一种基于核酸外切酶Ⅲ的汞离子检测新方法
【技术领域】
[0001] 发明属于分析化学技术领域和食品安全技术领域，涉及一种基于核酸外切酶III的 汞离子检测新方法。
【背景技术】
[0002] 汞主要以无机汞和有机汞等形态存在于自然界中，无机汞在自然界中会通过甲基 化的作用转化为有机汞。不同状态的汞对人体的危害不同，其中有机汞对人的身体危害最 大。汞会通过食物链富集的作用在人体内积累，给人类身体健康带来危害。例如：严重损害 人体的大脑和神经系统，给免疫系统、消化系统、肾和肺等器官功能造成严重影响等，因此 开发一种简单快速检测汞离子的新方法仍然是十分必要的。
[0003] 汞离子的浓度测定传统方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、 分光光度法、伏安法等。这些传统方法虽然各具优点，但是在实际应用中仍是有许多局限 性，如仪器设备昂贵、预处理复杂、还需要熟练的技工等。
[0004] 自关于T-Hg2+-T特异型结构被报道以来，一些科研工作者开始关注T-Hg2+-T这样 的特异型结构，T-Hg 2+-T特异性结合作用力要大于"A" "T"碱基互补配对作用力，并报道了 一些利用T-Hg2+-T特异型结构新型汞离子传感器这类传感器具有选择性好，特异性好的优 点，成为最近人民研宄的热点。
[0005] 核酸外切酶III能够作用于3'端闭合的双链DNA，并沿着3' 一 5'的方向逐步切 去单核苷酸。核酸外切酶III的这个性质已经被应用于核酸分子和有机小分子的检测。在 本发明中，我们设计了一种基于核酸外切酶III的荧光分析法超灵敏检测汞离子的新方法。 基于T-T碱基错配两个DNA片段形成3'端闭合的双链DNA，利用核酸外切酶III能够作用 于3'端闭合的双链DNA，并沿着3' 一5'的方向逐步切去单核苷酸的性质，结合实时荧光定 量PCR的荧光放大效应，建立了一种检测水溶液中汞离子的新方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，实现水中汞离 子的简单、快速、高灵敏检测。
[0007] 本发明通过以下技术方案来实现：一种基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法， 包括： (1) 将两段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段与待测样品混合，两段 DNA片段在待测样品中的Hg2+作用下结合成3'端闭合的双链DNA ; (2) 核酸外切酶III酶切双链DNA ; (3) 对剩余的没有被酶切的DNA片段进行荧光定量PCR扩增； (4) 根据焚光检测结果确定Hg2+浓度。
[0008] 进一步的，所述的两段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段的序列 具有如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高利用本发 明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0009] 进一步的，所述的荧光定量PCR扩增的引物序列具有如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效 率和灵敏度。
[0010] 进一步的，所述的汞离子的浓度为2-200nM。由此，可以进一步提高利用本发明方 法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0011] 进一步的，所述的汞离子的浓度为5-100nM。由此，可以进一步提高利用本发明方 法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0012] 进一步的，基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度： y=l. 03χ+4· 66， y为不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，χ为相应汞离子的浓度。由此，可以进一步 提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0013] 根据本发明的实施例，确定所述样品中的汞离子浓度是通过将所述体系的荧光检 测结果与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知汞离子浓度分别为2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、50 nM、100 nM、200 nM的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可 以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
[0014] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0015] 图1添加不同浓度的汞离子，并做实时荧光定量PCR，得到其扩增曲线(汞离子浓 度分别取 2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、50 nM、100 nM)。
[0016] 图2汞离子检测的标准曲线。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的 限制： 实施例1设计与合成相应的寡核苷酸片段 通过查阅相关文献，设计两段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段，根据 此序列来设计实时荧光定量PCR用的上下游引物。序列通过DNA合成仪制备。
