简单、灵敏检测核酸外切酶iii活性的探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶活性的检测技术领域，具体设及一种简单、灵敏度检测核酸外切酶 III活性的探针，W及该探针在核酸外切酶ΙΠ 活性检测和抑制剂筛选中的应用。
【背景技术】
[0002] 核酸外切酶III属于DNA水解酶，能够沿双链DNA的3 ' ^5 '方向逐步催化去除单核 巧酸。许多重要的生物过程都与核酸外切酶III的活性有关。例如，保证DNA复制的准确性、 促进基因重组的顺利进行、修复双链DNA的损坏等。同时，核酸外切酶ΙΠ 也被广泛地应用于 信号放大检测技术中，W实现对目标分析物的高灵敏度检测。因此，对核酸外切酶III活性 的检测不仅有助于疾病的诊断治疗及药物的研制开发，而且有利于将核酸外切酶III更好 地应用到生物分析检测中。
[0003] 传统的检测核酸外切酶III活性的方法是基于放射性同位素标记的DNA探针并结 合凝胶电泳的方法。然而，运些检测技术通常是不连续的，成本高，操作繁琐且耗时，还需要 严格的安全措施防止曝光过量。近年来，人们相继报道了利用巧光法检测核酸外切酶ΠΙ的 活性来替代传统的检测方法。例如，Zhao等报道了一种利用双标记分子信标巧光法快速检 测核酸外切酶ΠΙ的活性(Analyst ,2014,139,1081-1087) DMin等基于氧化石墨締和单标记 核酸探针构建了一种巧光生物传感器用于核酸外切酶III的活性检测及抑制剂的筛选 (Analyst ,2012,137,2024-2026) eLeung等提出了一种基于G-四聚体无标记巧光法检测核 酸外切酶III的活性(Methods，2013,64,218-223)。511等设计的分子信标利用3'端富含的0 碱基与相对的5'端标的巧光素相互作用来对核酸外切酶III进行实时检测，检出限为 0.04U/mL(Anal. Chem.，2012，84，5059-5065)。然而上述报道的运些方法都存在一些缺点， 如反应时间过长，需要对核酸探针进行巧光基团W及巧灭基团的双标记或者需要外加巧灭 材料，灵敏度低、选择性差等，大大地增加了实验体系的复杂性W及成本，从而限制了检测 方法的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有检测核酸外切酶ΙΠ 活性的方法存在的 问题，提供一种基于光诱导电子转移巧光法简单、灵敏检测核酸外切酶III活性及的探针， W及该探针在核酸外切酶ΠΙ活性检测和抑制剂筛选中的应用。
[0005] 解决上述技术问题所采用的技术方案是:该探针是从5'端到3'端由3~6个重复的 CG碱基序列构成的DNA，优选从5 '端到3 '端由4个重复的CG碱基序列构成的DNA，且3 '端标记 巧光基团。
[0006] 上述巧光基团为6-簇基巧光素、簇基四甲基罗丹明、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-簇 基巧光素、四氯-6-簇基巧光素、六氯-6-甲基巧光素、德克萨斯红、3H-吗I噪菁染料、7-氨基- 4-甲基香豆素、二乙胺基香豆素、糞并巧光素中的任意一种。
[0007] 本发明探针在检测核酸外切酶ΙΠ 活性中的应用，具体检测方法由下述步骤组成：
[000引 1、将探针溶解于含有5臟ol/L Mgh和5(kmol/L化+的pH值为7.4的化is-HCl缓冲 溶液中，使化is-HCl缓冲溶液中探针的浓度为IxlO-Vol/L，然后将其在90°C保溫10分钟，再 自然降溫至室溫并解育30分钟，得到杂交后的探针。
[0009] 2、用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L化+的抑值为7.4的化is-HCl缓冲溶液将杂交 后的探针稀释至浓度为0.1~lOymol/L，然后加入不同活性的核酸外切酶III，在37°C下解 育10~50分钟，用巧光光谱仪检测不同活性下核酸外切酶ΙΠ 对应的巧光强度，绘制巧光强 度随核酸外切酶ΠI活性变化的标准曲线。
[0010] 3、按照步骤2的方法检测待测样品的巧光强度，结合标准曲线的线性方程即可确 定待测样品中核酸外切酶ΠI的活性。
[0011] 上述步骤2中，优选用化is-HCl缓冲溶液将杂交后的探针稀释至浓度为0.2皿〇1/ L，然后加入不同活性的核酸外切酶III，在37°C下解育40分钟，用巧光光谱仪检测不同活性 下核酸外切酶ΠI对应的巧光强度，绘制巧光强度随核酸外切酶ΠI活性变化的标准曲线。
