴、鸡、 碟、火鸡、兔、邮DNA不含鸭源性成分，即与鸭DNA无交叉反应。
[0033] 实施例2:敏感性试验 用去离子水10倍系列稀释纯鸭肉DNA，直至ΙΟΛ按实施例1进行锁核酸探针巧光定量 PCR检巧U。结果如图2。由此可见其检测低限达1〇-6，即可检测到鸭肉DNA浓度为0.000164ng/ 化，相当于鸭肉含量0.0001%。
[0034] 实施例3:人为渗假样品检测 样品1~3:为分别W50%，30%和5%鸭肉代替牛肉，按牛肉丸生产工艺制作的牛肉丸。
[0035] 样品4:纯牛肉丸。
[0036] 按实施例1进行样品DNA提取和化qman-LNA巧光定量PCR检测。检测结果及结果判 定如下表：
【主权项】
1. 用于肉制品中鸭源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR的引物序列和探针序 列，其特征是所述的引物和锁核酸探针的序列为： 上游引物:5 ' -ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3 ' ； 下游引物:5 ' GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3 ' ； Taqman-LNA 探针： 5 '-CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ3-3 ' 〇2. 用于肉制品中鸭源性成份快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR的方法:其特征在于 包括如下步骤： (1) 设计引物和锁核酸探针的序列： 上游引物:5 ' -ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3 ' ； 下游引物:5 ' GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3 ' ； 锁核酸探针： 5 '-CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ3-3 '； (2) 采用步骤（1)设计的引物和探针建立鸭源性成分的锁核酸探针荧光定量PCR检测 方法;其特征在于：荧光定量PCR检测的反应体系为：20yL，包括10yL Probes Master 2X cone，其中包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等，所述步骤（1)设计的ΙΟμ mol/L上下游引物F/R 各0.8yL，10ymol/L Taqman-LNA 探针P 0.3yL，DNA 模板lyL，超纯水补至20yL;反应参数： 95°C8min; 95°C，8s，58°C，25s，采集荧光信号，35~40循环;其中预变性时间取决于Taq酶； 应用仪器自带分析软件对实验结果进行分析处理，试验设纯鸭肉DNA阳性对照和去离子水 空白对照，阳性对照Ct值< 20，且有典型扩增曲线，空白对照无 Ct值或Ct值>30，且无典型 扩增曲线，则试验有效，可进行结果判定;样品无 Ct值，或Ctcj^SD>30,或ICtcj^SD- CtOT? | > 7,且样品无明显扩增曲线的，判为阴性，报告样品不含鸭源性成分；ICt(揣Ct侧?I <7， 且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性，报告样品中掺有鸭源性成分；let(揣 |>7，Ct(稱》<30,且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为假阳性，报告样品污染鸭源性成 分。
【专利摘要】本发明涉及将锁核酸探针应用于肉制品中鸭源性成分的快速鉴别。建立的锁核酸探针荧光定量PCR方法具有快速、敏感、特异等优点，因采用样品Ct值与纯鸭肉Ct值的绝对差值作为肉制品中鸭肉掺假的判定标准，解决了肉污染引起的掺假误判和非特异性反应引起的假阳性问题。适应于肉制品中鸭源性成分的快速检测。包括引物和锁核酸探针序列的设计。上游引物序列为：5<b>’-</b>ACCTTCCCGCACCCTCTAAT-3<b>’</b>；下游引物序列为：5<b>’</b>GGCAGATGGCGAGCAGAGAT-3<b>’</b>；锁核酸探针序列为：5<b>’-</b>CY5-ATCTCYG+CYTGATGAAACTTCGG-BHQ-3<b>’</b>荧光PCR？检测的反应体系为：20μL，包括10μL？Probes？Master？2×conc？(？包含有dNTP，Mg2+？以及Taq？酶等)，10μmol/L上述上下游引物F/R？各0.8μL，10μmol/上述锁核酸探针P？0.3μL，DNA？模板1μL，超纯水补至20μL。反应参数：95℃8min；95℃，8s，58℃，25s（采集荧光信号），35～40循环。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671035
【申请号】
【发明人】许如苏, 魏霜, 周广彪, 刘中勇, 段建发, 陈冠武, 苏建晖
【申请人】中华人民共和国汕头出入境检验检疫局
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2015年4月29日