[0018] 模版 DNA :5' - AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTT AGCGCCTTACTTGTTTGTTG-3' （SEQ ID N0:1) 互补 DNA :5' - CTTCTTTCTTGTAAGGCGCTAAGAAACATCGCCACGGG GAAGGCGTACTCGCG -3' （SEQ ID N0:2) 上游引物：5' -AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3'（SEQ ID NO :3) 下游引物：5' -GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3，（SEQ ID NO :4) 实施例2 T-Hg2+-T杂交反应 首先PCR管加入模板DNA和互补DNA的混合液，随后依次加入适量的Hg2+离子标准溶 液使其最终浓度分别为2、5、10、20、50、100、200 11]\1，反应30 1^11后。模板0嫩和互补0嫩 通过T-Hg2+-T特异性结构形成3'端闭合的双链DNA。
[0019] 实施例3核酸外切酶III的酶催化及标准曲线的建立 依次向上述PCR管中加入核酸外切酶III 0.1 μL，反应90 S，随之整个体系在恒温金属 浴中98°C反应10 min，让核酸外切酶III失活，结束核酸外切酶III对模板DNA的剪切。随后 加入适量的PCR混合液，上、下游引物后在CFX96?实时荧光定量PCR中完成实验。由于加 入的Hg 2+离子浓度不同，导致了不同数量的模板DNA被核酸外切酶III剪掉，用于PCR扩增的 模板DNA的浓度也随之不同，故而得到不同的扩增曲线（图1)。汞离子标准曲线的建立：利 用实时荧光定量PCR仪测定不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，根据测定的不同汞离子 浓度下扩增曲线的循环数，绘制汞离子浓度的标准曲线（图2)，本传感器的线性范围5-100 nM，检测限为3 nM。标准曲线的线性方程为y=1.03x+4.66，y为不同汞离子浓度下扩增曲 线的循环数，X为相应汞离子的浓度，线性相关性>〇. 99。
[0020] 实施例4汞离子的特异性测定 步骤同（2)，依次向模板DNA和互补DNA的混合液中加入Hg2+、Cu2+、Cd2+、Pb 2+、Ni2+、Fe2+ 标准液，使其最终浓度均为100 nM，在37° C反应30分钟。随后按照步骤（3)完成实验。 由实验结果得知这种基于PCR技术的汞离子检测新技术具有很高的特异性。
[0021] 实施例5实际添加样品的测定 向自来水样品中分别添加适量的汞离子标准液，使其最终浓度分别为5、10、20、50 nM， 采用基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法测定实际样本中的汞离子的回收率，结果表明 其回收率在96. 50%-104. 00%之间，标准差小于5. 06%，能够完全满足现实生活中对汞离子 的检测需求。结果如表1 : 表1.自来水样品添加汞离子的测定
【主权项】
1. 一种基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，其特征在于，包括： (1) 将两段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段与待测样品混合，两段 DNA片段在待测样品中的Hg2+作用下结合成3'端闭合的双链DNA ; (2) 核酸外切酶III酶切双链DNA ; (3) 对剩余的没有被酶切的DNA片段进行荧光定量PCR扩增； (4) 根据焚光检测结果确定Hg2+浓度。2. 根据权利要求1所述的基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，其特征在于：所述 的两段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段的序列具有如SEQ ID NO :1和 SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求1所述的基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，其特征在于：所述 的荧光定量PCR扩增的引物序列具有如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。4. 根据权利要求1所述的基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，其特征在于：所述 的汞离子的浓度为2-200nM。5. 根据权利要求4所述的基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，其特征在于：所述 的采离子的浓度为5-100nM。6. 根据权利要求1所述的基于核酸外切酶III的汞离子检测新方法，其特征在于：基于 下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度： y=l. 03x+4. 66， y为不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，x为相应汞离子的浓度。
【专利摘要】本发明涉及一种基于核酸外切酶Ⅲ的汞离子检测新方法，包括（1）将两段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段与待测样品混合，两段DNA片段在待测样品中的Hg2+作用下结合成3'端闭合的双链DNA；（2）核酸外切酶III酶切双链DNA；（3）对剩余的没有被酶切的DNA片段进行荧光定量PCR扩增；（4）根据荧光检测结果确定Hg2+浓度。本发明设计了一张汞离子生物传感器，用以实现水中汞离子的简单、快速、高灵敏检测。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104946770
【申请号】CN201510382389
【发明人】朱颖越, 邓大庆, 朱敏, 李海霞, 蔡义林, 袁爱梦, 王立梅, 齐斌
【申请人】常熟理工学院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月2日