专利名称：基于核酸外切酶Ⅰ保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法
技术领域：
本发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法，包括末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白质相互作用及其核酸外切酶I保护分析和基于标记有有机小分子寡核苷酸DNA链修饰的Au纳米颗粒进行保护的比色检测方法。
背景技术：
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用法的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片段免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术需要复杂的操作，精密的仪器，成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于核酸外切酶1保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法，此方法对DNA序列没有依赖性，操作简单，只需要把标记有机小分子的DNA链通过Au-S键相互作用修饰到Au纳米颗粒上，核酸外切酶I作用后Au纳米颗粒在不同程度上发生团聚，使溶液的颜色和紫外吸光度都会有很大变化，通过此方法可检测小分子和结合蛋白相互作用、也可以检测结合蛋白，或通过竞争反应检测小分子；该方法操作简单、快速、灵敏，可直接目视进行定性分析。
本发明的技术方案是，所述基于核酸外切酶I保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法包括 (l)Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析； (2)Au纳米颗粒上修饰的标记有机小分子的寡核苷酸DNA单链在保护分析过程中
进行定性分析和定量检测。 以下对本发明做出进一步说明。 本发明中，所述Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析为 对于有机小分子与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析，检测步骤是取所述用有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链标记的Au纳米颗粒的储备液置于微量管中；在微量管中加入包含有小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入核酸外切酶I反应，得末端保护后的Au纳米颗粒的溶液； 对于有机小分子的检测以及核酸外切酶I的保护分析，采用竞争反应检测步骤是取所述用有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链标记的Au纳米颗粒的储备液置于微量管中；再加包含有待测小分子的样品溶液，均匀混合后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护后的Au纳米颗粒的溶液； Au纳米颗粒上修饰的标记有机小分子的寡核苷酸DNA单链在保护分析过程中进 行定性分析和定量检测；定性分析为采用直接目视观察颜色的改变，定量检测为采用标准 的紫外分光光度计对保护前后纳米金的紫外吸收进行检测。 本发明中，所述单链寡核苷酸DNA末端有机小分子的修饰是通过现有的交联反应 技术实现。对于带有羧基的有机小分子，可以采用l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚 胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与3'端NH2标记的寡核苷酸DNA单链进行交联；交联反应产 物可用透析纯化。 本发明中，所述的有机小分子修饰的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒通过文 献成熟的标记方法实现。修饰有小分子的单链寡核苷酸DNA链的另一端修饰有-SH官能团， 通过Au-S键相互作用实现Au纳米颗粒的修饰。通过离心去除未标记的DNA链，离心后的 金纳米颗粒悬浮于Exol标准缓冲溶液(67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) ， 5mM MgCL2)备用。
进一步地，在本发明中，所述Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA 单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析采用以下步骤实现
a.对于有机小分子与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析，检测 步骤是取5 L修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒的储备液于微量 管中，加入10iiL 5XExo1标准缓冲溶液，该缓冲溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) ， 5mM MgCL2 ;再加入5 ii L包含待测小分子结合蛋白的溶液和30 ii L的灭菌水，37。C反应30min，然 后加入0. 5ii L的核酸外切酶I，置于37t:反应5min，得到核酸外切酶I处理后的纳米金溶 液a。 b.对于有机小分子的检测以及核酸外切酶I的保护分析，采用竞争反应检测步骤 是取5 i！ L所述的修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA链标记的金纳米颗粒的储备液于 微量管中，加入10iiL 5XExo1标准缓冲溶液，该溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) ， 5mM MgCL2 ;再加入5 L包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合 蛋白或(鼠源)单克隆抗体3iiL，小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体终当量浓度为 加入的有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链浓度的5倍；在37t:恒温反应0. 5小时；然后加 入0. 5 L核酸外切酶I，置于37t:反应5分钟，得核酸外切酶处理后的纳米金溶液b。