[0012] 本发明探针在核酸外切酶III抑制剂筛选中的应用，具体检测方法为：向60化浓度 为0.2ymol/L杂交后的探针中加入30化活性为抓/mL核酸外切酶III和30化不同的抑制剂， 在37°C下解育40分钟，其中核酸外切酶ΙΠ 和抑制剂均用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L Na+ 的20mmol/L pH值为7.4的化is-HCl缓冲溶液配制成溶液;然后用巧光光谱仪检测不同抑制 剂对应体系的巧光强度，巧光强度越小，说明抑制剂对核酸外切酶ΠΙ的抑制效果越强。
[0013 ]本发明利用核酸外切酶ΠI能沿双链DNA的3 ' ^5 '方向逐步催化去除单核巧酸，但 是对单链DNA或者单核巧酸不起作用的原理，设计合成了一种结构简单的探针，该探针在缓 冲溶液中能自组装成为双链DNA，G碱基与巧光基团之间发生光电子诱导转移，使巧光被焰 灭，当检测体系中含有核酸外切酶ΠΙ时，核酸外切酶ΙΠ 沿着探针的3 '端作用，使巧光基团 和DNA分离开游离在溶液中，巧光基团的巧光得W恢复，通过检测体系的巧光强度即可实现 核酸外切酶III活性的定量检测。采用本发明探针检测核酸外切酶III活性的方法简单、快 捷、选择性好、灵敏度高，检出限可达到5Xl(T4U/mL。本发明探针还可用于核酸外切酶ΙΠ 抑 制剂的筛选。
【附图说明】
[0014] 图1是不同活性核酸外切酶ΙΠ 对应体系的巧光发射光谱。
[0015] 图2是活性为5 X 10-4~1 X l(TiU/mL的核酸外切酶ΙΠ 对应体系的巧光强度变化曲 线。
[0016] 图3是活性为1 X 1〇-1~抓/血的核酸外切酶ΙΠ 对应体系的巧光强度变化曲线。 [0017]图4是不同浓度金精Ξ簇酸对核酸外切酶III活性的影响。
[0018] 图5是基于光诱导电子转移机理检测核酸外切酶ΙΠ 的原理验证图。
[0019] 图6是杂交后的探针长度对检测体系的影响。
[0020] 图7是杂交后的探针浓度对检测体系的影响。
[0021] 图8是杂交后的探针和核酸外切酶ΙΠ 作用时间对检测体系的影响。
[0022] 图9是杂交后的探针对不同酶的选择性检测结果。
[0023] 图10是杂交后的探针对细胞裂解缓冲液(a)、海拉细胞裂解液(b)、海拉细胞裂解 液与抑制剂ATA( C)的检测结果。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 运些实施例。
[0025] 实施例1
[0026] 本实施例中检测核酸外切酶ΙΠ 活性的探针是碱基序列为5'-CGCGCGCG-3'的DNA， 且3'端用6-簇基巧光素(FAM)标记，由生工生物工程有限公司合成。
[0027] 上述探针在检测核酸外切酶ΙΠ 活性中的应用，检测方法由下述步骤组成：
[0028] l、将探针溶解于含有5mmol/LMg2+和50mmol/LNa+的20mmol/LpH值为7.4的 Tris-HCl缓冲溶液中，使Tris-肥1缓冲溶液中探针的浓度为lxl〇-4mol/L，然后将其在90°C 保溫10分钟，再自然降溫至室溫并解育30分钟，得到杂交后的探针。
[00巧]2、用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L 化+ 的20mmol/L pH值为7.4的Tris-HCl缓冲溶 液将杂交后的探针稀释至浓度为0.2μπιο1/1;向60化浓度为0.2皿ol/L杂交后的探针中分别 加入 60化活性为 5X1〇-4、1X1〇-3、2X1〇-3、5X1〇-3、1X1〇-2、2X1〇-2、5X1〇-2、1X1〇-i、2X l〇-i、5Xl〇-i、l、2、抓/mL核酸外切酶III(购自宝生物工程(大连)有限公司，用含有5mmol/L Mgh和50mmol/L Na+的20mmol/L pH值为7.4的Tris-肥1缓冲溶液配制成溶液），在37°C下解 育40分钟，用化-4600型巧光分光光度计在最大激发波长为490nm、发射波长为518nm处检测 不同活性下核酸外切酶ΠΙ对应的巧光强度(激发狭缝为lOnm，发射狭缝为lOnm)，结果见图 1，并绘制巧光强度随核酸外切酶ΠΙ活性变化的标准曲线，结果见图2~3。
[0030] 如图1所示，随着核酸外切酶III的活性逐渐增大，体系的巧光强度逐渐增强；由图 2~柯见，牺X 1〇-4~5U/mL活性范围内，体系的巧光强度与核酸外切酶III的活性呈线性 关系，其中核酸外切酶III活性为5X 10-4~1 X l(TiU/mL时，巧光强度与核酸外切酶III活性 变化的线性方程为F = 76.76+6322.75C，核酸外切酶ΠI活性为1 X 1〇-1~抓/mL时，巧光强度 与核酸外切酶III活性变化的线性方程为F = 694.16巧9.75C，式中F为体系的巧光强度，C为 核酸外切