一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全技术和分析化学技术领域，涉及一种基于核酸外切酶及信号 放大功能确定样品中汞离子浓度的方法。
【背景技术】
[0002] 汞离子是一种在环境中普遍存在的污染物，其毒性非常大，不易被降解，并能通过 甲基化作用转化成有机汞，并通过食物链产生富集效果，最终导致在人体内积累，对人类的 健康和生命造成严重的威胁，例如：对DNA的破坏，对肾和肝脏的破坏，对大脑以及引起中 枢神经的破坏、使心肌梗死的危险增大等。汞离子的长时间沉积会造成土壤和水域环境的 不可逆性污染，水溶性汞离子是其中最常见也是最稳当的汞污染物。因此，对于检测水溶性 汞离子进行检测与监控十分必要，相关的技术的开发随之而来。
[0003]目前对汞离子的检测主要以仪器检测方法为主，如原子吸收光谱法、质谱法等，这 些方法往往还需要大量的预处理，增加了很多成本，而且对操作人员有很高的技术要求。近 年来核酸适体得到了广泛的研究与应用。利用核酸适体高特异性结合目标物的特性发展的 生物传感器对代谢物、DNA、蛋白质等物质进行临床疾病的快速、准确的检测与监控，是分析 化学中非常热门的研究课题之一。
[0004] 研究人员发现，二价的金属汞离子能够与核酸中的两个胸腺嘧啶碱基（T)形成非 常稳定的T-Hg2+-T配合物结构。基于此特异性作用，研究者已经构建了一系列对汞离子检 测的生物传感器，这类传感器具有选择性好，特异性好的优点。在以往的研究中，借助此特 异性作用而建立的比色方法也得到了很多的研究，但其依赖于对核酸的标记，而且信号容 易受到环境的影响。以免标记配子建立的检测方法具有操作简便，节约成本的特点，其已经 得到研究者的普遍关注。虽然此类非标记检测方法具有高的灵敏度与特异性，为了进一步 提高其检测限，人们研究了一些以酶，磁纳米粒子，靶物质诱导的变构组装等辅助信号放大 系统以分析目标物。
[0005] 为满足免标记、简单、快速分析检测低浓度汞离子的要求，基于核酸适体对汞离子 的强亲合力和高识别性（T-Hg2+-T),借助外切酶III的循环信号放大系统，我们开发了一种操 作简单、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中汞离子的含量，极大地提高了汞 离子的检测限。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品中汞离子浓 度的方法，实现水中汞离子的高灵敏度、高选择性检测。
[0007] 本发明通过以下技术方案来实现：一种基于核酸外切酶及信号放大功能确定样品 中汞离子浓度的方法，包括： (I)DNA片段Pl和P2的前半段通过碱基互补配对结合成P1-P2复合体； (2) 能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段P和P2的后半段在待测样品中 汞离子的作用下，通过形成T-Hg2+-T结构相结合； (3) 核酸外切酶III从P2的5'端开始逐个剪切P2上的碱基，从而释放出Pl和汞离 子； (4) Pl和血红素结合后催化ABTS盐与双氧水反应； (5) 通过检测体系中的吸光值确定汞离子的浓度。
[0008] 进一步的，所述的DNA片段P、Pl和P2的序列分别具有如SEQIDNO:1、SEQID NO:2和SEQIDNO:3所不的核昔酸序列。由此，可以进一步提尚利用本发明方法进彳丁萊尚 子浓度检测的效率和灵敏度。
[0009] 进一步的，所述的DNA片段Pl的浓度为0.5iiM。由此，可以进一步提高利用本发 明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0010] 进一步的，所述的核酸外切酶III的用量为100U。由此，可以进一步提高利用本发 明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0011] 进一步的，所述的汞离子的浓度为0-1000nM。由此，可以进一步提高利用本发明方 法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0012] 进一步的，所述的汞离子的浓度为l_500nM。由此，可以进一步提高利用本发明方 法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0013] 进一步的，基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度： Y=O. 111+0. 0016X, Y为不同汞离子浓度下吸收值A421,X为相应汞离子的浓度。由此，可以进一步提高利用 本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0014] 本发明的作用机理为： (I)P1为可以形成四联体的DNA片段，其能与血红素结合形成具有催化ABTS盐与双氧 水反应的催化剂，不同量的催化剂所导致的体系光信号的变化不同； (2) Pl能与P2的前半段由于碱基互补配对相结合形成P1-P2复合体，并在3'端多出 几个碱基，使得Pl与P2的结合体不能被外切酶III剪切，因为核酸外切酶III只能作用于双链 DNA的无悬挂3'端，对互补链的5'端形成剪切作用，将互补链剪切成单个碱基。当DNA的 3'端有多余的碱基时，则外切酶III不能对双链DNA形成剪切作用。由于此时体系中无自由 状态Pl与血红素形成四联体催化剂，不能启动反应； (3) 在没有汞离子存在下，P不能与P2的后半段相结合。当有汞离子存在时，由于少有 的几个碱基互补配对作用，和汞离子的T-Hg2+-T作用，使得P与P2的后半段相结合，这种结 合使得外切酶III能够从P2的5'端开始逐个剪切P2上的碱基，从而释放出Pl和汞离子。 释放出的汞离子可以循环参与到体系中的反应，使P继续与溶液中的P1-P2复合体反应，进 一步产生Pl。释放出的Pl与体系中的血红素形成催化剂，催化ABTS盐与双氧水反应，引起 体系光信号的改变，通过检测体系中的吸光值即可进行定量。
[0015] 根据本发明的实施例，确定所述样品中的汞离子浓度是通过将所述体系的吸光 值、与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知汞离子浓度分别为Ong/ mL、Ing/mL、10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1000ng/mL的标准样品进行 平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和 灵敏度。
[0016] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0017] 图1是汞离子检测标准图谱； 图2是汞离子检测标准曲线； 图3是特异性检测图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本 发明的限制： 实施例1设计与合成相应的寡核苷酸片段 通过查阅相关文献，结合核酸外切酶III循环信号放大系统的构建需要，设计能够通过T-Hg2+-T反应对汞离子特异性识别的DNA片段，以及参与循环系统所需的DNA片段。序列 通过DNA合成仪制备。
[0019] P: CAT TCC TCT CTC GCG (SEQ ID NO :1) P