注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改 变比例或试剂加入顺序可使有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链的保护效率在3% 100% 内变化。 本发明中，所述的末端保护单链寡核酸DNA标记的金纳米颗粒可采用的检测方 法 (1)通过肉眼观察酶切处理后的溶液a或b颜色从红到紫到兰的差异。
(2)吸收广度法检测直接检测酶切处理后的溶液a或b纳米金最大吸收处紫外
光吸光度的变化值。 本发明建立的基于核酸外切酶I端点保护分析检测有机小分子与结合蛋白相互 作用的生物传感技术，利用小分子修饰的单链寡核苷酸DNA链修饰的纳米金在核酸外切酶 I作用下，没有被保护的DNA链被核酸外切酶I降解，从而使纳米金团聚变色，但是被修饰的 小分子和结合蛋白相互作用后，被保护的DNA链仍能使纳米金分散在溶液中，呈现酒红色。因此，该技术可直接用于小分子结合蛋白的检测，也可通过样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA单链竞争与抗体结合间接检测有机小分子。它灵敏度高，操作快速简便，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个通用技术平台。
具体实施例方式实施例1 :基于核酸外切酶末端保护分析所介导的纳米金变色检测赭曲霉素A
1) 3'端NH2标记的寡核苷酸DNA链和赭曲霉素A的交联 称取9. 3mg的赭曲霉素A溶于2. 5mL磷酸盐缓冲溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)，再加入lmg的1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)_碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2. 8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260 y 1活化后的赭曲霉素A溶液加入到260 ii 1浓度为10 ii M的3'端NH2标记5'端SH或Dual SH标记的单链寡核苷酸DNA (序列
列是任意的))的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7. 4，在轻微搅拌下室温反应2小时。
把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)中在4t:透析12小时，每隔3小时更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分管保存于-20°C的冰箱中备用。 2)赭曲霉素A修饰的单链寡核苷酸DNA标记金纳米颗粒 取上述赭曲霉素A标记的寡核苷酸DNA单链储备液(1 P M) lmL加入到离心后纳米金中，室温老化24h ;随后加入0. 1M磷酸缓冲溶液(KH2P04， Na2HP04 pH 7. 0)和10mM磷酸盐缓冲溶液(10mM KH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最终的磷酸缓冲溶液的浓度为lOmM， NaCl的浓度为0. 1M，室温老化48h ;最后再加lOmM磷酸盐缓冲溶液(10mMKH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最终NaCL的浓度为0. 3M ;通过在15000转速离心去除没有标记上的DNA，离心之后的金纳米颗粒复溶于200 ii 1 Exol缓冲溶液中(67mMGlycine-KOH(pH 9. 5) 5mM MgCL2) 4。C保存备用。
3)赭曲霉素A的检测 取5yL所述的修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒的储备液于微量管中，加入10iiL 5XExo1标准缓冲溶液，该溶液为67mM Glycine-KOH(pH9. 5)5mMMgCL2，再加入5 y 1待检测的赭曲霉素A样品溶液，混合均匀后加入3 y 1浓度为1 P L的赭曲霉素A鼠源单克隆抗体，再加入27 L灭菌水，室温反应15分钟，反应后加入0. 5 ill核酸外切酶I (NEB公司)在37t:酶切30分钟；反应后的终产物直接加入到50 y 1的紫外比色杯中进行紫外分光光度检测在其最大吸收值的吸光度变化。
按上述1) 、2)和3)步骤对7个配制的赭曲霉素A标准溶液(浓度从lnM到200nM，共做7个不同的浓度)进行检测，记录各标准溶液样品最大吸收值的吸光度变化。用紫外吸光度变化值对标准溶液中赭曲霉素A浓度作图获得标准曲线。 实施例2 :基于核酸外切酶末端保护分析所介导的纳米金变色检测叶酸结合蛋白
1) 3'端NH2标记的寡核苷酸DNA链和叶酸的交联 称取10mg的叶酸溶于2. 5mL磷酸盐缓冲溶液(0. 1M KH2P04和Na2HP04， pH 7. 4)，再加入lmg的1-乙基_3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15分钟，再加入2. 8mg琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30分钟；取260 y 1活化后的叶酸溶液加入到 260 ii 1浓度为1 ii M的3'端NH2标记5'端SH或Dual SH标记的单链寡核苷酸DNA (序列
是任意的))的溶液中，用1M的NaOH调其pH为7. 4，在轻微搅拌下室温反应2小时。
把交联反应产物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放 入500ml磷酸盐缓冲溶液(00. 1M KH2P04和Na2HP04，pH 7. 4)中在4"透析12小时，每隔3 小时更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA链分保存于-2(TC 的冰箱中备用。 2)叶酸修饰的单链寡核苷酸DNA标记纳米金颗粒 取上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链储备液(1 y M) lmL加入到离心后纳米金中， 室温老化24h ;随后加入0. IM磷酸缓冲溶液(KH2P04，Na2HP04 pH 7. 0)和lOmM磷酸盐缓冲 溶液(10mM KH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最终的磷酸缓冲溶液的浓度为lOmM， NaCl的浓度为0. 1M，室温老化48h ;最后再加lOmM磷酸盐缓冲溶液(10mMKH2P04， Na2HP04 pH 7. 0和2M NaCL)，使最终NaCL的浓度为0. 3M ;通过在15000转速离心去除没有标记上 的DNA，离心之后的纳米金复溶于200ii1 Exol缓冲溶液中(67mMGlycine-K0H(pH 9. 5) 5mM MgCL》4t:保存备用。
3)叶酸结合蛋白的检测 取5yL所述的修饰有机小分子的单链寡核苷酸DNA标记的金纳米颗粒的储 备液于微量管中，加入10iiL 5XExo1标准缓冲溶液，该溶液为67mM Glycine-KOH(pH 9. 5) 5mMMgCL2，再加入5 y 1待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，再加入30 y L灭菌水，室温反 应15分钟，反应后加入0. 5 iil核酸外切酶I (NEB公司)在37t:酶切30分钟；反应后的终 产物直接加入到50 iU的紫外比色杯中进行紫外分光光度检测在其最大吸收值的吸光度 变化。 按上述1)、2)和3)步骤对7个配制的叶酸结合蛋白标准溶液(浓度从lnM到 200nM)进行检测，记录各标准溶液样品的最大吸收值的吸光度变化值做叶酸结合蛋白的浓 度和荧光强度的标准曲线，未知样品中叶酸结合蛋白所产生的紫外吸光度的变化和标准的 曲线对照确定其浓度。
权利要求
一种基于核酸外切酶I保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法，其特征是，该方法包括(1)Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析；(2)Au纳米颗粒上修饰的标记有机小分子的寡核苷酸DNA单链在保护分析过程中进行定性分析和定量检测。
2. 根据权利要求1所述基于核酸外切酶I保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法，其特征是，Au纳米颗粒上末端有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白质的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析采用以下步骤实现对于有机小分子与结合蛋白的相互作用以及核酸外切酶I的保护分析，检测步骤是取所述用有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链标记的Au纳米颗粒的储备液置于微量管中；在微量管中加入包含有小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入核酸外切酶I反应，得末端保护后的Au纳米颗粒的溶液；对于有机小分子的检测以及核酸外切酶I的保护分析，采用竞争反应检测步骤是取所述用有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链标记的Au纳米颗粒的储备液置于微量管中；再加包含有待测小分子的样品溶液，均匀混合后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入核酸外切酶I，得末端保护后的Au纳米颗粒的溶液；
3. 根据权利要求1所述基于核酸外切酶I保护分析检测有机小分子和蛋白质相互作用的可视传感方法，其特征是，所述定性分析采用直接目视观察颜色的改变，定量检测为采用标准的紫外分光光度计对保护前后纳米金的紫外吸收进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种于核酸外切酶I保护分析所介导的纳米金变色检测小分子和结合蛋白相互作用的可视比色传感方法，它包括纳米金上标记的修饰有机小分的单链寡核苷酸DNA链与蛋白质相互作用及核酸外切酶I保护分析和基于末端保护的单链寡核苷酸DNA介导的纳米金变色对DNA链进行的比色检测。本发明利用标记在金纳米颗粒上的寡核苷酸DNA链3’末端修饰的小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基于核酸外切酶I末端保护作用，通过被保护的寡核苷酸DNA链使金纳米颗粒在盐溶液中稳定存在进行小分子与蛋白相互作用以及小分子或其结合蛋白的检测。该方法操作简便、经济快速、灵敏、特异性强，可望成为食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选等的通用技术。
文档编号C12Q1/68GK101717823SQ20091022702
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者俞汝勤, 吴战, 楚霞, 沈国励, 蒋健晖 申请人:湖南大学